CN103913443A - 一种基于DNA-银纳米簇（DNA-Ag NCs）适体传感器，及其制备方法，用途以及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器，及其制备方法，用途以及检测方法，以DNA为模板，利用化学还原法制得了具有荧光性质的DNA-Ag NCs，此DNA-Ag NCs具有光稳定性佳，光强高，无细胞毒性等优点，因此将此传感器应用于蛋白质的检测具有很好的潜在应用价值。通过PDGF-BB及其适配体之间的特异性结合打开杂交的双链DNA，利用富G碱基的DNA在血晶素(hemin)和K+存在时形成的DNA模拟酶(DNAzyme)使得荧光DNA-Ag NCs发生猝灭，制备了基于DNA-Ag NCs的适体传感器，此传感器实现了对PDGF-BB高灵敏、高选择性的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种DNA-Ag NCs适体传感器的制备方法及对PDGF-BB的检测。
背景技术
近年来，应用于临床诊断相关的蛋白质组学越来越重要，因此发展生物传感器用于检测与癌症相关的蛋白质十分有必要。血小板源生长因子-BB(PDGF-BB)与多种疾病密切相关，如动脉硬化、纤维病，并且作为肿瘤血管发生指示剂在人类恶性肿瘤细胞中过度表达。因此开发高选择性、高灵敏性、低耗及无标记的生物传感器用于检测PDGF-BB至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器，及其制备方法，用途以及检测方法，应用于PDGF-BB蛋白质的检测。本发明以DNA为模板，利用化学还原法制得了具有荧光性质的DNA-Ag NCs，通过PDGF-BB及其适配体之间的特异性结合打开杂交的双链DNA，利用富G碱基的DNA在血晶素(hemin)和K+存在时形成的DNA模拟酶(DNAzyme)使得荧光DNA-Ag NCs发生猝灭，制备了基于DNA-Ag NCs的适体传感器，此传感器实现了对PDGF-BB高灵敏、高选择性的检测。
具体技术方案如下：
一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)DNA探针加热一定时间后自然冷却并培养一段时间；
(2)DNA溶液加入AgNO3后振荡；
(3)黑暗中放置一段时间；
(4)溶液中加入NaBH4，振荡，黑暗中放置；
(5)得到具有荧光性的DNA-Ag NCs。
进一步地，步骤(1)中，10μM DNA探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养50分钟。
进一步地，步骤(2)中DNA溶液加入AgNO3后剧烈振荡30秒，步骤(3)中黑暗中放置20分钟。
进一步地，步骤(4)中溶液中加入NaBH4，剧烈振荡30秒，黑暗中至少放置1-2小时。
一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器，采用上述的方法制备得到。
上述基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器的用途，用于无标记检测血小板源生长因子-BB(PDGF-BB)。
上述基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器无标记检测PDGF-BB的方法，包括如下步骤：
a、Apt-G4探针加热数分钟后自然冷却培养一段时间；
b、步骤a得到溶液加入一定浓度AgNO3并振荡；
c、步骤b得到溶液黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH4并振荡；
d、步骤c中溶液加入不同浓度的PDGF-BB，血晶素(hemin)及K+，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。
步骤a中，10μM Apt-G4探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间；步骤b中，加入一定浓度AgNO3并剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH4并剧烈振荡。
步骤d中，溶液黑暗中放置一段时间后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。
进一步地，步骤a中，10μM Apt-G4探针于88℃加热10min后自然冷却到室温培养50min；和/或，步骤b中，溶液加入20μL170μM AgNO3并剧烈振荡30s，黑暗中放置20min后加入20μL170μM NaBH4并剧烈振荡30s；和/或，步骤d中，溶液黑暗中放置50min后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM hemin及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养2.0h。
与目前现有技术相比，本发明制备DNA-Ag NCs方法与已有技术相比，具有重现性高，耗能低，制备时间短且易控制等优点。以此无标记的适体传感器检测PDGF-BB，线性范围宽，检测限低，且本传感器选择性佳，灵敏度高。
附图说明
图1为基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB示意图；
图2为合成的DNA-Ag NCs的SEM图；
图3(A)中,aDNA-Ag NCs紫外吸收光谱；b存在PDGF-BB及hemin时紫外吸收光谱；
图3(B)DNA-Ag NCs激发a及发射光谱b-e；
图3(C)中a为DNA-Ag NCs荧光寿命；b为存在PDGF-BB及hemin时荧光寿命；
图3(D)DNA-Ag NCs在PDGF-BB及hemin存在时的循环伏安图；
