CN114544614B - 一种重金属Fe3+和Cr6+的快速检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺的快速检测试剂盒及其应用方法，包括：（1）单原子铈（Single atom Ce‑N‑C,SACe‑N‑C）纳米酶类氧化酶（Oxidase‑like,OXD‑like）活性的验证和评估，（2）快速检测试剂盒检测体系的构建。本发明利用Fe³⁺和Cr⁶⁺均能显著促进单原子铈纳米酶氧化还原体系中Ce⁴⁺与Ce³⁺的电子转移速度，分别使单原子铈纳米酶在30s和60 s内催化氧化底物变色，用于实现在同一体系中Fe³⁺和Cr⁶⁺的快速、高效的检测。

Description

一种重金属Fe3+和Cr6+的快速检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，尤其涉及一种对重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺的快速检测试剂盒及其应用。

背景技术

在生产生活中，由于工、农行业的不断发展以及废水和生活污水中重金属离子的不当排放，增加了水资源、土地资源等受污染的风险。并且重金属是不能进行生物降解，如果直接将其排放到河流或土壤中，不仅会严重污染环境，而且还会通过生物链的富集作用，最终进入人体中危害人体健康[1]。铁是生命中最重要的微量元素之一，过量摄入Fe³⁺，由于铁的不溶性和羟基自由基的形成将导致严重的疾病[2]，如癌症、器官功能障碍、器官衰竭、组织损伤甚至死亡[3, 4]。铬主要以Cr³⁺和Cr⁶⁺两种氧化状态存在于环境中，具有不同的化学性质和毒性。Cr⁶⁺的毒性大，迁移率高，危害水质[5]，因此，加强对Fe³⁺和Cr⁶⁺的检测十分必要。传统的检测方法有原子吸收光谱法（AAS）[6, 7]、X射线荧光光谱法（XRF）[8]、原子发射光谱法（AES）[9]、原子荧光光谱法（XFS）[10]和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）[11,12]。虽然对重金属离子具有很高的灵敏度和特异性，但整个检测过程都需要昂贵的仪器设备、专业的技术人员、复杂的实验操作技术[13, 14]。因此，开发设计实时、快速、高效的检测方法是未来食品安全快速检测的发展方向。

单原子纳米酶因其金属原子以分散的单原子形式分布于材料中，且金属原子之间没有明显的相互作用，这样的结构极大地提高了原子利用率和活性中心密度，从而使得单原子纳米酶表现出比传统纳米酶高10-100倍的催化活性[15]。同时单原子纳米酶具有精确设计的配位结构，能够模拟出天然酶的催化活性中心，因此被认为是理想的一种新型纳米酶被应用于各个领域中。相关研究发现重金属离子可通过金属-金属相互作用（如亲氧相互作用）、表面配体、与含硫或含氧单原子纳米酶的化学键合、静电相互作用和络合物形成等方式与金属纳米酶相互作用改变单原子纳米酶的催化活性，实现对重金属离子的快速、高效检测。

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发明内容

本发明的目的是基于Fe³⁺和Cr⁶⁺对单原子铈纳米酶类氧化酶活性增强的程度差异研发一种在同一体系中Fe³⁺和Cr⁶⁺的检测方法。

本发明提供了一种重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺的快速检测方法，包括：单原子铈纳米酶溶液、底物试剂、缓冲液以及待测样品；

所述单原子铈纳米酶是具有类氧化酶活性的纳米酶，对重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺具有特异性；

所述单原子铈纳米酶溶液其溶剂为乙醇和5% Nafion溶液组成的混合溶剂；

所述底物是指能够在氧化酶作用下会生成颜色变化的物质；

所述缓冲液是酸性的醋酸盐缓冲液。

进一步的，重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺的快速检测方法包括（50-150）：1体积分数的乙醇：5%Nafion溶液溶解的单原子铈纳米酶0.08-0.12μM、二甲基亚砜溶解的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）1-5 mM， pH为2.0-4.0的醋酸盐缓冲液以及待测样品。

