CN106950206A - 一种基于核酸适配体的荧光传感器检测腺苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于核酸适配体的荧光传感器检测腺苷的方法，该方法以适配体修饰的金纳米粒作为识别探针和能量受体，以适配体互补链修饰的碳点作为荧光探针和能量供体。通过杂交反应，金纳米粒和碳点之间发生荧光共振能量转移，检测体系的荧光发生猝灭，加入腺苷后，腺苷和适配体互补链竞争与适配体结合，使金纳米粒和碳点之间的能量转移效率减弱，检测体系的荧光恢复，基于这种荧光信号的变化实现腺苷的定量检测。本方法优点在于特异性强，操作简便，所需样品量少，灵敏度高的优点，能够用于血样中腺苷的测定，为临床诊断疾病提供有利分析数据。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及基于金纳米粒和碳点构建荧光适配体传感器用以检测腺苷的分析方法。
背景技术
腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，参与中枢神经系统及神经末梢的信号传导过程，调控脊髓运动模式的生成，具有抗缺血性神经保护作用，在调控机体各组织的生理活性和有机功能中均有发挥重要作用。与此同时，腺苷也是一种监测肺癌过程的生物标记物。目前检测腺苷的方法包括毛细管电泳，液相-质谱联用，高效液相色谱法等。这些方法一般都需要对样品进行复杂预处理，并且需借助大型仪器，操作繁琐，这些缺点在一定程度上限制了上述几种方法的应用。因此，发展一种简单灵敏高效的腺苷检测方法是十分必要的。
碳量子点(carbon dots,CDs)是一种直径小于10nm的离散准球形碳纳米粒子，其典型壳核结构包含含羧基或其他化学官能团的外壳和一个内部sp2杂化无定型或晶体石墨的核心。碳点作为一种新型的荧光纳米材料已被广泛应用于各个领域，然而目前大部分的荧光传感器都是基于“turn off”的原理进行分析检测，往往会受到样本基质的较大影响，进而影响传感器的灵敏度和选择性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种基于金纳米粒和碳点构建的荧光适配体传感器用以检测腺苷的分析方法。以适配体修饰的金纳米粒(aptamer-AuNPs)作为识别探针和能量受体，以适配体互补链修饰的碳点(ssDNA-CDs)作为荧光探针和能量供体，提供了一种高灵敏度高选择性的腺苷检测新方法。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一种基于核酸适配体的荧光传感器检测腺苷的方法，包括如下步骤：
a)构建荧光适配体传感器：将适配体修饰的金纳米粒(aptamer-AuNPs)和适配体互补链修饰的碳点(ssDNA-CDs)按1:3:～3:1的体积比例混合，加入磷酸缓冲液，37℃孵育杂交构建荧光适配体传感器；
b)标准曲线的绘制：在步骤a)构建的传感器中，加入多个不同已知浓度的腺苷溶液使体系内腺苷浓度在0nmol/L～500nmol/L范围内，室温孵育20min～60min，测定各自的荧光强度值F，同时测定空白(腺苷浓度为0nmol/L)荧光值F0，作相对荧光强度[(F-F0)/F0]与腺苷浓度对应的标准曲线；
c)荧光检测腺苷：在步骤a)构建的传感器中，加入未知腺苷浓度的溶液，测定其荧光强度值，根据步骤b)所述标准曲线得到待测溶液中腺苷的浓度。
其中，aptamer-AuNPs作为能量受体和识别探针，ssDNA-CDs作为能量供体和荧光探针，利用加入腺苷前后体系荧光信号的变化，实现对目标物的定量检测。腺苷核酸适配体(aptamer)序列为5’-SH-C6-AGA GAA CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGG AAG GT-3’，所述适配体互补链(ssDNA)序列为5’-NH2-C6-ACC TTC CTC CGC-3’。
在步骤a)中，aptamer-AuNPs和ssDNA-CDs体积比的范围在1:3:～3:1，总体积范围在50μL～150μL；磷酸缓冲液浓度范围在10mmol/L～50mmol/L，体积范围在50μL～200μL，pH范围在6.5～7.5；孵育杂交的时间范围在30min～60min。
