CN107290516A - 基于三明治结构的银纳米簇探针对Aβ1‑40 oligomer特异性荧光检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于三明治结构的银纳米簇探针对Aβ1‑40oligomer特异性荧光检测的方法,该方法是用DNA1作为模板合成银纳米簇,将DNA1与DNA2特异性结合,得到DNA1/DNA2‑AgNCs荧光探针,再利用DNA1/DNA2‑AgNCs荧光探针检测阿尔兹海默症标志物Aβ1‑40oligomer,通过荧光信号发生变化来检测阿尔兹海默症标志物Aβ1‑40oligomer的含量,该方法实现了荧光检测阿尔兹海默症标志物,具有信号稳定,耐环境影响力强,特异性强,灵敏度高,检测下限低,线性关系好,操作简便等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种阿尔兹海默症标志物的检测方法,特别涉及一种通过构建DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针,通过荧光信号变化的方法来检测阿尔兹海默症标志物Aβ1-40oligomer的方法,属于生物纳米传感技术领域。
背景技术
阿尔兹海默症已经成为二十一世纪威胁人类健康的重大疾病之一,而且越来越趋向于年轻化。因此,阿尔兹海默病标志物含量的准确检测成为亟待解决的问题。已有文献报道β淀粉样蛋白的单体、寡聚体和纤维体是阿尔兹海默症致病的主要原因,可作为标志物进行检测,目前对这些标志物检测方法有共振光散射光谱(C.K.Wang,D.J.Liu,Z.X.Wang,Chem.Commun.2011,47,9339.)、毛细管电泳(R.Picou,J.P.Moses,A.D.Wellman,I.Kheterpal,S.D.Gilman,Analyst 2010,135,1631.)、荧光光谱测定法(N.P.Cook,V.Torres,D.Jain,A.A.Martí,J.Am.Chem.Soc.2011,133,11121)、电化学生物传感法(a)M.Vestergaard,K.Kerman,M.Saito,N.Nagatani,Y.Takamura,E.Tamiya,J.Am.Chem.Soc.2005,127,11892;b)L.Liu,Q.G.He,F.Zhao,N.Xia,H.J.Liu,S.J.Li,R.L.Liu,H.Zhang,Biosens.Bioelectron.2014,51,208.)、SPR免疫分析(N.Xia,L.Liu,M.G.Harrington,J.X.Wang,F.M.Zhou,Anal.Chem.2010,82,10151.)和免疫分析(L.Carlred,A.Gunnarsson,S.Solé-Domènech,B.Johansson,V.Vukojevi,L.Terenius,A.Codita,B.Winblad,M.Schalling,F.P.J.Am.Chem.Soc.2014,136,9973.),虽然这些检测方法具有高选择性和高灵敏性,但是成本高,还需要引入复杂的生物活性分子或是基于抗体的免疫分析。适配体作为一种能与目标分子结合的人工合成寡聚核苷酸或肽分子,与抗体相比,核酸适配体具有高亲和力、高稳定性、特异性强、适当分割后还可精确地结合目标物等优点,基于这些优点可实现对目标物的超灵敏检测。Aβ1-40oligomer作为阿尔兹海默症标志物之一,在脑脊液中广泛存在,应用核酸适配体成功检测Aβ1-40 oligomer含量对阿尔兹海默症的预防和治疗具有积极的作用。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷,本发明的目的是在于提供一种信号强、特异性高、灵敏度高、检测浓度范围广的检测阿尔兹海默症标志物的方法。
为了实现上述技术目的,本发明提供了一种基于三明治结构的银纳米簇探针对Aβ1-40 oligomer特异性荧光检测的方法,其包括以下步骤:
1)以DNA1为模板合成DNA1-AgNCs银纳米簇;
2)所述DNA1-AgNCs银纳米簇与DNA2特异性结合,得到DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针;
3)所述DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针与一系列不同浓度的标准Aβ1-40 oligomer溶液反应后,进行荧光检测,得到一系列荧光信号值,建立Aβ1-40 oligomer溶液浓度与荧光信号值的标准曲线;
4)将DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针与待测Aβ1-40 oligomer溶液反应后,进行荧光检测,得到的荧光信号值,并根据标准曲线,计算出待测Aβ1-40 oligomer溶液的浓度;
