CN114163843A - 一种hmpb的制备方法、普鲁士蓝基荧光探针及其制备方法 - Google Patents

一种hmpb的制备方法、普鲁士蓝基荧光探针及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种HMPB的制备方法、普鲁士蓝基荧光探针及其制备方法，包括将FITC与去离子水混合超声，均匀后加入HMPB，再次超声均匀后得到混合液；放入恒温振荡器，孵育过夜；离心、洗涤，将所得沉淀分散在去离子水中，即可得到加载有FITC的HMPB。本发明可应用于水溶液以及细胞内的检测，具有较快的响应时间、较好的选择性和灵敏度，在体外检测以及胞内成像中具有广阔的应用前景。

Description

一种HMPB的制备方法、普鲁士蓝基荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及荧光纳米探针领域，具体地说，涉及一种用于次氯酸检测的HMPB的制备方法、普鲁士蓝基荧光探针及其制备方法。
背景技术
人体内许多的生理及病理过程需要活性氧(ROS)或活性氮(RNS)的参与。次氯酸(HClO/ClO-)是人体内最重要的ROS之一，在不同的生理以及各种病理过程中起着关键作用。内源性HClO/ClO-是由髓过氧化物酶(MPO)在人体内中催化H2O2促进氯离子(Cl-)的过氧化产生的。在正常浓度下，HClO/ClO-作为免疫防御过程的一部分，发挥着清除侵入性细菌和病原体的重要作用。然而，过量的HClO/ClO-会通过氧化或氯化作用破坏正常组织细胞的核酸、蛋白质和脂质等的结构，导致组织损伤。这些组织损伤大多与炎症、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、癌症等疾病有关。
普鲁士蓝纳米材料本身具有优异的磁共振造影和光热疗功能，中空介孔普鲁士蓝纳米颗粒(HMPB)作为药物载体被广泛应用于可控的药物扩散。
因此，开发一种可针对次氯酸进行实时检测成像的基于普鲁士蓝的反应型荧光探针，对于进一步探究其生理功能及与重大疾病病理过程的内在关系具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种可用于次氯酸检测的HMPB的制备方法、普鲁士蓝基荧光探针及其制备方法。
根据本发明的一方面，提供了一种HMPB的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将聚吡咯烷酮与水混合，搅拌均匀后滴加盐酸，使其pH＝2，继续搅拌均匀后加入铁氰化钾，再次搅拌均匀；
步骤2，将步骤1所得溶液置于聚四氟乙烯反应釜中，加热反应后，自然冷却至室温；随后进行离心、洗涤，取初步沉淀定量；
步骤3，取步骤2所得初步沉淀分散在水中，加入聚吡咯烷酮，搅拌均匀后加入盐酸；
步骤4，将步骤3的混合液倒入聚四氟乙烯内衬中，加热反应后冷却至室温；随后进行离心、洗涤，取沉淀即得HMPB。
优选的：所述步骤1中的聚吡咯烷酮、水、铁氰化钾的质量比为5～10:60～100:0.1～0.2。
优选的：所述步骤2中的加热温度为80～100℃，加热时间为1.5～3h。
优选的：所述步骤3中的初步沉淀、聚吡咯烷酮、去离子水的质量比为1:10～20:800～1000。
优选的：所述步骤3中的盐酸浓度为1～2M。
优选的：所述步骤4中的加热温度为100～150℃，加热时间为1～3h。
优选的：所述步骤2和步骤4中均采用质量比为1:1的乙醇与水的混合溶液洗涤。
根据本发明的另一方面，提供了一种普鲁士蓝基荧光探针：包括如上所述的HMPB，所述HMPB中加载有FITC。
根据本发明的另一方面，提供了一种如上述的普鲁士蓝基荧光探针的制备方法：包括以下步骤：
步骤1，将FITC与去离子水混合超声，均匀后加入HMPB，再次超声均匀后得到混合液；
步骤2，将步骤1的混合液放入恒温振荡器，孵育过夜；
步骤3，将步骤2所得溶液离心、洗涤，将所得沉淀分散在去离子水中，即可得到加载有FITC的HMPB。
优选的：所述步骤1中的FITC、去离子水、HMPB的质量比为1～10:5000:5～20。
本发明的一种HMPB的制备方法、普鲁士蓝基荧光探针及其制备方法，具有以下优点：