在步骤b)中，室温孵育时间范围在20min～60min；体系中腺苷的浓度范围在0nmol/L～500nmol/L。
在步骤c)中，待测腺苷浓度的适用范围为10nmol/L～500nmol/L。
上述多个不同已知浓度的腺苷溶液加入后，体系内腺苷浓度分别为：10nM,25nM，150nM，250nM，350nM，500nM。
步骤b)或c)中，荧光检测条件为：测定体系在460nm处的荧光强度，激发波长为365nm，扫描速度为1200nm min-1，光电倍增管电压为700V，激发狭缝和发射狭缝宽度为5nm。
本发明中aptamer-AuNPs和ssDNA-CDs的制备方法均参考文献。具体步骤如下：
(1)aptamer-AuNPs的制备
柠檬酸还原法制备AuNPs，将2mL 50mmol/L的HAuCl4加入到250mL的三颈烧瓶中，再加入98mL的超纯水,剧烈搅拌条件下，油浴加热HAuCl4溶液至开始回流，迅速加入10mL38.8mmol/L的柠檬酸三钠溶液，加热至120℃,反应继续30min溶液变成酒红色。将溶液自然冷却至室温得AuNPs溶液。巯基修饰的aptamer用10mmol/L的TCEP处理一个小时，以打开二硫键。活化后的aptamer和AuNPs溶液混合，再加入10mmol/L pH 3.0的柠檬酸-盐酸缓冲液以促进aptamer和AuNPs的结合，室温孵育30min。反应结束后转速12000rpm离心10min，用10mmol/L pH 7.0的PBS洗3次，去除未结合的aptamer。最后将制备好的aptamer-AuNPs重新分散在超纯水中，置于4℃环境中保存。
(2)ssDNA-CDs的制备
2g的柠檬酸加热至200℃，加热5min后，柠檬酸熔融，柠檬酸液体由无色变为淡黄色，加热30min后，柠檬酸液体变成橙色，将得到的橙色液体，在剧烈搅拌的条件下，逐滴的分散到10mg/mL的NaOH溶液中，得到碳点溶液。在100μL的CDs溶液中加入10μL 100mmol/L的EDC/NHS溶液和10mmol/L的磷酸缓冲液(pH 7.2)，室温条件下避光震荡30min，活化碳点表面的羧基基团。活化后的CDs与氨基修饰的ssDNA混合，室温避光反应6h得到ssDNA-CDs。
金纳米粒(gold nanoparticles,AuNPs)在生物传感器领域的研究中发展迅速，因其吸光系数大，吸收光谱宽而被视为极具前景的能量受体，在荧光传感检测体系中，碳点作为能量供体而金纳米粒作为能量受体，加入金纳米粒子能够有效的猝灭碳点的荧光，进而实现“turn on”检测目标物，提高检测灵敏度与选择性。
此外，本发明通过引入核酸适配体(aptamer)进一步有效地提高检测的选择性。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术从随机DNA文库中筛选出的寡核苷酸序列组成的单链寡核苷酸片段。适配体具有易于修饰、靶分子广泛、高亲和力、高特异性、便于体外筛选制备的优势。目前，核酸适配体生物传感器因其操作简单、灵敏度高，在临床诊断、药物研究、环境监测及蛋白质组学等方面获得了广泛的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下显著优点：
1.利用金纳米粒作为荧光猝灭剂，能够有效地避免复杂基质的干扰，减小背景荧光，提高了检测的灵敏度。
2.引入核酸适配体，进一步提高检测体系的选择性，实现腺苷高选择性检测，检测结果可信度高。
3.基于本发明的传感策略，根据不同目标物选择合适的适配体，能够用于其他目标物的检测，有较好的应用前景。
附图说明
图1是本发明合成的碳点透射电镜图；
图2是本发明合成的金纳米颗粒透射电镜图；
图3是本发明实施例1所构建的检测腺苷体系，荧光强度随不同浓度腺苷变化的荧光光谱图；
图4是本发明实施例1所构建的检测腺苷体系，不同浓度腺苷对相对荧光强度[(F-F0)/F0]的标准曲线图。
具体实施方式
