CN110669499A - 一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针及其制备方法和应用。荧光适配体探针由普鲁士蓝纳米粒子络合修饰FAM荧光团的适配体构成。其制备方法为:将普鲁士蓝纳米粒子与修饰FAM荧光团的适配体在HEPEs缓冲液体系中避光孵育后,采用BSA封闭,即得。将荧光适配体探针可以实现肿瘤、乳腺癌、血糖、阿尔兹海默症等各种标志物的检测,具有信号强、特异性高、灵敏度高、检测浓度范围广、生物安全性好等优点,有利于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光适配体探针,特别涉及一种基于普鲁士蓝纳米粒子对FAM荧光团具有荧光猝灭作用构建的用于标志物荧光检测的荧光适配体探针,还涉及一种通过荧光信号的变化来检测各种标志物的方法,属于生物纳米技术传感领域。
背景技术
近几年随着纳米技术的开发和研究,基于纳米材料的荧光适配体传感器得到了广泛的关注。各种纳米材料,例如金纳米颗粒(Hao W.,Yongxiang W.,Jianyu J.,et al.Goldnanoparticle-based colorimetric and"turn-on"fluorescent probe for mercury(II)ions in aqueous solution[J],Analytical Chemistry,2008,80(23):9021-9028.),CeO2(Pautler R.,Kelly E.Y.,Huang P.J.,et al.Attaching DNA to nanoceria:regulatingoxidase activity and fluorescence quenching[J],Acs Appl Mater Interfaces,2013,5(15):6820-6825.),Fe3O4(Ghaemi M.,Absalan G.Study on the adsorption ofDNA on Fe 3O 4nanoparticles and on ionic liquid-modified Fe 3O 4nanoparticles[J],Microchimica Acta,2014,181(1-2):45-53.),ZnO(WAHAB,Rizwan,KIM,et al.A non-aqueous synthesis,characterization of zinc oxide nanoparticles and theirinteraction with DNA[J],Synthetic Metals,2009,159(23):2443-2452.),TiO2(Xu Z.,Feng W.,Biwu L.,et al.Adsorption of DNA oligonucleotides by titanium dioxidenanoparticles[J],Langmuir,2014,30(3):839-845.),碳纳米管(Ravi S.,Davide P.,David M.C.,et al.Binding and condensation of plasmid DNA onto functionalizedcarbon nanotubes:toward the construction of nanotube-based gene deliveryvectors[J],J Am Chem Soc,2005,127(12):4388-4396.)和氧化石墨烯(Guo Y.,ZhangX.,Wu F.G.A graphene oxide-based switch-on fluorescent probe for glutathionedetection and cancer diagnosis[J],Journal of Colloid&Interface Science,2018,530(S0021979718306891-.),被用来制造荧光生物传感器。通常,用于小分子和生物标志物的生物传感器是通过监视由于引入靶标而引起的荧光强度变化来实现的,该靶标可以恢复由于纳米材料和荧光分子的接近而变化的荧光强度。2011年,Nuo Duan开发了一种灵敏且特异性的荧光共振能量转移(FRET)适配体传感器,该传感器基于染料标记的ssDNA与适配体缀合的Au纳米颗粒杂交,用于检测ch曲毒素A(OTA),检出限为2×10-12g.mL-1(Duan N.,WuS.,Ma X.,et al.Gold Nanoparticle-Based Fluorescence Resonance Energy TransferAptasensor for Ochratoxin A Detection[J],Analytical Letters,2012,45(7):714-723.)