所述TMB会在单原子铈纳米酶的类氧化酶作用下生成蓝色氧化产物TMB_ox，在652nm处产生特征吸收峰。

本发明中Fe³⁺和Cr⁶⁺能分别加速单原子铈纳米酶类氧化酶活性完成对TMB的氧化，基于时间差异实现在同一体系中Fe³⁺和Cr⁶⁺的检测。

优选的，重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺的快速检测体系为99：1体积分数的乙醇：5% Nafion溶液溶解0.08-0.12μM的单原子铈纳米酶、二甲基亚砜溶解的TMB为2mM，pH为3.6的醋酸盐缓冲液以及待测样品。

另一方面，本申请开发一种重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺的快速检测试剂盒，试剂盒中利用上述的检测方法及单原子铈纳米酶。

另一方面，本发明提供一种重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺的快速检测方法的应用。应用包括重金属污染物检测，食品安全检测等。所述食品包括小麦、桃、玫瑰花茶、红茶、芹菜、菠菜、油炸鸡肉、冷冻鸡肉等的检测。

另一方面，本发明提供一种重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺的快速检测试剂盒的应用。应用包括重金属污染物检测，食品安全检测等。所述食品包括小麦、桃、玫瑰花茶、红茶、芹菜、菠菜、油炸鸡肉、冷冻鸡肉等的检测。

其他方面，本发明提供了一种重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺的快速检测试剂盒及其应用，包括：（1）单原子铈纳米酶类氧化酶活性的验证和评估，（2）快速检测试剂盒检测体系的构建。

一方面，本发明提供上述单原子铈纳米酶类氧化酶活性的验证和评估，包括：氧化底物分子特征吸收峰、类氧化酶最佳反应条件和拟合参数大小；

所述氧化底物分子特征吸收峰是指氧化底物TMB被单原子纳米酶氧化后再652nm处产生的特征吸收峰；

所述类氧化酶最佳反应条件，反应pH2.0-4.0、反应温度20-40℃、反应时间10-15min和单原子铈纳米酶溶液浓度0.1-0.16μM；

所述拟合参数为：最大反应速率（v _max）为1.14×10^-8M s^-1、米氏常数（K _m）为0.20mM和酶活力（SA）为7.72 U/mg；

类氧化酶活性验证和评估过程为：在96孔板中加入170μL的pH3.6的醋酸盐缓冲液，再加入20μL的TMB溶液，最后再加入10μL的单原子铈纳米酶溶液，混合均匀后在10 min内观察溶液颜色是否变为蓝色，且通过酶标仪在652nm处检测是否有特征吸收峰。若溶液颜色变为蓝色，且在652nm处有特征吸收峰，即说明单原子铈纳米酶具有类氧化酶活性，反之则无。

在上述同样的体系中，测试其酶活力SA以及酶动力学参数v _max和K _m以此来评价单原子铈纳米酶类氧化酶活性的大小。

另一方面，本发明提供上述快速检测试剂盒体系的检测条件：

本发明快速检测试剂盒的检测分析原理：利用单原子铈纳米酶具有类氧化酶活性，能在15 min内催化氧化底物TMB显蓝。然而Fe³⁺和Cr⁶⁺均能显著促进单原子铈纳米酶表面氧化还原体系中Ce⁴⁺与Ce³⁺的电子转移加速TMB的氧化，缩短催化氧化时间。且单原子铈纳米酶对Fe³⁺的亲和力高于Cr⁶⁺，两者分别能使单原子铈纳米酶在30s和60s内催化TMB变为蓝色。通过时间分辨观察体系的颜色变化及652nm处的吸光度，实现对食品基质中Fe³⁺和Cr^{6 +}的检测（图1）。

具体检测过程为：分别将小麦、桃、玫瑰花茶、红茶、芹菜、菠菜、油炸鸡肉、冷冻鸡肉作为实际样品进行分析检测。将上述实际样品均匀称取约0.5 g，加入5.0 mL浓硝酸，1mL的30% H₂O₂进行微波消解20 min后加水稀释定容至50.0 mL，得到待测样液进行检测（图1）。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明基于Fe³⁺和Cr⁶⁺对增强单原子铈纳米酶类氧化酶活性的差异研发的快速检测试剂盒具有以下优点：

