CN104774915A - 一种催化灯标及其制备方法以及用催化灯标测定痕量铀的方法 - Google Patents

一种催化灯标及其制备方法以及用催化灯标测定痕量铀的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种催化灯标及其制备方法以及用催化灯标测定痕量铀的方法。催化灯标由DNA酶和底物DNA两部分组成，DNA酶序列的3’末端为连续的4个鸟嘌呤脱氧核苷酸（G），底物DNA的序列中间具有一个腺嘌呤核苷酸（rA），底物DNA的5’末端用4-甲基-6-羧基罗丹明（TAMRA）荧光染料修饰。将DNA酶与底物DNA混合杂交形成所述催化灯标，加入到待测样品体系中反应，测定已知浓度硝酸铀酰离子的荧光强度和样品的荧光强度并计算可得到样品中的铀含量。本发明是一种快速、准确、高灵敏度和高选择性测定痕量铀的方法。

Description

一种催化灯标及其制备方法以及用催化灯标测定痕量铀的方法
技术领域
本发明属于化学分析领域中痕量铀的荧光检测方法，特别是涉及一种催化灯标及应用催化灯标快速、准确、高灵敏度和高选择性检测痕量铀（铀含量）的方法。
背景技术
铀是一种天然放射性金属元素，在能源和军事领域中有着重要的应用，是核能源和核武器生产重要的原材料。铀虽然在人类的生产、生活中发挥重要作用，但也是一种常见的放射性污染源。已有研究表明，铀核素可直接经过呼吸道、皮肤、直接照射等途径进入人体，也可通过生物循环经食物链进入人体，从而引发白血病等癌症和一些肾脏、神经系统疾病（如急性肾病、巴尔干综合症等）。随着科学技术的进步，核电站和核武器数量逐渐增多，人们暴露于铀辐射环境中的概率不断增加，尤其是在发生核泄漏事故时情形更为严重。例如，1984年切尔诺贝利核泄漏事故后前3个月内有31人死亡，之后15年内有6-8万人死亡，13.4万人遭受各种程度的辐射疾病折磨，方圆30公里地区的11.5万多民众被迫疏散。因此，铀含量的监控对人们健康、生产安全、环境保护具有极其重要的意义。
目前，铀含量的测定方法包括紫外脉冲荧光法（刘立坤，郭冬发，李斌凯等，铀矿地质,2011,27(3):180）、电感耦合等离子体光谱法（胡明松,分析化学，2005,33(2):173）、电感耦合等离子体质谱法（Luo M.B.,Hu B.,Zhang X.,et al,AnalyticalChemistry,2010,82,282）、激光荧光法（Lehmann S,Geipel G.,Grambole G.etal.Spectrochim.Acta A:Mol.Biomol.Spectrosc.,2009,73(5):902）等。上述方法或因仪器昂贵、使用成本较高（电感耦合等离子体质谱法），或因操作过程繁琐、流程长（电感耦合等离子体光谱法），或因灵敏度低、选择性差（紫外脉冲荧光法）等原因在实际应用中仍显不足。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种高灵敏及对铀高选择性的催化灯标及其制备方法。
本发明所提供的催化灯标，为用于测定痕量铀的催化灯标，由DNA酶和底物DNA两部分杂交形成，DNA酶序列的3’末端为连续的4个鸟嘌呤脱氧核苷酸（G），底物DNA的序列中间具有一个腺嘌呤核苷酸（rA），底物DNA的5’末端用4-甲基-6-羧基罗丹明（TAMRA）荧光染料修饰。
其中，所述DNA酶的核苷酸序列由序列表中序列1表示。所述底物DNA的核苷酸序列由序列表中序列2表示。
所述DNA酶和底物DNA杂交比例为1.5:1（摩尔质量比）。
催化灯标的制备方法为：将DNA酶和底物DNA以1.5:1的比例（摩尔质量比）混匀后于沸水浴中反应2-10分钟（优选5分钟），然后在1-2小时内逐渐冷却至15-25℃（优选20℃），最后放入0-10℃（优选4℃）冰箱中冷藏至少30分钟，使DNA酶与底物DNA充分杂交，得到催化灯标。本段括号中优选内容的组合为催化灯标制备的优选方案。
本发明另一目的是提供一种快速、准确、高灵敏度和高选择性的用催化灯标测定痕量铀（铀含量）的方法。
本发明用所述催化灯标测定痕量铀的方法，将DNA酶与底物DNA混合杂交形成所述催化灯标，加入到待测样品体系中反应，测定已知浓度硝酸铀酰离子的荧光强度和样品的荧光强度并计算得到样品中的铀含量。
具体的，所述痕量铀的测定方法包括以下步骤：
1）、测定反应体系中已知浓度硝酸铀酰离子的荧光强度，绘制标准曲线；