(1)本发明技术方案所得中空介孔普鲁士蓝纳米颗粒及普鲁士蓝基荧光探针的粒径可控制在160-210nm，生物相容性好，具有较大比表面积以及孔容，对FITC具有较高的负载率(20-30wt％)，能够有效实现信号放大。
(2)本发明技术方案所得中空介孔普鲁士蓝纳米颗粒及普鲁士蓝基荧光探针在水溶液中分散性良好，与传统的小分子探针相比，无需改性即可应用于水溶液以及细胞内的检测，在体外检测以及胞内成像中具有广阔的应用前景。
(3)与现有荧光探针相比，本发明技术方案所得次氯酸荧光探针具有较快的响应时间，和较好的选择性和灵敏度。
(4)本发明技术方案所得荧光探针合成简单，可重复性强，可大批量制备。同时，本荧光探针使用简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现检测。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显。
图1为本发明实施例制备的FITC@HMPB荧光探针及FITC、HMPB的紫外吸收光谱图；
图2为本发明实施例制备的FITC@HMPB荧光探针的普鲁士蓝纳米壳的透射电镜图；
图3为本发明实施例制备的FITC@HMPB荧光探针的普鲁士蓝纳米壳的X射线衍射图谱，其中纵坐标的单位为a.u.；
图4为本发明实施例制备的FITC@HMPB荧光探针加入不同浓度的次氯酸后的荧光强度对比图，其中由下至上的曲线分别代表对0μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM次氯酸储备液的荧光强度(FL强度)曲线；
图5为本发明实施例制备的FITC@HMPB荧光探针加入其它活性分子和次氯酸的荧光强度图，其中横坐标1、2、3、4、5、6、7、8分别代表Blank(空白)、TBHP(过氧化氢叔丁醇)、ROO·、NO、H2O2、·OH、ONOO-、ClO-，浓度均为500μM；
图6为本发明实施例制备的FITC@HMPB荧光探针的对照试验的激光共聚焦显微镜成像图，其中1组是指Blank组，即不加探针及NaClO的空白对照组、2组是指Probe，即加了50ppm探针的阴性对照组、3组是指Probe+NaClO，即加了50ppm探针以及100μM NaClO的实验组、a是指Bright field，即明场像、b是指Fluorescence，即荧光通道的成像、c是指Overlap，即明场与荧光的重叠像。
具体实施方式
现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的实施方式。相反，提供这些实施方式使得本发明将全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。在图中相同的附图标记表示相同或类似的结构，因而将省略对它们的重复描述。
在本发明的实施例中，提供了一种普鲁士蓝基荧光探针FITC@HMPB：包括HMPB，HMPB中加载有FITC。
普鲁士蓝分子式为Fe4[Fe(CN)6]3，HMPB中空介孔结构，粒径为160-210nm。
FITC结构式为：
Figure BDA0003387874670000041
普鲁士蓝可与次氯酸进行氧化还原反应，用于检测次氯酸浓度，同时FITC的引入放大了浓度信号。
一种普鲁士蓝基荧光探针FITC@HMPB制备方法，包括以下步骤：
制备HMPB：
步骤1，将聚吡咯烷酮(聚乙烯吡咯烷酮，简称PVP)与水混合，搅拌均匀后滴加盐酸，使其pH＝2，继续搅拌均匀后加入铁氰化钾，再次搅拌均匀；
优选盐酸为市售浓盐酸，浓度为12M，混合液最终盐酸浓度为6M。
优选聚吡咯烷酮、水、铁氰化钾的质量比为5～10:60～100:0.1～0.2，并优选为6:80:0.18。进一步优选铁氰化钾180mg；聚吡咯烷酮分子量为K30，用量为6g；水的体积为80ml。
步骤2，将步骤1所得溶液置于聚四氟乙烯反应釜中，加热反应后，自然冷却至室温；随后进行离心、洗涤，取初步沉淀定量；
优选反应釜内衬容量为100ml。
优选加热反应加热温度为80～100℃，加热时间为1.5～3h。进一步优选加热温度为80℃，加热时间为2h。
并优选离心转速为13000rpm，离心时间为10～15min。采用质量比为1:1的乙醇与水的混合溶液洗涤，洗涤次数为2次。