（1）能在30 s及60 s内分别实现对Fe³⁺和Cr⁶⁺的检测，大大缩短了检测时间。

（2）操作简易，不需要专业人员及大型仪器设备。

附图说明

图1为Fe³⁺和Cr⁶⁺检测原理及操作流程。

图2为单原子铈纳米酶类氧化酶活性验证。图A为单原子铈纳米酶类氧化酶活性化学式及原子图；图B为单原子铈纳米酶类氧化酶活性验证的吸收光谱。

图3为单原子铈纳米酶对底物的亲和力。图A为Fe³⁺米氏方程；图B为Fe³⁺双倒数图；图C为Cr⁶⁺米氏方程；图D为Cr⁶⁺双倒数图；图E为H₂O₂米氏方程；图F为H₂O₂双倒数图。

图4为单原子铈纳米酶类氧化酶活性优化。图A为反应pH对类氧化酶活性的影响；图B为反应温度对类氧化酶活性的影响；图C为反应时间对类氧化酶活性的影响；图D为单原子铈纳米酶溶液浓度对类氧化酶活性的影响；图E为2M H₂SO₄和2M NaOH条件下对类氧化酶活性的影响；图F为保存时间对类氧化酶活性的影响。

图5为单原子铈纳米酶类氧化酶活性拟合参数；图A为米氏方程及双倒数图；图B为酶活力SA线性拟合图。

图6为快速检测试剂盒体系优化；图A为Fe³⁺与Cr⁶⁺对TMB的催化氧化影响；图B为反应pH；图C为单原子铈纳米酶溶液浓度；图D为底物TMB浓度。

图7为灵敏度分析。图A为Fe³⁺检测的灵敏度实物检测图；图B为Cr⁶⁺检测的灵敏度实物检测图。

图8为特异性分析。

图9为加标样品检测应用。图A为检测实物图；图B为Fe³⁺检测结果；图C为Cr⁶⁺检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1 一种基于单原子铈纳米酶类氧化酶活性构建时间分辨传感器用于Fe³⁺和Cr⁶⁺检测方法的建立

1、实验材料

3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）由上海麦克林生化科技有限公司提供；二甲基亚砜（DMSO）由阿拉丁试剂（上海）有限公司提供；K⁺、Cu²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Na⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Hg⁺、As³⁺、Cr⁶⁺、Al³⁺、F^-、Cl^-、Br^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、PO₄ ^3-标准品溶液标准品由青岛泉畅科贸有限公司提供；醋酸钠、氢氧化钠、无水乙醇、冰乙酸、30%过氧化氢、浓硝酸由上海源叶生物科技有限公司提供。5% Nafion由上海生物科技有限公司提供、FCP962 96孔板由上海碧云天生物技术有限公司提供、CNW进样小瓶由上海睿齐实业有限公司提供。

生活饮用水、自来水取自生活所在地；菠菜、芹菜、桃、油炸肉、冷冻肉、红茶、玫瑰花茶及小麦均购买于当地生活超市。

2、传感器的设计原理

利用单原子铈纳米酶具有类氧化酶活性，能在15 min内催化氧化底物TMB显蓝。然而Fe³⁺和Cr⁶⁺均能显著促进单原子铈纳米酶表面氧化还原体系中Ce⁴⁺与Ce³⁺的电子转移加速TMB的氧化，缩短催化氧化时间。且单原子铈纳米酶对Fe³⁺的亲和力高于Cr⁶⁺，两者分别能使单原子铈纳米酶在30s和60s内催化TMB变为蓝色。通过时间分辨观察体系的颜色变化及650nm处的吸光度，实现对食品基质中Fe³⁺和Cr⁶⁺的检测（图1）。

3、单原子铈纳米酶类氧化酶活性验证

在96孔板中加入170μL 的0.2 M pH3.6的醋酸盐缓冲液，再加入20μL TMB（溶解于DMSO中），最后再加入10μL 单原子铈纳米酶溶液，混合均匀后在10 min内观察溶液颜色是否变为蓝色，且通过酶标仪在652 nm处检测是否有特征吸收峰。若溶液颜色变为蓝色，且在652nm处有特征吸收峰，即说明单原子铈纳米酶具有类氧化酶活性（图2）。反之则无。

