CN105031671B - 基于普鲁士蓝的智能pH触发MRI监测药物释放的协同纳米诊疗剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于普鲁士蓝的智能pH触发MRI监测药物释放的协同纳米诊疗剂及其制备方法，所述纳米诊疗剂包括具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒，以及所述空心介孔普鲁士蓝纳米颗粒的表面包覆的K_xMn_y[Fe(CN)₆]_z，其中0.05≤x≤0.3，0.5≤y≤0.98，z=1，所述纳米诊疗剂形成为核壳结构空心介孔纳米粒子。本发明的HMPB‑Mn纳米诊疗剂具有在肿瘤部位pH响应核磁共振成像和pH响应控制药物释放进行化疗，同时结合热疗，实现核磁共振成像引导下的热疗与化疗结合治疗肿瘤。

Description

基于普鲁士蓝的智能pH触发MRI监测药物释放的协同纳米诊 疗剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及纳米材料技术领域和生物医学材料领域，具体涉及一种基于空心介孔普鲁士蓝的pH响应核磁共振成像(MRI)和光声成像双模式引导下热疗与化疗协同治疗肿瘤的纳米诊疗剂及其制备方法。

背景技术

核磁共振成像是一种无创的成像方式，具有分辨率较高，同时可获得解剖及生理信息等功能，广泛应用于诊疗领域中。目前在临床上，T₁加权造影剂比T₂加权造影剂具有更多的优势，例如很难区分一些黑点的产生是由于T₂造影剂的作用还是由血液的钙化，金属的沉积，或者是其他的一些背底信号引起的。目前使用于临床上的T₁加权造影剂是Magnevist(Gd-DTPA)，但是美国食品与药物管理局(FDA)最近警示，使用钆基造影剂会引起一些肾脏和肝脏疾病等，存在着危害。所以发展新的T₁造影剂是非常有必要的。锰基作为T₁造影剂受到了极大的关注。但是目前的研究当中，锰基材料基本上都是基于锰的氧化物，其毒性较大，生物相容性较差，生物安全性没有保证。且其r₁值较小(一般0.5mM^-1s^-1＞r₁)，比Gd-DTPA的小很多(r₁＝3.4mM^-1s^-1)。锰基造影剂在体内循环的过程中，一直都是有信号的，没有一个靶向性的成像，容易造成误诊。所以寻找一种具有良好生物相容性的高效锰基MRI造影剂是非常有必要的，为推动其临床化应用是非常有意义的。

普鲁士蓝(PB)是一种FDA批准的应用于临床上治疗铊等放射性元素中毒的解毒剂，具有良好生物相容性和生物安全性。PB具有良好的光热转换性能。在空心介孔普鲁士蓝的基础上，引入具有T₁加权MRI造影功能的锰离子，保证了其良好的生物相容性和生物安全性的基础上，其光热转换性能不改变，加上其空心介孔结构和大的比表面积，可以作为药物载体，因此基于普鲁士蓝纳米材料作为纳米诊疗剂具有巨大的应用前景。然而关于在空心介孔普鲁士蓝的基础上引入具有T₁加权MRI造影功能的锰离子，目前还没有报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种具有pH响应核磁共振成像功能监测药物释放和肿瘤光热治疗与化疗协同治疗的空心介孔结构纳米诊疗剂及其制备方法。

在此，一方面，本发明提供一种基于空心介孔普鲁士蓝的pH响应核磁共振成像(MRI)和光声成像双模式引导下热疗与化疗协同治疗肿瘤的纳米诊疗剂(HMPB-Mn)，所述纳米诊疗剂包括具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒，以及在所述空心介孔普鲁士蓝纳米颗粒的表面包覆的锰的普鲁士蓝类似物(K_xMn_y[Fe(CN)₆]_z,简称Mn-PBA，其中0.05≤x≤0.3，0.5≤y≤0.98，z＝1)，最终形成一种核壳结构空心介孔纳米粒子HMPB@Mn-PBA(简称HMPB-Mn)。