所述DNA1包含与DNA2互补的片段、合成银纳米簇模板的片段及与Aβ1-40 oligomer特异性结合的适配体片段split A;
所述DNA2包含与DNA1互补的片段、富G碱基片段及与Aβ1-40 oligomer特异性结合的适配体片段split B。
所述适配体片段split A和适配体片段split B是Aβ1-40 oligomer适配体经过分割后形成的两个片段。
本发明的技术方案,通过两条具有互补片段的DNA1和DNA2构建银纳米簇荧光探针,当DNA1与DNA2互补时,DNA2中富含G碱基的片段靠近银纳米簇,DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针的荧光得到增强,当加入Aβ1-40 oligomer后,荧光发生猝灭,主要是DNA1与DNA2的适配体片段split A与split B分别与Aβ1-40 oligomer特异性结合并自动将Aβ1-40 oligomer进行包裹形成复合物结构,使得DNA2富含G碱基的片段将远离银纳米簇合成位点,使得G碱基与银纳米簇的距离拉大,从而导致荧光发生猝灭,通过荧光信号衰减来检测阿尔兹海默症标志物的含量,利用该原理,实现了Aβ1-40 oligomer特异性荧光检测,检测下限可达到2nM,并且在20nM~100nM范围之间,荧光强度随着浓度的增加呈线性减弱,检测范围相对传统的方法较宽。
优选的方案,所述DNA1的序列号为:5’---GCC TGT GGT GTT CCC CCT TAT TCCCTA ATA TCG CTG ACA TGA TGC AA---3’;
优选的方案,所述DNA2的序列号为:5’---TTG CAT CAT GTC AGC GAT GGT GGGTGG GGT GGG GCG GGT GCG---3’。
本发明的DNA1与DNA2可购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。两者的序列设计如下:DNA1:5’---GCC TGT GGT GTT CCC CCT TAT TCC CTA ATA TCG CTG ACA TGA TGCAA---3’;DNA2:5’---TTG CAT CAT GTC AGC GAT GGT GGG TGG GGT GGG GCG GGT GCG---3’;其中DNA1的3’端与DNA2的5’端各有18个碱基互补;DNA1序列中5’---GCC TGT GGTGTT---3’片段为Aβ1-40 oligomer适配体分割的片段split A,DNA2序列中5’---GGG GCG GGTGCG---3’片段为Aβ1-40 oligomer适配体分割的片段split B,其中,Aβ1-40 oligomer适体序列为5’---GCC TGT GGT GTT GGG GCG GGT GCG---3’,根据实验证实我们将其分割为splitA和split B。split A和split B同时存在的情况下对对Aβ1-40 oligomer有特异性结合,可作为检测阿尔兹海默症标志物Aβ1-40 oligomer的探针;且利用DNA1中富含C碱基的片段来合成银纳米簇,当DNA1与DNA2互补时,DNA2中富含G碱基的片段靠近银纳米簇,荧光信号得到增强。
优选的方案,将DNA1磷酸缓冲液与AgNO3溶液混合后,加入NaBH4溶液混匀,在20~30℃恒温下反应,即得DNA1-AgNCs。更优选的方案,先将DNA1与硝酸银溶液、磷酸缓冲液(20mM,pH 7.0)室温下震荡混匀15min,随后加入新鲜配制的硼氢化钠,迅速震荡混匀,随后置于25℃恒温水浴箱中反应2h,即可检测其荧光信号,经实验证明此方法合成银纳米簇仅需2h,整个DNA1-AgNCs体系2h即可达到稳定。
较优选的方案,DNA1、AgNO3和NaBH4的摩尔比为1:5~7:5~7。更优选为1:6:6。
优选的方案,所述DNA1-AgNCs银纳米簇与DNA2等摩尔比混合,在室温下反应,即得DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针。本发明的技术方案中采用的DNA2与DNA1进行混匀一定时间之后,两链的碱基会一一进行互补配对。经过实验证明,两链进行互补配对所需的时间为1h,也即DNA1-AgNCs与DNA2整个溶液混合反应1h之后,体系达到完全的稳定,即得到检测阿尔兹海默症标志物的荧光探针。
较优选的方案,步骤3)中,所述DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针与标准Aβ1-40 oligomer溶液在室温下反应2~6min。更优选为2min。