4、检测机理验证

基于H₂O₂产生•OH能促进单原子铈纳米酶结构中Ce³⁺与Ce⁴⁺之间的电子转移，从而增强其类氧化酶活性。然而Fe³⁺和Cr⁶⁺同样也能促进单原子铈纳米酶结构中Ce³⁺与Ce⁴⁺之间的电子转移，增强其类氧化酶活性。因此，我们通过酶动力学实验计算单原子铈纳米酶与Fe³⁺、Cr⁶⁺与H₂O₂三者之间的亲和力大小判断三者促进电子转移的快慢。分别在0.125、0.25、0.375、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25和2.5 μg/mL Fe³⁺溶液（图3A,B）；0.125、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7和8 μg/mL Cr⁶⁺溶液（图3C,D）及0.0313、0.0625、0.125、0.25、0.375、0.5、0.625、0.75、0.875、1、1.125和1.25 M H₂O₂溶液中（图3E,F）进行了酶动力学参数实验，验证及比较单原子铈纳米酶与三者的亲和力大小。发现单原子铈纳米酶对Fe³⁺的亲和力强于Cr⁶⁺，强于H₂O₂，因为Fe³⁺的米氏常数K _m值最小、Cr⁶⁺的米氏常数为次之、H₂O₂最大，由此可以证明Fe³⁺、Cr⁶⁺比传统的H₂O₂更能显著增强单原子铈纳米酶类氧化酶活性，提高其催化速率。

实施例2 检测条件优化结果

1、单原子铈纳米酶类氧化酶活性优化

为了使其类氧化酶活性能最大程度发挥，我们对其可能的影响因素进行了优化，如反应pH（图4A）、反应温度（图4B）、反应时间（图4C）和单原子铈纳米酶溶液浓度（图4D），以及酸碱耐受性（图4E）和保藏时间（图4F）。因此，最优的反应条件为：pH3.6醋酸盐缓冲液、反应时间12 min、反应温度37℃以及单原子铈纳米酶浓度为0.124 μM。

2、单原子铈纳米酶类氧化酶活性拟合参数

在最佳的反应条件下评估单原子铈纳米酶类氧化酶活性的大小。通过计算酶动力学参数v _max、K _m（图5A）及其酶活力SA（图5B）来评价单原子铈纳米酶类氧化酶活性的大小。

因此，最终的反应数据为：v _max为1.14×10^-8M s^-1、K _m为0.20 mM以及SA为7.72U/mg。

3、快速检测试剂盒体系优化

分别将相同浓度的Fe³⁺、Cr⁶⁺加入到相同的体系中，探究Fe³⁺、Cr⁶⁺种类对TMB催化氧化的影响（图6A）；通过设置pH为 2.0、3.6、4.5、6.0、7.0和8.0的NaAc-HAc缓冲液，探究反应pH对检测体系性能的影响（图6B）；通过设置0.0177、0.0354、0.0531、0.0632、0.0885、0.1062和0.1239 μM 的单原子铈纳米酶溶液的浓度，探究其浓度对检测体系性能的影响（图6C）；通过设置0.5、1、1.5、2、2.5和3 mM的TMB浓度，探究其浓度对检测体系性能的影响（图6D）。因此，最优的检测条件为： pH3.6的醋酸盐缓冲溶液、单原子铈纳米酶溶液浓度为0.08-0.12μM；底物TMB浓度为2 mM。

实施例3 检测方法的灵敏度测定

根据上述优化体系，分别对Fe³⁺和Cr⁶⁺的灵敏度进行探究，在Fe³⁺灵敏度分析中，随着Fe³⁺浓度的增加，体系在30 s时的颜色变化增强，当浓度达到2.75 μg/mL时，继续提高Fe^{3 +}的浓度吸光度值开始下降，60 s之后可以观察到加入有高浓度Fe³⁺溶液的体系颜色由30 s时的蓝色变为绿色再变成为蓝黑色，直到最终颜色退却。主要原可能高浓度的Fe³⁺导致体系出现沉淀使吸光度值下降。因此，Fe³⁺的浓度在0.25、0.375、0.5、0.75、1、1.25和1.5 μg/mL线性范围内与652 nm处的吸光度呈现很好的线性关系，线性回归方程为y=0.44x+0.15，计算所得检出限LOD为34.72 ng/mL（图7A）。与此同时，在相同的体系中加入不同浓度的Cr⁶⁺，随着其浓度的增加，在开始的30 s内，未出现任何颜色变化，直到60 s后体系呈现出不同的颜色变化，且颜色一直保持稳定状态，未出现颜色减退现象。因此，Cr⁶⁺的浓度在0.5、0.75、1、2、3、4和5 μg/mL线性范围内与652 nm处的吸光度呈现很好的线性关系，线性回归方程为y=0.16x+0.18，计算所得检出限LOD为93.65 ng/mL（图7B）。最终Fe³⁺和Cr⁶⁺所得LOD值均在国家规定的要求范围内，表明所构建的Fe³⁺和Cr⁶⁺检测方法具有可行性。