本发明中，Mn-PBA具有pH响应释放出锰离子的性能，在pH 7.4的环境下，锰离子的释放量低于20％，在pH 5.0的环境下，锰离子的释放量高达90％，锰离子可以作为一种高效的T₁加权MRI造影剂。经证实，本发明的HMPB-Mn纳米诊疗剂，在pH 7.4环境下，其r₁值为2.94，在pH 5.0的环境下，其r₁值上升到7.39，实现了pH触发的T₁加权MRI造影。因此，本发明的HMPB-Mn纳米诊疗剂能够实现在肿瘤部位pH响应核磁共振成像。

此外，本发明的HMPB-Mn纳米诊疗剂具有优异的光热转换性能。经证实，本发明的HMPB-Mn纳米诊疗剂在近红外光区域λ＝650～970nm，实现光热转换。

而且，本发明的HMPB-Mn纳米诊疗剂还可以作为一种优良的光声成像造影剂。

较佳地，所述纳米诊疗剂的表面带负电荷，所述普鲁士蓝纳米颗粒的粒径范围为100～1000nm，壳层厚度为10～100nm，所述普鲁士蓝纳米颗粒表面具有微孔和介孔，其中微孔的大小为0.5～2nm，介孔的大小为3.2～30nm。

较佳地，在所述纳米诊疗剂中，Fe/Mn的摩尔比在30:1～1:1范围内。

较佳地，所述纳米诊疗剂还装载有抗肿瘤药物和/或基因。

本发明的纳米诊疗剂由于具有巨大的空腔以及介孔结构，可以作为药物载体，实现对肿瘤进行化疗、基因治疗等。例如，对盐酸阿霉素(DOX)的载药量高达1763mg/g。因此，本发明的纳米诊疗剂对肿瘤细胞实现了热疗和化疗的协同治疗。

当本发明的纳米诊疗剂装载有药物时，在pH 5.0的环境下的药物释放量大于pH7.4的环境下的药物释放量，因此本发明的纳米诊疗剂可以实现在肿瘤部位对药物的可控释放。而且，由于本发明的纳米诊疗剂在低的pH环境下能同时释放出锰离子(作为T₁加权MRI造影剂)和抗癌药物(化疗)，因此可以利用T₁加权MRI检测药物的释放，监控肿瘤的治疗。

另一方面，本发明还提供上述纳米诊疗剂的制备方法，包括以下步骤：

1)按质量比例，将1～3份+2价锰盐(如醋酸锰、氯化锰、硝酸锰等)、1～3份柠檬酸钠、100～300份聚乙烯吡咯烷酮或者PEG(包括各种分子量的PEG以及PEG的衍生物)、1～3份表面具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒和水混合搅拌均匀，得到混合溶液；

2)将铁氰化钾在搅拌下加入(优选为逐滴加入)步骤1)所得的混合溶液中，然后继续搅拌2～6小时后，陈化12～36小时；

3)从步骤2)的产物中收集沉淀，即制得所述纳米诊疗剂。

本发明的制备方法原料价格低廉易得、制备方法简单、易于批量生产，能够制备出具有良好分散性和稳定性、良好生物相容性、粒径和孔径可控、优异光热转换性能、明显的核磁共振成像造影性能以及对肿瘤进行光热治疗与化疗协同治疗的多功能纳米诊疗剂。

较佳地，步骤1)中，所述锰盐为醋酸锰、硫酸锰、氯化锰、硝酸锰等。

较佳地，所述表面具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：

A)按质量比例，将0.132～0.396份铁氰化钾和2～10份聚乙烯吡咯烷酮，加入到酸中，混合搅拌均匀后于烘箱中60～100℃陈化，冷却后分离、洗涤，得到具有介孔的普鲁士蓝纳米颗粒；

B)将所得的具有介孔的普鲁士蓝纳米颗粒分散于酸中，在120～140℃陈化后，分离得到表面具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒。

较佳地，步骤A)中，酸的量为30～100份，酸为0.01～2M的盐酸，陈化时间为12～20小时。

较佳地，步骤B)中，酸的量为50～200份，酸为浓度1～2M的盐酸，陈化时间为2～4小时。

较佳地，还包括装载抗肿瘤药物和/或基因的步骤，按质量比例，将1～2份的HMPB-Mn与1～2份抗癌药物和/或基因溶解于50-100份的PBS溶液中，进行磁搅拌1～24小时后，进行离心，洗涤即可获得装载抗癌药物和/或基因的HMPB-Mn。