。李星开发了一种基于DSAI和氧化石墨烯(GO)的荧光适配体传感器,用于选择性,灵敏地检测目标DNA和凝血酶蛋白(Li X.,Ma K.,Zhu S.,et al.Fluorescent AptasensorBased on Aggregation-Induced Emission Probe and Graphene Oxide[J],AnalyticalChemistry,2014,86(1):298-303.)。朱淑云制造了一种基于单壁碳纳米角的新型荧光适配体传感器(Zhu S.,Han S.,Zhang L.,et al.A novel fluorescent aptasensor based onsingle-walled carbon nanohorns[J],Nanoscale,2011,3(11):4589-4592.)。该凝血酶适配体传感器以高灵敏度和优异的选择性成功地用于凝血酶的检测,其检测限低至100pM。基于纳米材料的荧光适配体的感测方法能够选择性和灵敏地检测目标。虽然这些材料在提高检测灵敏度、降低检测限或者提高选择性等方面有较大贡献。它们在稳定性、生物兼容性以及合成成本等方面的不足,严重限制了它们在实际中的应用。因此,需要探索一种更安全、更合适的纳米材料,以开发出一种经济有效、稳定、简单、更适用于生物标志物检测的荧光适配体传感器。
相对而言,普鲁士蓝纳米粒子(PBNPs)作为一种具有多种优良特性的纳米材料,包括稳定性好、生物相容性和可降解性优良、细胞毒性低、形貌可控、廉价易得(Qin Z.,YanL.,Ning G.Progress in Applications of Prussian Blue Nanoparticles inBiomedicine[J],Advanced Healthcare Materials,2018,1800347),已在纳米酶(YangF.,Hu S.,Zhang Y.,et al.A Hydrogen Peroxide-Responsive O2 Nanogenerator forUltrasound and Magnetic-Resonance Dual Modality Imaging[J],AdvancedMaterials,2012,24(38):5205.)、光热转换剂(Fu G.,Liu W.,Feng S.,et al.Prussianblue nanoparticles operate as a new generation of photothermal ablationagents for cancer therapy[J],Chem Commun(Camb),2012,48(94):11567-11569)以及电催化材料(Qiu J.D.,Peng H.Z.,Liang R.P.,et al.Synthesis,Characterization,andImmobilization of Prussian Blue-Modified Au Nanoparticles:Application toElectrocatalytic Reduction of H 2O 2[J],Langmuir the Acs Journal of Surfaces&Colloids,2007,23(4):2133-2137.)的等许多领域得到广泛应用。更重要的是,PBNPs已被美国食品药品管理局(FDA)批准用于临床上放射性治疗(Shokouhimehr M.,SoehnlenE.S.,Hao J.,et al.Dual purpose Prussian blue nanoparticles for cellularimaging and drug delivery:a new generation of T1-weighted MRI contrast andsmall molecule delivery agents[J],Journal of Materials Chemistry,2010,20(25):5251-5259.),是典型的安全有效的药物。到目前为止,还未见普鲁士蓝纳米粒子与修饰FAM荧光团适配体构建荧光探针的技术。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷,本发明的第一个目的是在于提供一种信号强,特异性高,检测浓度范围广,可以实现标志物高灵敏度检测的纳米荧光适配体探针。
本发明的第二个目的是在于提供一种低成本、操作简单的构建纳米荧光适配体探针的方法。
本发明的第三个目的是在于提供一种纳米荧光适配体探针的应用,实现了对肿瘤标志物、乳腺癌标志物、血糖标志物或阿尔兹海默症标志物等的特异性荧光检测,具有信号强、特异性高、灵敏度高、检测浓度范围广、生物安全性好等优点,有利于推广应用。