图4(A)不同浓度PDGF-BB对应荧光光谱；
图4(B)荧光强度与不同PDGF-BB浓度对数间线性关系；
图5为基于DNA-Ag NCs适体传感器的选择性考察；
图6为基于DNA-Ag NCs适体传感器的重复性考察。
具体实施方式
下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。
针对现有技术以检测PDGF-BB的不足(需标记信号分子、特异性不足)，本实施例提供一种无标记的DNA-Ag NCs生物传感器的制备及其应用于PDGF-BB蛋白质的检测。本发明以DNA为模板，利用化学还原法制得了具有荧光性质的DNA-Ag NCs，得到的DNA-Ag NCs可用于适体传感器的构建，实现对PDGF-BB高选择性，高灵敏性的检测。
实施例一：
一种基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB，步骤如下：
a、10μM Apt-G4探针于88℃加热10min后自然冷却到室温培养50min。
b、(a)中溶液加入20μL170μM AgNO3并剧烈振荡30s，黑暗中放置20min后加入20μL170μM NaBH4并剧烈振荡30s。
c、(b)中溶液黑暗中放置50min后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM hemin及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养2.0h。
DNA-Ag NCs的制备：10μM DNA探针于88℃加热10分钟后自然冷却到室温培养50分钟。然后此DNA溶液加入AgNO3后剧烈振荡30秒，黑暗中放置20分钟。随后在此溶液中加入NaBH4，剧烈振荡30秒，黑暗中至少放置1小时，得到具有荧光的DNA-Ag NCs。
实施例二：
基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB步骤如下：
a、10μM Apt-G4探针于88℃加热10分钟后自然冷却到室温培养50分钟。
b、(a)中溶液加入20μL170μM AgNO3并剧烈振荡30秒，黑暗中放置20分钟后加入20μL170μM NaBH4并剧烈振荡30秒。
c、(b)中溶液黑暗中放置50分钟后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养2.0小时。
实施例三：
一种荧光性DNA-Ag NCs的制备方法，步骤包括：10μM DNA探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。然后于此DNA溶液加入AgNO3后剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间。随后在此溶液中加入NaBH4，剧烈振荡，黑暗中至少放置1-2小时，得到具有荧光性的DNA-Ag NCs。
基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB步骤如下：
a、10μM Apt-G4探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。
b、(a)中溶液加入一定浓度AgNO3并剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH4并剧烈振荡。
c、(b)中溶液黑暗中放置一段时间后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及50mMK+，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。
实施例四：
以DNA为模板，利用化学还原法制得了具有荧光性质的DNA-Ag NCs，此DNA-Ag NCs具有光稳定性佳，光强高，无细胞毒性等优点，因此将此传感器应用于蛋白质的检测具有很好的潜在应用价值。通过PDGF-BB及其适配体之间的特异性结合打开杂交的双链DNA，利用富G碱基的DNA在血晶素(hemin)和K+存在时形成的DNA模拟酶(DNAzyme)使得荧光DNA-Ag NCs发生猝灭，制备了基于DNA-Ag NCs的适体传感器，此传感器实现了对PDGF-BB高灵敏、高选择性的检测。
一种荧光性DNA-Ag NCs的制备方法，步骤包括：
10μM DNA探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。然后于此DNA溶液加入AgNO3后剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间。随后在此溶液中加入NaBH4，剧烈振荡，黑暗中至少放置1-2小时，得到具有荧光性的DNA-Ag NCs。
基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB步骤如下：
a、10μM Apt-G4探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。
b、(a)中溶液加入一定浓度AgNO3并剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH4并剧烈振荡。
c、(b)中溶液黑暗中放置一段时间后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。
实施例五：
一种荧光性DNA-Ag NCs，以DNA为模板，利用化学还原法制得。一种荧光性DNA-Ag NCs的制备方法，步骤包括：10μM DNA探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。然后于此DNA溶液加入AgNO3后剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间。随后在此溶液中加入NaBH4，剧烈振荡，黑暗中至少放置1-2小时，得到具有荧光性的DNA-Ag NCs。