药品和试剂：氯金酸(HAuCl4)、柠檬酸(citric acid)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(国药集团化学试剂有限公司)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，上海源叶生物科技有限公司)，腺苷(adenosine)、透析膜(MWCO:3000)(阿拉丁试剂中国有限公司)，实验用水为二次蒸馏水。
以下通过具体实施例说明本发明，但本发明并不仅仅限定于这些实施例。
实施例1
a)构建荧光适配体传感器：45μLaptamer-AuNPs和30μLssDNA-CDs混合均匀，加入105μL10mmol/L的pH7.4磷酸缓冲液，37℃孵育杂交30min；
b)荧光传感检测腺苷：在步骤a)构建的传感器中加入20μL的0nM，0.1μM，0.25μM，1.5μM，2.5μM，3.5μM，5μM的腺苷溶液，室温孵育30min，测定各自的荧光强度值F，同时测定空白荧光值F0，作相对荧光强度[(F-F0)/F0]与腺苷浓度对应的标准曲线；
c)荧光检测腺苷：在步骤a)构建的传感器中，加入未知腺苷浓度的溶液，测定其荧光强度值，根据步骤b)标准曲线得到待测溶液中腺苷的浓度。测定体系在460nm处的荧光强度，激发波长为365nm，扫描速度为1200nm min-1，光电倍增管电压为700V，激发狭缝和发射狭缝宽度为5nm。
上述腺苷核酸适配体序列为5’-SH-C6-AGA GAA CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGGAAG GT-3’，所述适配体互补链序列为5’-NH2-C6-ACC TTC CTC CGC-3’。
实施例2
a)构建荧光适配体传感器：50μLaptamer-AuNPs和25μLssDNA-CDs混合均匀，加入110μL20mmol/L的pH7.0磷酸缓冲液，37℃孵育杂交60min；
b)荧光传感检测腺苷：在步骤a)构建的传感器中加入15μL的0nM，0.1μM，0.25μM，1.5μM，2.5μM，3.5μM，5μM的腺苷溶液，室温孵育45min，测定荧光强度值，绘制标准曲线。
c)荧光检测腺苷：在步骤a)构建的传感器中，加入未知腺苷浓度的溶液，测定其荧光强度值，根据步骤b)标准曲线得到待测溶液中腺苷的浓度。测定体系在460nm处的荧光强度，激发波长为365nm，扫描速度为1200nm min-1，光电倍增管电压为700V，激发狭缝和发射狭缝宽度为5nm。
上述腺苷核酸适配体序列为5’-SH-C6-AGA GAA CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGGAAG GT-3’，所述适配体互补链序列为5’-NH2-C6-ACC TTC CTC CGC-3’。
实施例3
a)构建荧光适配体传感器：50μLaptamer-AuNPs和50μLssDNA-CDs混合均匀，加入80μL25mmol/L的pH7.5磷酸缓冲液，37℃孵育杂交45min；
b)荧光传感检测腺苷：在步骤a)构建的传感器中加入20μL的0nM，0.1μM，0.25μM，1.5μM，2.5μM，3.5μM，5μM的腺苷溶液，室温孵育30min，测定荧光强度值，绘制标准曲线。
c)荧光检测腺苷：在步骤a)构建的传感器中，加入未知腺苷浓度的溶液，测定其荧光强度值，根据步骤b)标准曲线得到待测溶液中腺苷的浓度。
上述腺苷核酸适配体序列为5’-SH-C6-AGA GAA CCT GGG GGAGTA TTG CGG AGGAAG GT-3’，所述适配体互补链序列为5’-NH2-C6-ACC TTC CTC CGC-3’。
实施例4
a)构建荧光适配体传感器：20μLaptamer-AuNPs和30μLssDNA-CDs混合均匀，加入130μL50mmol/L的pH7.5磷酸缓冲液，37℃孵育杂交30min；
b)荧光传感检测腺苷：在步骤a)构建的传感器中加入20μL的0nM，0.1μM，0.25μM，1.5μM，2.5μM，3.5μM，5μM的腺苷溶液，室温孵育60min，测定荧光强度值，绘制标准曲线。
c)荧光检测腺苷：在步骤a)构建的传感器中，加入未知腺苷浓度的溶液，测定其荧光强度值，根据步骤b)标准曲线得到待测溶液中腺苷的浓度。测定体系在460nm处的荧光强度，激发波长为365nm，扫描速度为1200nm min-1，光电倍增管电压为700V，激发狭缝和发射狭缝宽度为5nm。