2）、测定样品反应体系中的荧光强度ΔIF；
3）、用算式c(UO2)2+=（ΔIF-83.67）/3.41计算样品中铀含量c(UO2)2+。
所述反应体系中包括：40微升50mmol/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液（pH5.5）、40微升1.6×10-7mol/L催化灯标、80微升2mol/L NaCl溶液、40微升已知浓度的硝酸铀酰离子溶液或样品溶液、以及200微升二次蒸馏水；反应温度15-25℃（优选20℃），反应时间5-15分钟（优选10分钟），以加入100微升50mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲溶液（pH8.0）终止反应。
荧光强度的测定采用F-7000荧光分光光度计，并设定仪器参数为：激发波长：525nm；发射波长：550-700nm；电压：700V；狭缝：10nm。
绘制标准曲线中已知浓度硝酸铀酰离子溶液浓度范围为1.121-112.1nmol/L。
50mmol/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液（pH5.5）配制过程为：准确称取0.4880g的MES固体粉末，溶解于二次蒸馏水中，用1mol/L NaOH调pH至5.5，定容至50.0mL；
50mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲溶液（pH8.0）配制过程为：准确称取0.3028g Tris碱、24.0500g尿素，加水溶解后加入10.0mL2mol/L EDTA，然后用浓盐酸调pH至8.0，定容至100mL。
本发明用催化灯标测定痕量铀（铀含量）的原理是：当DNA酶与底物DNA杂交形成催化灯标后，底物DNA5’-末端的TAMRA荧光染料与DNA酶3’末端的G碱基靠近，发生从TAMRA到G碱基的电子能量转移，从而使TAMRA的荧光被G碱基猝灭；当催化灯标与铀共存时，铀催化DNA酶从底物DNA中间的rA碱基断裂，释放其5’端的单链片段，从而使TAMRA远离G碱基，荧光增强，
采用以上技术方案，本发明用催化灯标测定痕量铀（铀含量）的方法明显优于现有检测技术，具有以下优点：
1）检测速度快：15分钟之内即可完成；
2）准确度高：相对标准偏差RSD为3.1％；
3）灵敏度高：可检测低至1.121nmol/L的铀；
4）选择性好：一般金属离子即使溶度高于1000倍也不干扰测定；
5）操作简单：仅2个步骤；
6）对仪器设备要求低：仅需荧光分光光度计；
7）成本低廉：每个样品的测试成本不高于200元；
8）应用范围广：可用于水样、土壤、矿石、空气等样品分析，适合大面积推广和应用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为催化灯标与不同浓度硝酸铀酰离子相互作用的荧光光谱图
图2为催化灯标与硝酸铀酰离子相互作用的标准曲线
图3为催化灯标与硝酸铀酰离子相互作用不同时间的动态曲线
图4为催化灯标与硝酸铀酰离子及其它金属离子相互作用的选择性分析结果
具体实施方式
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例、催化灯及其制备以及用催化灯标测定痕量铀（铀含量）
实验材料：
DNA酶和底物DNA由Takara公司合成，DNA酶的核苷酸序列为：5’-CACGTCCATCTCTGCAGTCGG GTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGGGG-3’（序列表中序列1），黑色下划线部分的碱基与底物DNA互补配对；底物DNA的核苷酸序列为：5’-TAMRA-CCTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTG-3’（序列表中序列2），黑色下划线部分的碱基与DNA酶互补配对。
硝酸铀酰（UO2(NO3)2·6H2O）为商购。
2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、EDTA购于Sigma公司。
主要仪器设备：
荧光分光光度计：型号F-7000，日立高新技术公司；
电子天平：型号FA1204B（M），上海精密科学仪器有限公司；