本发明的有益效果：

本发明的HMPB-Mn纳米诊疗剂具有在肿瘤部位pH响应核磁共振成像和pH响应控制药物释放进行化疗，同时结合热疗，实现核磁共振成像引导下的热疗与化疗结合治疗肿瘤。pH响应释放出的锰离子，具有优异的T₁加权核磁共振成像功能，实现了术前诊断肿瘤和术后评估治疗的功能。pH控制释放药物，更大程度地减少化疗的副作用，提高化疗的治疗效率。pH响应的MRI可以实现对药物释放的监测，从而监测化疗的效果。因此，它解决了传统肿瘤光热治疗中热量在肿瘤内部分布不均对肿瘤消融不完全，导致肿瘤易于复发、化疗毒副作用大等临床应用难题，同时实现了肿瘤治疗的pH响应成像诊断和监控疗效，为肿瘤的安全与高效治疗提供了新技术和新的理论基础。而且，本发明的HMPB-Mn纳米诊疗剂具有良好的生物相容性和生物安全性，对细胞没有毒性。

附图说明

图1示出了本发明实施例一中HMPB-Mn纳米诊疗剂制备示意图；

图2示出了本发明实施例一中制备的HMPB-Mn纳米诊疗剂透射电镜图；

图3示出了本发明的实施例一中制备的HMPB-Mn的元素分布图；

图4示出了HMPB-Mn在近红外光区域附近的紫外～可见吸收曲线；

图5示出了实施例二中在波长808nm、功率密度为1W/cm²的激光照射下，不同浓度的HMPB-Mn的PBS溶液时间与温度关系曲线；

图6示出了实施例四中HMPB-Mn在不同pH环境中(pH＝7.4，pH＝5.0)锰离子在不同时间的累积释放行为情况；

图7示出了实施例四中HMPB-Mn在不同pH环境中，T₁加权核磁共振成像的弛豫率随浓度的变化曲线；

图8示出了实施例四中HMPB-Mn在不同pH环境中(pH＝7.4，pH＝5.0)盐酸阿霉素在不同时间的累积释放行为情况；

图9示出了本发明实施例四中HMPB-Mn在pH 7.4的环境下，盐酸阿霉素释放与锰离子的释放之间的关系曲线；

图10示出了本发明实施例四中HMPB-Mn在pH 5.0的环境下，盐酸阿霉素释放与锰离子的释放之间的关系曲线；

图11示出了本发明实施例六中不同浓度的HMPB-Mn的光声信号值以及响应的光声成像图；

图12示出了本发明实施例七中不同浓度的HMPB-Mn对细胞的毒性图；

图13示出了本发明实施例八中HMPB-Mn作为药物载体，在细胞层面上实现热疗与化疗协同治疗肿瘤的疗效。

具体实施方式

以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明针对现有核磁共振成像造影剂在临床应用上的瓶颈，利用具有良好生物相容性和生物安全性的HMPB-Mn在肿瘤部位pH响应核磁共振成像和pH响应控制药物释放进行化疗，同时结合热疗，实现核磁共振成像引导下的热疗与化疗结合治疗肿瘤。形成一种基于空心介孔普鲁士蓝的pH响应核磁共振成像(MRI)引导下热疗与化疗协同治疗肿瘤的纳米诊疗剂。

本发明的纳米诊疗剂包括具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒，以及在所述普鲁士蓝纳米颗粒的表面包覆的普鲁士蓝锰的类似物。其中，普鲁士蓝锰的类似物是指K_xMn_y[Fe(CN)₆]_z,简称Mn-PBA，其中0.05≤x≤0.3，0.5≤y≤0.98，z＝1。

所述的纳米诊疗剂其表面带有负电荷。HMPB-Mn(外壳)粒径范围为200～1000nm可控，外壳壳层的厚度范围为20～100nm可控，孔径大小范围为：微孔：0.5～2nm(优选为0.5～1.5nm)可控；介孔大小为3.2～30nm(优选为3.2～25nm)可控。在所述HMPB-Mn纳米诊疗剂中，Fe/Mn的摩尔比在30:1～1:1范围内可调控。