为了实现上述技术目的,本发明提供了一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针,其由普鲁士蓝纳米粒子络合修饰FAM荧光团的适配体构成。
本发明的适配体是与各种生物标志物对应的适配体,如肿瘤标志物、乳腺癌标志物、血糖标志物、阿尔兹海默症标志物等等。该荧光适配体探针适应于现有技术中一般常见生物标志物的检测,只需采用标志物相应的适配体,修饰FAM荧光团与普鲁士蓝纳米粒子络合即可得到荧光适配体探针。
本发明还提供了一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针的构建方法,该方法是将普鲁士蓝纳米粒子与修饰FAM荧光团的适配体在HEPEs缓冲液体系中避光孵育后,采用BSA封闭,即得。
优选的方案,修饰FAM荧光团的适配体与普鲁士蓝纳米粒子的反应比为1nmol:1~2g。适配体的浓度优选为50nM,需要的普鲁士蓝纳米粒子(PBNPs)的浓度为50~100μg.mL-1,更优选的方案是90μg.mL-1。两者的体积比为1:0.8~1.2。
优选的方案,所述避光孵育的温度为4~37℃,时间为30~80min。优选为20~30℃;更优选为25℃。时间优选为50~70min,最优选为60min。
较优选的方案,修饰FAM荧光团的适配体与PBNPs结合的反应pH环境为5.6~9.0,更优选为7.6。
优选的方案,所述普鲁士蓝纳米粒子由Fe(NO3)3溶液滴加至温度为55~65℃的K4[Fe(CN)6]溶液中搅拌反应得到。本发明的方法制备的普鲁士蓝纳米粒子(PBNPs)具有均匀的纳米尺寸,且具有立方体结构。
优选的方案,Fe(NO3)3溶液滴加时间为5~15min,滴加完成后继续搅拌反应3~8min。
优选的方案,K4[Fe(CN)6]和Fe(NO3)3等摩尔比反应。
本发明的普鲁士蓝纳米粒子可以在柠檬酸存在下,50~60℃反应,得到尺寸均一的普鲁士蓝纳米粒子。但是,没有柠檬酸存在下,将等摩尔比的K4[Fe(CN)6]滴加到55~65℃恒温的Fe(NO3)3中反应同样可以得到尺寸均一的普鲁士蓝纳米粒子,且得到的普鲁士蓝纳米粒子能吸附更多的适配体DNA。由此,本发明最优选在没有添加柠檬酸条件下反应制备普鲁士蓝纳米粒子。
本发明还提供了一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针的应用,本发明的应用以非治疗或疾病诊断为目的,将其作为荧光检测探针应用于标志物荧光检测。
优选的方案,将普鲁士蓝纳米粒子络合修饰FAM荧光团的适配体,应用于与适配体对应的标志物的荧光检测。
较优选的方案,所述的标志物为肿瘤标志物、乳腺癌标志物、血糖标志物或阿尔兹海默症标志物,所述适配体为所述标志物对应的适配体。
较优选的方案,将荧光适配体探针(如适配体AM-AptAβ)与一系列不同浓度的标准(如阿尔兹海默症标志物-Aβ40O)标志物溶液在一定酸度、温度条件下反应后,进行荧光强度检测,得到一系列荧光信号值,建立标志物溶液浓度与荧光信号值的标准曲线;再将荧光适配体探针与待测标志物溶液反应后,进行荧光检测,得到的荧光信号值,并根据标准曲线,计算出待测标志物溶液的浓度。
较优选的方案,荧光适配体探针与标志物结合的反应温度为4~37℃,更优选为25℃。
较优选的方案,荧光适配体探针与标志物结合的反应的pH环境为5.6~9.0,更优选为pH为7.6。
较优选的方案,荧光适配体探针与标志物结合的反应时间为20~80min,更优选为60min。
本发明的荧光适配体探针主要基于发明人在实验研究中发现PBNPs拥有猝灭荧光团的能力,并且PBNPs还可以通过金属-磷酸键络合大量DNA链。在此基础上,通过选择能够与标志物特异性识别的适配体DNA,并在适配体DNA修饰荧光基团,将其与PBNPs构建荧光适配体探针。通过铁离子与磷酸根基团的络合作用使尽可能多的FAM-适配体与PBNPs结合,构建FAM-适配体@PBNPs。当FAM-适配体与PBNPs结合时,PBNPs可以使靠近的荧光团FAM荧光猝灭;当与适配体对应的标志物存在时,由于FAM-适配体特异性结合并自动将标志物包裹形成FAM-适配体/标志物复合物,使得FAM-适配体将脱离PBNPs表面,使得FAM与PBNPs的距离拉大,从而导致荧光恢复,通过荧光信号的变化来检测阿尔兹海默症标志物的含量。利用该原理,实现标志物特异性荧光检测,检测下限可达到1nM,并且在1nM~100nM范围之间,荧光强度随着浓度的增加呈线性增强,检测范围相对传统的方法较宽。