超声波清洗仪：型号KQ2200E，昆山市超声波仪器有限公司；
恒温水浴锅：型号HH-WO-5，上海一科仪器有限公司。
本实施例用催化灯标测定痕量铀（铀含量），包括以下内容：
1、制备催化灯标
将DNA酶和底物DNA以1.5:1的比例（按摩尔质量比）混匀后于沸水浴中反应2-10分钟（优选5分钟），然后在1-2小时内逐渐冷却至15-25℃（优选20℃），最后放入0-10℃（优选4℃）冰箱中冷藏至少30分钟，使DNA酶与底物DNA充分杂交，得到催化灯标。
2、绘制标准曲线
2.1配制溶液
使催化灯标与硝酸铀酰离子（或其它离子）相互作用的缓冲溶液（作用缓冲液）：
50mmol/L（pH5.5）2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液：准确称取0.4880g的MES固体粉末，溶解于二次蒸馏水（重蒸水）中，然后用1mol/L NaOH调pH至5.5，定容至50.0mL；
2mol/L NaCl溶液；准确称取5.8440g的NaCl固体粉末，溶解于二次蒸馏水中，然后定容至50.0mL。
终止催化灯标与硝酸铀酰离子（或其它离子）相互作用的缓冲溶液（终止缓冲液）：
50mmol/L（pH8.0）三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲溶液（8mol/L尿素，200mmol/LEDTA）：准确称取0.3028g Tris碱、24.0500g尿素，加水溶解后加入10.0mL2mol/LEDTA，然后用浓盐酸调pH至8.0，定容至100mL。
2.2硝酸铀酰（UO2(NO3)2·6H2O）与催化灯标的相互作用
1）催化灯标与硝酸铀酰离子相互作用：将40微升50mmol/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液（pH5.5，作用缓冲液）、40微升1.6×10-7mol/L催化灯标、80微升2mol/L NaCl溶液依次与40微升浓度分别为0、1.121、5.605、11.21、33.62、56.04、77.47、112.1、242.2nmol/L的硝酸铀酰离子溶液、200微升二次蒸馏水（重蒸水）混匀，于15-25℃（优选20℃）反应5-15分钟（优选10分钟）；
2）终止催化灯标与硝酸铀酰离子相互作用：加入100微升50mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲溶液（pH8.0，终止缓冲液）终止反应；
3）反应结束后，在F-7000荧光分光光度计上设定以下参数：激发波长：525nm，发射波长：550-700nm，电压：700V，狭缝：10nm，测定荧光光谱。
测得各溶液荧光光谱如图1（横坐标表示：波长，纵坐标表示：荧光强度；1为催化灯标对照，2为催化灯标+1.121nmol/L铀酰离子，3为催化灯标+11.21nmol/L铀酰离子，4为催化灯标+56.04nmol/L铀酰离子）所示，催化灯标本身的荧光强度较低，随着硝酸铀酰离子的加入荧光强度显著增强，且荧光强度随着硝酸铀酰离子浓度的增加规律增强。
2.3绘制标准曲线
检测结果表明，当硝酸铀酰离子浓度为1.121-112.1nmol/L时，其583nm的荧光增强强度与硝酸铀酰离子浓度呈现良好的线性关系，如图2所示（横坐标表示：铀酰离子浓度，纵坐标表示：荧光增强值。具体数值为：ΔIF为66.7，c(UO2)2+为1.121nmol/L;ΔIF为105.8，c(UO2)2+为5.605nmol/L;ΔIF为153.5，c(UO2)2+为11.21nmol/L;ΔIF为187.8，c(UO2)2+为33.62nmol/L;ΔIF为247.1，c(UO2)2+为56.04nmol/L;ΔIF为369.2，c(UO2)2+为77.47nmol/L;ΔIF为464.4，c(UO2)2+为112.1nmol/L），依此得到的线性方程为：ΔIF=83.67+3.41×c(UO2)2+,相关系数R=0.991。
3、测定样品中的痕量铀（铀含量）
本例测试样品为铀矿石粉末，处理方法为：准确称取0.0050g铀矿石粉末，溶解于含15mL70%HNO3和5mL37%HCl的混合溶液中，于室温反应20小时后，0.2μm滤膜过滤并稀释25倍得铀矿石样品溶液。