上述腺苷核酸适配体序列为5’-SH-C6-AGA GAA CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGGAAG GT-3’，所述适配体互补链序列为5’-NH2-C6-ACC TTC CTC CGC-3’。
应用实施例
将实施案例1所构建的荧光适配体传感器应用于实际人体血清样本测定。
血清样本12000rpm离心后，作为未知腺苷溶液加入体系，测定体系在460nm处的荧光强度，激发波长为365nm，扫描速度为1200nm min-1，光电倍增管电压为700V，激发狭缝和发射狭缝宽度为5nm。根据实施例1得到的标准曲线可计算样本中腺苷的含量，结果如表1所示。
表1实际样本中腺苷的测定结果(n＝3)
Claims (8)
1.一种基于核酸适配体的荧光传感器检测腺苷的方法，其特征在于包括如下步骤：
a)构建荧光适配体传感器：将适配体修饰的金纳米粒和适配体互补链修饰的碳点按1:3:～3:1的体积比例混合，加入磷酸缓冲液，37℃孵育杂交构建荧光适配体传感器；
b)标准曲线的绘制：在步骤a)构建的传感器中，加入多个不同已知浓度的腺苷溶液使体系内腺苷浓度在0nmol/L～500nmol/L范围内，室温孵育20min～60min，测定各自的荧光强度值F，同时测定空白荧光值F0，作相对荧光强度[(F-F0)/F0]与腺苷浓度对应的标准曲线；
c)荧光检测腺苷：在步骤a)构建的传感器中，加入未知腺苷浓度的溶液，测定其荧光强度值，根据步骤b)所述标准曲线得到待测溶液中腺苷的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的荧光传感器检测腺苷的方法，其特征在于，aptamer-AuNPs作为能量受体和识别探针，ssDNA-CDs作为能量供体和荧光探针，利用加入腺苷前后体系荧光信号的变化，实现对目标物的定量检测。
3.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的荧光传感器检测腺苷的方法，其特征在于，腺苷核酸适配体序列为5’-SH-C6-AGA GAA CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGG AAG GT-3’，所述适配体互补链序列为5’-NH2-C6-ACC TTC CTC CGC-3’。
4.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的荧光传感器检测腺苷的方法，其特征在于步骤a)中，aptamer-AuNPs和ssDNA-CDs的总体积范围在50μL～150μL。
5.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的荧光传感器检测腺苷的方法，其特征在于步骤a)中，磷酸缓冲液浓度范围在10mmol/L～50mmol/L，体积范围在50μL～200μL，pH范围在6.5～7.5。
6.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的荧光传感器检测腺苷的方法，其特征在于步骤a)中，孵育杂交的时间范围在30min～60min。
7.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的荧光传感器检测腺苷的方法，其特征在于体系内腺苷浓度梯度为：10nM，25nM，150nM，250nM，350nM，500nM。
8.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体的荧光传感器检测腺苷的方法，其特征在于步骤b)或c)中，荧光检测条件为：测定体系在460nm处的荧光强度，激发波长为365nm，扫描速度为1200nm min-1，光电倍增管电压为700V，激发狭缝和发射狭缝宽度为5nm。
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