本发明的亚铁氰化钾(K4[Fe(CN)6])和硝酸铁(Fe(NO3)3)可购买于Sigma-Aldrich(St Louis,MO)。本发明的HEPEs缓冲液为现有常规的(25mM,pH 7.6,100mM NaCl,1mMMgCl2)。
优选的方案,将PBNPs与FAM-适配体混匀,20~30℃条件下避光孵育30~80min,加入500~2000nM的BSA共孵育30~80min封闭空余位点,即得到纳米荧光探针FAM-适配体@PBNPs。更优选的方案,将FAM-适配体加到PBNPs中混匀,放于25℃恒温水浴锅中避光孵育1h,加入700nM的BSA孵育1h,即可检测其荧光信号,经实验证明此方法合成纳米荧光探针FAM-适配体@PBNPs仅需2h,整个纳米荧光探针FAM-适配体@PBNPs体系2h即可达到稳定。
本发明的FAM-适配体包含能够与标志物特异性识别的DNA适配体链和修饰的FAM荧光团。FAM本身有荧光信号,可用作信号分子。标志物的磷酸骨架可以通过金属磷酸键吸附到PBNPs表面,也可以特异性的识别标志物。ON-OFF-ON的信号转变,可以实现纳米荧光探针对标志物的特异性检测。
本发明的PBNPs可以通过络合作用来吸附磷酸基团,而DNA寡核苷酸是具有生物活性的多聚磷酸盐,由此,DNA链可以被吸附到PBNPs表面。
本发明的PBNPs具有对荧光团的猝灭能力。相对于作为能量供体的荧光团,PBNPs可以作为能量受体。二者接触之后,激发后的能量由供体转移到受体,从而实现荧光的猝灭。本发明通过对不同条件下的DNA在PBNPs上的结合以及与标志物结合导致脱附的差异,并以此为基础提出了一种基于PBNPs的纳米荧光适配体传感器,可以用于对各种标志物的检测。
相对现有技术,本发明的技术方案带来的有益技术效果:
本发明通过构建特殊的FAM-适配体@PBNPs荧光探针,实现了对各种标志物的特异性的荧光检测,具有信号强、特异性高、灵敏度高、检测浓度范围广、生物安全性好等优点,有利于推广应用。
本发明通过利用PBNPs能使靠近的荧光团FAM荧光猝灭,当荧光团远离PBNPs表面时荧光信号恢复的特性,结合适配体DNA既能作为多聚磷酸盐与PBNPs结合,又能被标志物特异性识别的特点,构建了FAM-适配体@PBNPs纳米荧光探针,实现了标志物特异性荧光检测,具有检测下限低,检测范围广的特点,检出下限可达到1nM,并且在1nM~100nM范围之间,反应体系荧光强度随着浓度的增加呈线性增强,检测范围相对传统的方法较宽。
本发明提供的纳米荧光适配体探针以立方体的PBNPs载体,其稳定性好,比表面积大,合成成本低,有效的改善了现有技术成本高和稳定性低的问题;并且应用核酸适配体的高选择性和特异性的特点可以有效改善现有技术灵敏度低和检测限的问题。
本发明通过荧光信号变化的方法检测阿尔兹海默症等标志物,性质更稳定,操作更为简便,有利于推广应用。
附图说明
【图1】为通过荧光信号变化的方法检测阿尔兹海默症标志物的实验方法的示意图。
【图2】为PBNPs的TEM图。
【图3】为PBNPs在吸附适配体DNA前后的红外对比图。
【图4】为FAM-AptAβ与PBNPs结合以及FAM-AptAβ@PBNPs与Aβ40O结合的在不同pH下的荧光信号变化图。
【图5】为FAM-AptAβ与PBNPs结合以及FAM-AptAβ@PBNPs与Aβ40O结合的在不同温度下的荧光信号变化图。
【图6】为FAM-AptAβ与PBNPs结合以及FAM-AptAβ@PBNPs与Aβ40O结合的在反应不同时间的荧光信号变化图。
【图7】为FAM-AptAβ以及FAM-AptAβ@PBNPs荧光探针加入不同浓度标准蛋白前后的荧光图。
【图8】为对目标物和干扰物做的特异性检测图。
【图9】为在一定浓度范围内检测阿尔兹海默症标志物Aβ40O含量的荧光图。
【图10】为一定浓度范围内检测阿尔兹海默症标志物Aβ40O含量的线性关系图。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明内容,而不是限制本发明权利要求的保护范围。
以下实施例涉及的修饰FAM的Aβ40O适配体AptAβ直接购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。Aβ40O、Aβ42O、Aβ40M和Aβ42M购买于杭州丹港生物有限公司(中国杭州)。
实施例1
普鲁士蓝纳米粒子的制备方法,步骤如下:
取20mL,1mM的K4[Fe(CN)6]水溶液,加热至60℃;逐滴加入20mL,1mM Fe(NO3)3水溶液;滴加过程持续10min左右,并保持搅拌。5min之后移去热源,保持搅拌冷却至室温;所述溶液用水和乙醇交替洗涤3次,然后真空干燥即可得到所需的普鲁士蓝纳米粒子。
纳米荧光探针FAM-AptAβ@PBNPs的制备方法,步骤如下:
取10μL的FAM-AptAβ(500nM)、9μL PBNPs(1mg.mL-1)与74μL HEPEs缓冲液(25mM,pH7.6,100mM NaCl,1mM MgCl2)混合,25℃避光孵育60min,,加入7μL BSA(10μM),继续孵育60min,既得所述纳米荧光探针。
Aβ40O的检测步骤如下:
将所述的纳米荧光探针体系离心,移去上清液,分别加入不同浓度的Aβ40O,反应60min后检测其荧光信号。
特异性检测步骤如下:
将所述的纳米荧光探针体系离心,移去上清液,分别加入不同阿尔兹海默症标志物Aβ40O(Aβ40oligomer,50nM)、Aβ42O(Aβ42oligomer,5μM)、Aβ40M(Aβ40monomer,5μM)、Aβ42M(Aβ42monomer,5μM),60min后检测荧光信号。
建立坐标曲线步骤如下:
用HEPEs缓冲液(25mM,pH 7.6,100mM NaCl,1mM MgCl2)配置不同浓度的Aβ40O溶液,每个溶液取相同体积加入到FAM-AptAβ@PBNPs荧光探针溶液中,60min后检测其荧光信号,重复3组实验,用origin软件做出线性拟合曲线图。
待测溶液检测步骤如下:
用6脑脊液样本(其中三个存在阿尔兹海默症)制备待测溶液,每个溶液取相同体积加入到FAM-AptAβ@PBNPs荧光探针溶液中,60min后检测其荧光信号。
从图2可以看出所合成的PBNPs为尺寸均一的立方体结构。
从图3可以看出a为PBNPs的红外吸收图,其特征吸收峰在2084cm-1、490cm-1和600cm-1;b为FAM-AptAβ@PBNPs的红外吸收图,相对于a,多出来的1040cm-1、1186cm-1为FAM-AptAβ的磷酸骨架的吸收峰。
从图4可以看出a为FAM-AptAβ的荧光图,在520nm处有最大发射;b为FAM-AptAβ@PBNPs的荧光图,PBNPs可以最大程度的是FAM的荧光猝灭;c、d、e分别为加入不同浓度标准蛋白的荧光图,不同浓度对应不同的荧光信号的恢复。
从图5可以看出所构建的纳米荧光探针只对阿尔兹海默症标志物Aβ40O有特异性结合,实验干扰小。
从图6可以看出荧光信号随着Aβ40O浓度增大而增大。
从图7可以看出在一定的浓度范围内Aβ40O与其所对应的响应信号有一定的线性关系。
Claims (9)
1.一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针,其特征在于:由普鲁士蓝纳米粒子络合修饰FAM荧光团的适配体构成。
2.权利要求1所述的一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针的构建方法,其特征在于:将普鲁士蓝纳米粒子与修饰FAM荧光团的适配体在HEPEs缓冲液体系中避光孵育后,采用BSA封闭,即得。
3.根据权利要求2所述的一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针的构建方法,其特征在于:修饰FAM荧光团的适配体与普鲁士蓝纳米粒子的反应比为1nmol:1~2g。
4.根据权利要求2所述的一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针的构建方法,其特征在于:所述避光孵育的温度为4~37℃,时间为30~80min。
5.根据权利要求2~4任一项所述的一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针的构建方法,其特征在于:所述普鲁士蓝纳米粒子由Fe(NO3)3溶液滴加至温度为55~65℃的K4[Fe(CN)6]溶液中搅拌反应得到。
6.根据权利要求5所述的一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针的构建方法,其特征在于:Fe(NO3)3溶液滴加时间为5~15min,滴加完成后继续搅拌反应3~8min。
7.权利要求1所述的一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针的应用,其特征在于:以非治疗或疾病诊断为目的,作为荧光检测探针应用于标志物荧光检测。
8.权利要求7所述的一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针的应用,其特征在于:将普鲁士蓝纳米粒子络合修饰FAM荧光团的适配体,应用于与适配体对应标志物的荧光检测。
9.权利要求8所述的一种基于普鲁士蓝纳米粒子的荧光适配体探针的应用,其特征在于:所述的标志物为肿瘤标志物、乳腺癌标志物、血糖标志物或阿尔兹海默症标志物,所述适配体为所述标志物对应的适配体。
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