HMPB-Mn外壳在近红外光区域具有强的吸收，高的光热转换效率。在近红外光的照射下，使病变组织处温度达到42.5℃以上。

Mn-PBA具有pH响应释放出锰离子，在pH 7.4的环境下，锰离子的释放量低于20％，在pH 5.0的环境下，锰离子的释放量高达90％，锰离子可以作为一种高效的T₁加权MRI造影剂。本发明的HMPB-Mn纳米诊疗剂，实现了使用核磁共振成像作为术前诊断和术后评价。

本发明的空心介孔纳米材料由于具有大的空腔结构(空心立方体)，可以作为药物载体。即，本发明的HMPB-Mn还可以包括装载于其中的抗肿瘤药物和基因等。所述抗肿瘤药物和基因包括但不限于盐酸阿霉素、紫杉醇、伊立替康、阿柔比星、奥沙利铂、米托蒽醌、长春新碱等纳米药物中的一种或者两种及两种以上的混合物。空心介孔结构可以实现对抗肿瘤药物和基因的包覆和传输，达到化疗和热疗协同作用效果，同时具有核磁共振成像造影功能。

本发明的HMPB-Mn不仅可以装载药物，还可以实现药物的pH响应释放。例如，在pH7.4环境下，药物DOX的释放量小于10％，在pH 5.0的环境下，DOX的释放量提高到了35％，实现了在肿瘤部位对药物的可控释放。

本发明的HMPB-Mn在低的pH环境下能同时释放出锰离子(作为T₁加权MRI造影剂)和抗癌药物(化疗)，实现了在肿瘤部位pH响应核磁共振成像和pH响应控制药物释放进行化疗，实现对肿瘤的诊疗。此外，可以利用T₁加权MRI检测药物的释放，即在肿瘤部位使用核磁共振成像监测药物释放量，监控肿瘤的治疗。同时，锰离子释放后的HMPB以及装载的药物可以实现对肿瘤的光热治疗和化疗的协同治疗肿瘤，进一步提高对肿瘤的治疗效率，达到完全去除肿瘤的目的。

本发明的纳米诊疗剂由具有优异光热转换性能的空心介孔纳米立方块作为载体，装载抗癌药物(例如DOX)，在肿瘤部位实现pH响应的核磁共振成像和化疗，同时实现对肿瘤的热疗。本发明实现了对肿瘤化疗和热疗协同治疗，同时实现核磁共振成像引导下的热疗与化疗协同治疗肿瘤的诊疗系统。

本发明的HMPB-Mn是一种具有优异的光热转换性能(近红外区域λ＝650-970nm具有强的吸收，高的光热转换效率以及光热稳定性)，pH响应释放锰离子作为高效的核磁共振成像造影剂，以及pH控制释放药物实现化疗和热疗的协同治疗肿瘤。HMPB-Mn外壳在近红外光区域具有强的吸收，高的光热转换效率。在近红外光的照射下，使病变组织处温度达到42.5℃以上，同时，抗癌药物(例如DOX)在肿瘤部位释放，实现化疗与热疗的协同治疗肿瘤。在肿瘤部位实现pH响应释放的锰离子，实现核磁共振成像诊断以及用于肿瘤的实时监测和药物释放监测。而且，本发明的HMPB-Mn具有良好的光热转换性能以及良好的生物相容性以及生物安全性。此外，本发明的HMPB-Mn还可以作为一种优良的光声成像造影剂，因此本发明的HMPB-Mn可以同时实现光声成像和pH响应的核磁共振成像。

图1示出本发明一个示例的制备方法的示意图。本发明的纳米诊疗剂的制备方法包括：以铁氰化钾为原料制备空心介孔普鲁士蓝纳米立方体(HMPB)模板，制备基于普鲁士蓝的具有核壳空心介孔纳米粒子(HMPB-Mn)。其中，HMPB的制备方法不限，可以采用公知的各种方法。在一个示例中，HMPB的制备方法可以包括以下步骤：

A)按质量比例，将0.132～0.396份铁氰化钾和2～10份聚乙烯吡咯烷酮加入到30～100份酸(例如0.01～2M的盐酸)中，混合搅拌均匀后在60～100℃陈化，冷却后分离、洗涤，得到具有介孔的普鲁士蓝纳米颗粒；