较优选的方案,步骤4)中,所述DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针与待测Aβ1-40 oligomer溶液在室温下反应2~6min。更优选为2min。
本发明的DNA2与DNA1包含可以互补的基因片段,同时也包含可以与阿尔兹海默症标志物Aβ1-40 oligomer特异性结合的适配体片段。当DNA2与DNA1互补后,利用DNA2与DNA1都含有阿尔兹海默症标志物Aβ1-40 oligomer适配体片段的部分,从而使两条DNA链可以和阿尔兹海默症标志物Aβ1-40 oligomer特异性结合。
相对现有技术,本发明的技术方案带来的有益技术效果:
本发明的技术方案通过构建特殊的DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针,实现了对阿尔兹海默症标志物Aβ1-40 oligomer特异性的荧光检测,具有信号强、特异性高、灵敏度高、检测浓度范围广等优点,有利于推广应用。
本发明的技术方案通过两条包含互补片段的特殊DNA链构建银纳米簇荧光探针,再利用两条DNA互补时,DNA2中富含G碱基的片段靠近银纳米簇,DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针的荧光得到增强,当加入Aβ1-40 oligomer,这两条DNA链的适配体分割片段split A和splitB分别与Aβ1-40 oligomer特异性结合,形成复合物结构,从而使得DNA2包含的G碱基的片段将远离银纳米簇合成位点,导致DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针荧光发生猝灭的原理,实现了Aβ1-40oligomer特异性荧光检测,具有检测下限低,检测范围广的特点,检出下限可达到2nM,并且在20nM~100nM范围之间,反应体系荧光强度随着浓度的增加呈线性减弱,检测范围相对传统的方法较宽。
本发明的技术方案银纳米簇荧光探针通过DNA核酸序列来稳定银纳米粒子,其稳定性好,具有稳定信号,且纳米簇的尺寸小,耐环境影响力强;并且应用核酸适体的高选择性和特异性的特点可以有效改善现有技术灵敏度低和检测限的问题。
本发明的将阿尔兹海默症标志物Aβ1-40 oligomer的适配体分成两段,可以有效灵敏地结合阿尔兹海默症标志物Aβ1-40 oligomer,形成复合物结构后,DNA2序列中富含G碱基片段与银纳米簇的距离被拉大来引起荧光信号变化以实现对目标物的超灵敏检测。
本发明的技术方案利用银纳米簇荧光探针对阿尔兹海默症标志物Aβ1-40oligomer的检测,具有快速、高效,准确的特点,仅需2min作用即可达到稳定的检测,检测的结果准确性高。
本发明的技术方案通过荧光信号变化的方法检测阿尔兹海默症标志物,性质更稳定,操作更为简便,有利于推广应用。
附图说明
【图1】为通过荧光信号变化的方法检测阿尔兹海默症标志物的实验方法的示意图;
【图2】为DNA合成银纳米簇的激发和发射图谱;
【图3】为对目标物和干扰物做的特异性检测图;
【图4】为在一定浓度范围内检测阿尔兹海默症标志物Aβ1-40 oligomer含量的荧光图。
【图5】为一定浓度范围内检测阿尔兹海默症标志物Aβ1-40 oligomer含量的线性关系图。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明内容,而不是限制本发明权利要求的保护范围。
实施例1
银纳米簇的制备方法,步骤如下:
取23μL的DNA1(100μM)与112μL磷酸缓冲液(20mM,pH 7.0)混匀,加入9.2μL AgNO3水溶液(1.5mM)室温下震荡混匀15min,然后加入9.2μL新鲜配制的NaBH4(1.5mM)迅速混匀并移入25℃恒温水浴锅中反应2h,即可检测其荧光。
DNA1与DNA2反应步骤如下:
取23μL DNA2(100μM)与银纳米簇溶液混匀反应1h,即可检测其荧光信号。
Aβ1-40 oligomer的检测步骤如下:
向已经反应好了的DNA2与银纳米簇溶液中加入不同浓度的Aβ1-40 oligomer,反应2min后检测其荧光信号。
特异性检测步骤如下:
分别向已经反应好了的DNA2与银纳米簇溶液中加入不同阿尔兹海默症标志物Aβ40-O(Aβ1-40 oligomer)、Aβ42-O(Aβ1-42 oligomer)、Aβ40-M(Aβ1-40 monomer)、Aβ42-M(Aβ1-42monomer),5min后检测荧光信号,最终检测浓度为60nM。
建立坐标曲线步骤如下:
用磷酸缓冲液(20mM,pH 7.0)配置不同浓度的Aβ1-40 oligomer溶液,每个溶液取相同体积加入到DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针溶液中,5min后检测其荧光信号,重复5组实验,用origin软件做出线性拟合曲线图。
待测溶液检测步骤如下:
用脑脊液配置不同浓度的Aβ1-40 oligomer溶液,每个溶液取相同体积加入到DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针溶液中,5min后检测其荧光信号。
从图2可以看出a为银纳米簇的激发图谱,激发波长在570nm处;b为发射图谱,发射波长在636nm处;
从图3可以看出适配体只对阿尔兹海默症标志物Aβ1-40 oligomer有特异性结合,实验干扰小;
从图4可以看出荧光信号随着Aβ1-40 oligomer浓度增大而减小。
从图5可以看出在一定的浓度范围内Aβ1-40 oligomer与其所对应的响应信号有一定的线性关系。
Claims (6)
1.一种基于三明治结构的银纳米簇探针对Aβ1-40oligomer特异性荧光检测的方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)以DNA1为模板合成DNA1-AgNCs银纳米簇;
2)所述DNA1-AgNCs银纳米簇与DNA2特异性结合,得到DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针;
3)所述DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针与一系列不同浓度的标准Aβ1-40oligomer溶液反应后,进行荧光检测,得到一系列荧光信号值,建立Aβ1-40oligomer溶液浓度与荧光信号值的标准曲线;
4)将DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针与待测Aβ1-40oligomer溶液反应后,进行荧光检测,得到的荧光信号值,并根据标准曲线,计算出待测Aβ1-40oligomer溶液的浓度;
所述DNA1包含与DNA2互补的片段、合成银纳米簇模板的片段及与Aβ1-40oligomer特异性结合的适配体片段split A;
所述DNA2包含与DNA1互补的片段、富G碱基片段及与Aβ1-40oligomer特异性结合的适配体片段split B;
所述适配体片段split A和适配体片段split B是Aβ1-40oligomer适配体经过分割后形成的两个片段。
2.根据权利要求1所述的基于三明治结构的银纳米簇探针对Aβ1-40oligomer特异性荧光检测的方法,其特征在于:
所述DNA1的序列号为:5’---GCC TGT GGT GTT CCC CCT TAT TCC CTA ATA TCG CTGACA TGA TGC AA---3’;
所述DNA2的序列号为:5’---TTG CAT CAT GTC AGC GAT GGT GGG TGG GGT GGG GCGGGT GCG---3’。
3.根据权利要求1或2所述的基于三明治结构的银纳米簇探针对Aβ1-40oligomer特异性荧光检测的方法,其特征在于:将DNA1磷酸缓冲液与AgNO3溶液混合后,加入NaBH4溶液混匀,在20~30℃恒温下反应,即得DNA1-AgNCs。
4.根据权利要求3所述的基于三明治结构的银纳米簇探针对Aβ1-40oligomer特异性荧光检测的方法,其特征在于:DNA1、AgNO3和NaBH4的摩尔比为1:5~7:5~7。
5.根据权利要求1所述的基于三明治结构的银纳米簇探针对Aβ1-40oligomer特异性荧光检测的方法,其特征在于:所述DNA1-AgNCs银纳米簇与DNA2等摩尔比混合,在室温下反应,即得DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针。
6.根据权利要求1、2、4或5所述的基于三明治结构的银纳米簇探针对Aβ1-40oligomer特异性荧光检测的方法,其特征在于:
步骤3)中,所述DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针与标准Aβ1-40oligomer溶液在室温下反应2~6min;
步骤4)中,所述DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针与待测Aβ1-40oligomer溶液在室温下反应2~6min。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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