实施例4检测方法的选择性验证

探究了检测体系对Fe³⁺和Cr⁶⁺的选择性，在最佳的检测条件下探究了在不同阴阳离子作用下Fe³⁺、Cr⁶⁺能否特异性增强单原子铈纳米酶类氧化酶活性。可发现只有Fe³⁺和Cr⁶⁺的加入能在短时间内使得体系由无色状态变为蓝色，在652 nm处的吸光度值显著高于其他离子（图8）。

实施例5加标样品检测应用

在10个样品的检测过程中发现，加入Fe³⁺后在30 s内几乎都呈现出相似的蓝色变化，其中生活饮用水、自来水管水和菠菜中的蓝色程度相对较深（图 9A），在652 nm处的吸光度值较高。所构建的时间分辨传感器对Fe³⁺的回收率分别为88.66-113.24%，标准偏差为0.62-2.75%。且实验发现在60 s之后，除了生活饮用水、自来水管水体系中的蓝色几乎没褪色以外其他样品体系都呈现出不同程度的褪色。加入Cr⁶⁺的体系在前30 s内均未出现任何颜色变化，但在60 s之后各个样品呈现出不同的颜色变化，其中菠菜、小麦的蓝色最深（图9A）。通过记录在60 s时的吸光度变化来计算出检测体系对Cr⁶⁺回收率为85.49-111.22%，标准偏差为0.97-4.34%。并且本文构建的检测方法对Fe³⁺与Cr⁶⁺的检测结果与ICP-MS仪器的最终检测结果几乎一致（图 9B-C），说明了本发明构建的检测方法具有对实际样品检测的可行性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺的快速检测方法，其特征在于，Fe³⁺和Cr⁶⁺能够显著促进单原子铈纳米酶表面氧化还原体系中Ce⁴⁺与Ce³⁺的电子转移，加速底物试剂的氧化，缩短催化氧化时间,通过时间分辨观察体系的颜色变化及652nm处的吸光度，实现对食品基质中Fe3+和Cr6+的检测；

检测体系包括：单原子铈纳米酶溶液、底物试剂、缓冲液；

所述单原子铈纳米酶是具有类氧化酶活性的纳米酶，对重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺具有特异性；

所述单原子铈纳米酶溶液其溶剂为乙醇和5%Nafion溶液组成的混合溶剂；

所述底物是指能够在氧化酶作用下会生成颜色变化的物质；

所述缓冲液是酸性的醋酸盐缓冲液；

检测步骤为：1）实际样品加入5.0 mL浓硝酸、1 mL的30%H₂O₂微波消解，得到待测样品；2）待测样品加入检测体系进行检测，通过时间分辨观察体系的颜色变化及652nm处的吸光度，实现对食品基质中Fe³⁺和Cr⁶⁺的检测；随着Fe³⁺浓度的增加，体系在30 s时的颜色变化增强；随着Cr⁶⁺浓度的增加，在开始的30 s内，未出现任何颜色变化，直到60 s后体系呈现出不同的颜色变化。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，底物是指3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB，在氧化酶作用下会生成蓝色氧化产物TMB_ox能在652 nm处产生特征吸收峰。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述单原子铈纳米酶溶液的浓度为0.08-0.12μM。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述单原子铈纳米酶溶液的溶剂中乙醇：5%Nafion溶液的体积分数为（50-150）：1。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述底物浓度为1-5mM。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，醋酸盐缓冲液的pH为2.0-4.0。

7.一种重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺的快速检测试剂盒，其特征在于，利用权利要求1所述的检测方法或权利要求1中所述的单原子铈纳米酶。

8.根据权利要求1所述的检测方法在重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺检测中的应用。

9.根据权利要求7所述的检测试剂盒在重金属Fe³⁺和Cr⁶⁺检测中的应用。

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