步骤3，取步骤2所得初步沉淀分散在水中，加入聚吡咯烷酮，搅拌均匀后加入盐酸；
优选初步沉淀、聚吡咯烷酮、去离子水的质量比为1:10～20:800～1000。并优选沉淀、聚吡咯烷酮、去离子水的质量比为1:10:1000。进一步的，优选初步沉淀质量为60mg；去离子水体积为60ml，聚吡咯烷酮分子量为K30；质量为600mg。
优选所用盐酸为市售浓盐酸，浓度为12M，混合液最终盐酸浓度为1M。
步骤4，将步骤3的混合液倒入聚四氟乙烯内衬中，加热反应后冷却至室温；随后进行离心、洗涤，取沉淀即得HMPB。
优选聚四氟乙烯内衬的容量为100ml。加热反应的加热温度为100～150℃，加热时间为1～3h。并优选加热温度为135℃，加热时间为180min。
优选离心转速为13000rpm，离心时间为10～12min。洗涤采用质量比为1:1的乙醇与水的混合溶液洗涤，洗涤次数为3次。
制备FITC@HMPB：
步骤5，将FITC与去离子水混合超声，均匀后加入HMPB，再次超声均匀后得到混合液；
优选FITC、去离子水、HMPB的质量比为1～10:5000:5～20。并优选为质量比为1:5000:5，进一步的，FITC的质量为1mg，去离子水为5ml，HMPB为5mg。
步骤6，将步骤5的混合液放入37度恒温振荡器，孵育过夜；
优选孵育时间为8-12h，且全程避光孵育。
步骤7，将步骤6所得溶液离心、洗涤，将所得沉淀分散在去离子水中，即可得到加载有FITC的HMPB。
优选离心转速为13000rpm，离心时间为12min。
并优选洗涤用5ml去离子水洗涤，洗涤次数1次，最后将沉淀分散在5ml水中。
本发明实施例的一种HMPB的制备方法、普鲁士蓝基荧光探针及其制备方法，可应用于水溶液以及细胞内的检测，具有较快的响应时间、较好的选择性和灵敏度，在体外检测以及胞内成像中具有广阔的应用前景。
下面以具体的实施例描述本发明：
实施例1
(1)HMPB的制备：称取6g PVP(K30)溶于80ml去离子水中，搅拌均匀后形成无色透明的反应液，然后滴加盐酸(12M)使反应液pH＝2，而后加入180mg铁氰化钾粉末，搅拌均匀后将反应液转移至聚四氟乙烯内衬反应釜中，拧紧置于烘箱中，在80℃下加热2h，冷却至室温，得到深蓝色液体，用质量比为1:1的水与乙醇的混合溶液洗去多余的PVP后即可得到实心立方形貌的普鲁士蓝纳米颗粒。
(2)为了得到HMPB，采用保护刻蚀的方法。将60mg实心普鲁士蓝纳米颗粒与60ml去离子水以及600mg PVP以及1M HCl混合，搅拌均匀后将反应液转移至聚四氟乙烯内衬反应釜，拧紧置于烘箱中，在135℃下加热3h，冷却至室温，得到颜色稍浅的深蓝色液体，用质量比为1:1的水与乙醇的混合溶液洗去多余的PVP后即得到HMPB。
(3)称取1mg FITC溶于5ml去离子水中，得到FITC的水溶液。将实施例1制备的5mgHMPB分散在5ml FITC的水溶液中，超声均匀后放入37℃恒温振荡器孵育过夜。以上操作全程避光。
将溶液13000rpm转速离心12min；用5ml去离子水洗涤1次，将所得沉淀分散在5ml水去离子水中，即可得到加载有FITC的HMPB。
如图1中所示，本发明的实施例的HMPB在负载FITC后，在488nm处的吸收值明显抬起，证明FITC被HMPB成功负载。
如图2中所示，本发明的实施例的HMPB粒径在160-210nm间，分散性良好。
如图3中所示，本发明的实施例的HMPB的结晶度良好。
测试1：
在2ml的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，0.01M，pH＝5.5)缓冲溶液中分别配置浓度为0μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM的次氯酸储备液。向次氯酸溶液中分别加入50ppm的本发明实施例1的FITC@HMPB(50ppm指HMPB的浓度为50ppm)，两分钟后记录荧光强度变化。
由图4中可知，本发明实施例的FITC@HMPB荧光探针灵敏度高，荧光强度与次氯酸浓度呈良好线性，线性区间为0-50μM。
测试2：