B)将所得的具有介孔的普鲁士蓝纳米颗粒分散于50～200份酸(例如浓度1～2M的盐酸)中，在120～140℃陈化2～4小时后，分离得到HMPB。

制备HMPB-Mn可以采用如下步骤：

(1)按质量比例，将1～3份锰盐(例如醋酸锰)、1～3份柠檬酸钠、100～300份聚乙烯吡咯烷酮、1～3份HMPB和水混合搅拌均匀，得到混合溶液；

(2)将铁氰化钾在搅拌下加入步骤(1)所得的混合溶液中，搅拌2～6小时后，陈化12～36小时；

(3)从步骤(2)的产物中收集沉淀，即制得所述纳米诊疗剂。

另外，当在HMPB-Mn中装载药物时，可以采用如下方法：按质量比例，将1～2份的HMPB-Mn与1～2份抗癌药物溶解于50-100份的PBS溶液中，进行磁搅拌1～24小时后，进行离心，洗涤即可获得装载抗癌药物的HMPB-Mn。

以下，作为一个示例，说明本发明的纳米诊疗剂的制备方法。

1)将0.132～0.396份铁氰化钾和2～10份聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到酸中，磁搅拌至得到澄清混合液，然后将澄清混合液转至烘箱中，在80℃陈化，冷却后分离、洗涤，得到所述具有介孔的普鲁士蓝纳米颗粒；

2)将表面具有介孔的普鲁士蓝纳米颗粒分散于酸中，在120～140℃陈化后，分离得到表面具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒(HMPB)；

3)然后将1-3份醋酸锰、1-3份柠檬酸钠、100-300份PVP、1-3份HMPB和水磁搅拌，得到澄清溶液；

4)将铁氰化钾溶于水，然后在磁搅拌下，以一定速率滴加入3)中的溶液，继续磁搅拌4h，室温下陈化12-36h；

5)最后通过离心收集，制得空心结构的HMPB-Mn纳米粒子。

步骤1)中，酸的量可为30-100份，酸可为0.01-2M的盐酸，陈化时间可为12-20小时。

步骤2)中，使用的酸可为浓度1-2M的盐酸，陈化时间可为2-4小时。

步骤3)中，磁搅拌的时间可为2-5h，滴加速率可为20-50ml/h。

在又一个示例中，HMPB-Mn的制备步骤具体为：

步骤A)将132～396mg的铁氰化钾和2～10g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到30～100mL浓度为的0.01～2M盐酸中，磁搅拌至得到澄清混合溶液；

步骤B)将混合液转至80℃的烘箱中，陈化12～20h取出，冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，溶于20～50mL浓度为1～2M的盐酸中待用；

步骤C)将20mL上述溶液转移至水热釜，置于电炉中，120～140℃陈化2～4h，取出冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，冷冻干燥；

步骤D)然后将1-3份醋酸锰、1-3份柠檬酸钠、100-300份PVP、1-3份HMPB和水磁搅拌，得到澄清溶液；

步骤E)将铁氰化钾溶于水，然后在磁搅拌下，以一定速率滴加入D)中的溶液，继续磁搅拌4h，室温下陈化12-36h；

步骤F)最后通过离心收集，制得中空介孔结构的HMPB-Mn纳米粒子。

本发明的基于HMPB-Mn的纳米诊疗剂具有优异的光热转换性能，同时具有pH响应释放锰离子实现核磁共振成像造影功能，以实时监控肿瘤状态和药物释放情况。因此，它解决了传统肿瘤光热治疗中热量在肿瘤内部分布不均导致的肿瘤易于复发、化疗毒副作用大等临床应用难题，同时实现了肿瘤治疗的实时监控和药物释放情况，为肿瘤的安全与高效治疗提供了新技术和新的理论基础；

本发明的基于HMPB-Mn的纳米诊疗剂的制备原料价格低廉易得，制备方法简单，易于批量生产。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例一