1）催化灯标与样品中的铀离子相互作用：将40微升50mmol/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液（pH5.5，作用缓冲液）、40微升1.6×10-7mol/L催化灯标、80微升2mol/L NaCl溶液与40微升样品溶液、200微升二次蒸馏水（重蒸水）混匀，于15-25℃（优选20℃）反应5-45分钟（优选10分钟）；
2）终止催化灯标与硝酸铀酰离子相互作用：与步骤2相同；
3）反应结束后，测定荧光光谱，与步骤2相同。测定结果为，样品ΔIF为203.22。
4）铀含量计算：根据步骤2中的标准曲线和步骤3的荧光强度确定样品中的痕量铀（铀含量），计算公式为c(UO2)2+=（ΔIF-83.67）/3.41，结果样品的铀含量为c(UO2)2+为35.06nmol/L。
试验例1、硝酸铀酰离子与催化灯标相互作用的动态分析
本试验固定浓度为56.04nmol/L硝酸铀酰离子溶液为待测样品，改变催化灯标与样品中的铀离子相互作用时间。
用实施例1中的方法测定痕量铀（铀含量），步骤2.2中步骤1）、2)为：将40微升50mmol/L MES缓冲溶液（pH5.5）、40微升1.610-7mol/L催化灯标、80微升2mol/L NaCl与100微升56.04nmol/L硝酸铀酰离子溶液、140微升二次水混匀，于20℃反应，分别在特定的反应时间（0、5、8、10、15、20、25、30、40、50、60、80、100min）加入100微升50mmol/L Tris缓冲溶液（pH8.0，8mol/L尿素，200mmol/LEDTA）终止反应，反应结束后，在F-7000荧光分光光度计上测定荧光强度，其余步骤与实施例1相同。
检测如图3（横坐标表示：时间，纵坐标表示：荧光强度；Control表示催化灯标空白对照）所示，当硝酸铀酰离子加入催化灯标后，DNA酶裂解底物DNA的反应迅速进行，在30分钟内即已完成50％的反应，而后反应速度逐渐降低，在100分钟后反应全部完成。图3还显示，在15分钟内曲线线性较好，因此，为了提高分析速度，将本发明用催化灯标测定痕量铀（铀含量）方法中的反应时间定为5-15分钟，优选10分钟，在所定时间终止时加入终止缓冲液以终止反应。
试验例2、酸铀酰离子与催化灯标相互作用的干扰测定
本试验考察本发明方法是否适用其它金属离子的检测。
用实施例1中的方法测定痕量铀（铀含量），步骤2.2中步骤1）、2）为：将40微升50mmol/L MES缓冲溶液（pH5.5）、40微升1.6×10-7mol/L催化灯标、80微升2mol/L NaCl与125微升1.121×10-7mol/L硝酸铀酰离子或125微升1.121mmol/L其它金属离子（Ba2+、Ca2+、Cd2+、Cr3+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Pb2+）、115微升二次水混匀，于20℃反应10分钟后，加入100微升50mmol/L Tris缓冲溶液（pH8.0，8mol/L尿素，200mmol/L EDTA）终止反应，反应结束后，在F-7000荧光分光光度计上测定荧光强度，其余步骤与实施例1相同。
检测结果如图4（横坐标表示：离子种类，纵坐标表示：荧光增强值）所示，图4为硝酸铀酰离子和其它金属离子与催化灯标相互作用后的荧光增强值，从图中可以看出，硝酸铀酰离子的加入使得催化灯标打开，荧光强度大幅度增强；而其它金属离子（Ba2+、Ca2+、Cd2+、Cr3+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Pb2+）即使浓度为硝酸铀酰离子的10000倍也不会引起荧光强度的显著增强，表明本发明用催化灯标用于测定痕量铀（铀含量，尤其是硝酸铀酰离子）具有卓越的选择性，也意味着样品痕量铀测定中其它金属无干扰，无需进行样品中杂质金属离子的分离。
试验例3、本发明用催化灯标测定痕量铀（铀含量）方法的准确度测定
本试验考察本发明方法测定痕量铀的准确度。
1）将40微升50mmol/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液（pH5.5）、40微升1.6×10-7mol/L催化灯标、80微升2mol/L NaCl溶液、200微升二次蒸馏水（重蒸水）依次与40微升浓度相同的三个平行样品溶液（为未知浓度样品）混匀，于15-25℃（优选20℃）反应5-45分钟（优选10分钟）；