为了测试本发明实施例的FITC@HMPB探针对其他活性分子和次氯酸的选择性，在2ml的Tris-HCl(0.01M，pH＝5.5)缓冲溶液中分别加入其他活性小分子和次氯酸(0.5mM)，再分别加入50ppm本发明实施例1的FITC@HMPB。
由图5可知，只有加入次氯酸时，本发明实施例的荧光探针的荧光强度才会发生明显变化，说明该探针具有很好的选择性。
对照测试：
实验组：将4T1细胞用50ppm本发明实施例1的探针孵育2.5h，随后加入外源性的次氯酸根100μM(NaClO)，孵育半小时；细胞分别用PBS缓冲液洗三遍，使用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，收集520nm的荧光。
对照组：将4T1细胞用50ppm的探针孵育2.5h，随后加入与实验组中次氯酸溶液等体积的PBS缓冲液；细胞分别用PBS缓冲液洗三遍，使用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，收集520nm的荧光，收集绿色通道荧光，然后进行叠加分析。
在荧光成像中，荧光场像中颜色越明亮代表荧光强度越强。由图6中可知，与空白对照组1相比，用阴性对照组2在激发下显示出微弱的荧光。而实验组3中可以清楚地观察到强烈的荧光，并且在重叠像中可以看到荧光与细胞有很好的重叠。表明本发明实施例的FITC@HMPB探针可以穿透细胞膜并在细胞环境中与HOCl反应，发出明亮的荧光。以上结果表明本发明实施例的探针能够检测活细胞中的HOCl。
综上，本发明的实施例的HMPB的制备方法、普鲁士蓝基荧光探针及其制备方法，可应用于水溶液以及细胞内的检测，具有较快的响应时间、较好的选择性和灵敏度，在体外检测以及胞内成像中具有广阔的应用前景。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种HMPB的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将聚吡咯烷酮与水混合，搅拌均匀后滴加盐酸，使其pH＝2，继续搅拌均匀后加入铁氰化钾，再次搅拌均匀；
步骤2，将步骤1所得溶液置于聚四氟乙烯反应釜中，加热反应后，自然冷却至室温；随后进行离心、洗涤，取初步沉淀定量；
步骤3，取步骤2所得初步沉淀分散在水中，加入聚吡咯烷酮，搅拌均匀后加入盐酸；
步骤4，将步骤3的混合液倒入聚四氟乙烯内衬中，加热反应后冷却至室温；随后进行离心、洗涤，取沉淀即得HMPB。
2.根据权利要求1所述的HMPB的制备方法，其特征在于：所述步骤1中的聚吡咯烷酮、水、铁氰化钾的质量比为5～10:60～100:0.1～0.2。
3.根据权利要求1所述的HMPB的制备方法，其特征在于：所述步骤2中的加热温度为80～100℃，加热时间为1.5～3h。
4.根据权利要求1所述的HMPB的制备方法，其特征在于：所述步骤3中的初步沉淀、聚吡咯烷酮、去离子水的质量比为1:10～20:800～1000。
5.根据权利要求1所述的HMPB的制备方法，其特征在于：所述步骤3中的盐酸浓度为1～2M。
6.根据权利要求1所述的HMPB的制备方法，其特征在于：所述步骤4中的加热温度为100～150℃，加热时间为1～3h。
7.根据权利要求1所述的HMPB的制备方法，其特征在于：所述步骤2和步骤4中均采用质量比为1:1的乙醇与水的混合溶液洗涤。
8.一种普鲁士蓝基荧光探针，其特征在于：包括如权利要求1-7所述的HMPB，所述HMPB中加载有FITC。
9.一种如权利要求8所述的普鲁士蓝基荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，将FITC与去离子水混合超声，均匀后加入HMPB，再次超声均匀后得到混合液；
步骤2，将步骤1的混合液放入恒温振荡器，孵育过夜；
步骤3，将步骤2所得溶液离心、洗涤，将所得沉淀分散在去离子水中，即可得到加载有FITC的HMPB。
10.根据权利要求9所述的普鲁士蓝基荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1中的FITC、去离子水、HMPB的质量比为1～10:5000:5～20。
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