基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB步骤如下：
a、10μM Apt-G4探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。
b、(a)中溶液加入一定浓度AgNO3并剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH4并剧烈振荡。
c、(b)中溶液黑暗中放置一段时间后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。
所制得的DNA-Ag NCs的形貌如图2所示，Ag纳米粒子均匀，分散。
取200μL DNA-Ag NCs溶液于石英比色皿中，检测波长段450nm-750nm间吸收峰，所得吸收光谱如图3A所示。取200μL DNA-Ag NCs溶液于荧光比色皿中，检测其580nm激发处的发射光谱，所得光谱如图3B所示。取500μL DNA-Ag NCs溶液于荧光比色皿中，检测其荧光寿命，所得荧光寿命图如图3C所示，从图中可以看出，存在PDGF-BB及hemin时，DNA-Ag NCs的荧光寿命减小，发生了电子的转移。取50mM磷酸盐缓冲溶液作为电解质溶液放入电解槽中，将制备的DNA-Ag NCs滴于工作电极上，检测其循环伏安曲线，从得到的CV图(图3D)可以看出，存在PDGF-BB及hemin时，DNA-Ag NCs发生了电子的转移。
上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)DNA探针加热一定时间后自然冷却并培养一段时间；
(2)DNA溶液加入AgNO3后振荡；
(3)黑暗中放置一段时间；
(4)溶液中加入NaBH4，振荡，黑暗中放置；
(5)得到具有荧光性的DNA-Ag NCs。
2.如权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，10μM DNA探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养50分钟。
3.如权利要求1或2所述的基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中DNA溶液加入AgNO3后剧烈振荡30秒，步骤(3)中黑暗中放置20分钟。
4.如权利要求1-3中任一项所述的基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中溶液中加入NaBH4，剧烈振荡30秒，黑暗中至少放置1-2小时。
5.一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器，其特征在于，采用如权利要求1-4所述的方法制备得到。
6.权利要求5所述基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器的用途，其特征在于，用于无标记检测血小板源生长因子-BB(PDGF-BB)。
7.权利要求6所述基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器无标记检测PDGF-BB的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、Apt-G4探针加热数分钟后自然冷却培养一段时间；
b、步骤a得到溶液加入一定浓度AgNO3并振荡；
c、步骤b得到溶液黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH4并振荡；
d、步骤c中溶液加入不同浓度的PDGF-BB，血晶素(hemin)及K+，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。
8.如权利要求7所述基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器无标记检测PDGF-BB的方法，其特征在于，步骤a中，10μM Apt-G4探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间；步骤b中，加入一定浓度AgNO3并剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH4并剧烈振荡。
9.如权利要求7或8所述基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器无标记检测PDGF-BB的方法，其特征在于，步骤d中，溶液黑暗中放置一段时间后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。
10.如权利要求7-9中任一项所述基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器无标记检测PDGF-BB的方法，其特征在于，步骤a中，10μM Apt-G4探针于88℃加热10min后自然冷却到室温培养50min；和/或，步骤b中，溶液加入20μL170μM AgNO3并剧烈振荡30s，黑暗中放置20min后加入20μL170μM NaBH4并剧烈振荡30s；和/或，步骤d中，溶液黑暗中放置50min后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM hemin及50mM K+，此混合溶液于黑暗中继续培养2.0h。
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