2）终止催化灯标与硝酸铀酰离子相互作用：方法与实施例1相同；
3）反应结束后，测定荧光光谱，方法与实施例1相同。
4）铀含量计算：根据实施例1中的标准曲线和步骤3）测定的荧光强度计算出三个平行样品的痕量铀（铀含量）分别为33.64nmol/L、33.68nmol/L、33.70nmol/L。
5）准确度计算：根据步骤4）得到三个平行样品的铀含量，而后计算用催化灯标测定痕量铀（铀含量）的准确度（RSD）为3.1％，计算公式为RSD=(S/X)×100％（S表示标准偏差，X表示三个平行样品痕量铀（铀含量）的平均值，x1、x2、x3分别表示三个平行样品的铀含量），
其中：X=(x1+x2+x3)/3
S=Sqrt(((x1-X)2+(x2-X)2+(x3-X)2)/2
表明本发明方法检测准确性高。

Claims (10)

1.用于测定痕量铀的催化灯标，由DNA酶和底物DNA两部分杂交形成，DNA酶序列的3’末端为连续的4个鸟嘌呤脱氧核苷酸（G），底物DNA的序列中间具有一个腺嘌呤核苷酸（rA），底物DNA的5’末端用4-甲基-6-羧基罗丹明（TAMRA）荧光染料修饰。
2.根据权利要求1所述的催化灯标，其特征在于：所述DNA酶的核苷酸序列由序列表中序列1表示，所述底物DNA的核苷酸序列由序列表中序列2表示。
3.根据权利要求1或2所述的催化灯标，其特征在于：DNA酶和底物DNA杂交比例为1.5:1（摩尔质量比）。
4.权利要求1-3任一所述催化灯标的制备方法，其特征在于，将DNA酶和底物DNA以1.5:1的比例（摩尔质量比）混匀后于沸水浴中反应2-10分钟，然后在1-2小时内逐渐冷却至15-25℃，最后放入0-10℃冰箱中冷藏至少30分钟，使DNA酶与底物DNA充分杂交，得到催化灯标；优选沸水浴中反应5分钟，冷却至20℃后在4℃冷藏。
5.一种用权利要求1-3任一所述催化灯标或权利要求4制备方法得到的催化灯标进行痕量铀的测定方法，将DNA酶与底物DNA混合杂交形成的催化灯标，加入到待测样品体系中反应，测定已知浓度硝酸铀酰离子的荧光强度和样品的荧光强度并计算得到样品中的铀含量。
6.根据权利要求5所述痕量铀的测定方法，其特征在于：
1）、测定反应体系中已知浓度硝酸铀酰离子的荧光强度，绘制标准曲线；
2）、测定样品反应体系中的荧光强度ΔIF；
3）、用算式c(UO2)2+=（ΔIF-83.67）/3.41计算样品中铀含量c(UO2)2+。
7.根据权利要求6所述痕量铀的测定方法，其特征在于：所述反应体系中包括：40微升50mmol/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液（pH5.5）、40微升1.6×10-7mol/L催化灯标、80微升2mol/L NaCl溶液、40微升已知浓度的硝酸铀酰离子溶液或样品溶液、以及200微升二次蒸馏水；反应温度15-25℃（优选20℃），反应时间5-15分钟（优选10分钟），以加入100微升50mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲溶液（pH8.0）终止反应。
8.根据权利要求5至7任一所述痕量铀的测定方法，其特征在于：荧光强度的测定采用F-7000荧光分光光度计，并设定仪器参数为：激发波长：525nm；发射波长：550-700nm；电压：700V；狭缝：10nm。
9.根据权利要求8所述痕量铀的测定方法，其特征在于：绘制标准曲线中已知浓度硝酸铀酰离子溶液浓度范围为1.121-112.1nmol/L。
10.根据权利要求7或8或9所述痕量铀的测定方法，其特征在于：
50mmol/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液（pH5.5）配制过程为：准确称取0.4880g的MES固体粉末，溶解于二次蒸馏水中，用1mol/L NaOH调pH至5.5，定容至50.0mL；
50mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲溶液（pH8.0）配制过程为：准确称取0.3028g Tris碱、24.0500g尿素，加水溶解后加入10.0mL2mol/L EDTA，然后用浓盐酸调pH至8.0，定容至100mL。
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