称量132mg铁(III)氰化钾和3g聚乙烯基吡咯烷酮K～30(PVP)于40mL 0.01M的盐酸中，搅拌30min使充分溶解形成黄色透明溶液，置于80℃烘箱中反应20h。11000r/min离心10min，水洗一次，得到介孔普鲁士蓝纳米粒子(MPB)。MPB溶于20mL 1M的盐酸中分散均匀，140℃水热刻蚀4h，11000r/min离心10min，水洗一次，得到空心介孔普鲁士蓝(HMPB)干燥备用；

用1M的盐酸刻蚀后，形成空心结构，其粒径基本保持不变，分散性良好，空心结构的壳层壁厚为10～100nm；

接着，将4.4mg醋酸锰、11.4mg柠檬酸钠、500mg份PVP、10mg HMPB和水磁搅拌，得到澄清溶液。将铁青化钾溶于水，然后在磁搅拌下，以40ml/h速率滴加入3)中的溶液，继续磁搅拌4h，室温下陈化24h；

最后通过离心收集，制得中空介孔结构的HMPB-Mn纳米粒子。图2示出HMPB-Mn纳米粒子的透射电镜图，可以看出HMPB-Mn纳米粒子呈立方体形的中空介孔结构。图3示出HMPB-Mn纳米粒子的元素分布图，可以看出其中含有N、Fe、Mn、C元素。

实施例二

把实施例一中得到的HMPB-Mn分散于PBS中，用紫外可见分光光度计测其在近红外光处的吸收峰，如图4所示(其中HMPB-Mn 11表示铁锰的摩尔比例为11:1，HMPB-Mn 5.5表示铁锰的摩尔比例为5.5:1)，可以看出，所制备的材料在近红外光区域有较强较宽的吸收峰，在720nm左右最强。

实施例三

取实施例一中得到的多份HMPB-Mn分别散于PBS中，15.625ppm、31.25ppm、62.5ppm、125ppm的溶液各1mL于石英比色皿中，功率密度为1W/cm²，波长为808nm激光辐照10min，记录溶液在不同时间点的温度如图5所示，随辐照时间的增加，溶液温度逐渐升高，而且浓度越高，升温速率越快，125ppm时，辐照十分钟可以升到25℃，说明HMPB-Mn具有优异的光热转换性能。

实施例四

将实施例一中制备的2份HMPB-Mn和DOX的10ml PBS溶液中，磁搅拌一个晚上，最后离心分离得到DOX-HMPB-Mn，测试其锰的含量以及装载的DOX，然后分别置于透析袋中，加入25ml pH 7.4和pH 5.0的溶液中，然后将其放在37℃，110rpm/min的摇床中，于不同时间点取出1ml，然后添加进去相应的溶液，最后测试其累计释放的锰离子浓度和盐酸阿霉素。测试结果如图6、8、9、10所示。可以看出在低的pH环境下能同时释放出锰离子(作为T₁加权MRI造影剂)和抗癌药物(化疗)。另外，图7示出实施例四中HMPB-Mn在不同pH环境中，T₁加权核磁共振成像的弛豫率随浓度的变化曲线，可以看出HMPB-Mn在pH7.4的环境中的弛豫率为2.94，在pH5.0的环境中的弛豫率为7.39，进一步表明HMPB-Mn具有pH响应核磁共振成像造影功能。

实施例六

将实施例一中制备的HMPB-Mn，不同浓度的HMPB-Mn进行光声成像实验，获取光声成像图以及光声信号值。其结果如图11所示，可见HMPB-Mn具有优异的光声成像性能。

实施例七

将实施例一中制备的HMPB-Mn在紫外灯光下辐照过夜进行灭菌，用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液配制成0mM、0.03mM、0.05Mm,0.1mM,0.2mM,0.3mM,0.4mM浓度，用噻唑蓝(MTT)法评价不同浓度材料对细胞的毒性实验。图12示出不同浓度的HMPB-Mn对细胞的毒性图，实验结果证明，HMPB-Mn对细胞是没有毒性的。

实施例八

将实施例一中制备的HMPB-Mn在紫外灯光下辐照过夜进行灭菌，用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液配制成0.01Mm,0.03mM，0.05Mm浓度，用噻唑蓝(MTT)法评价不同浓度材料对细胞的热疗效果。人宫颈癌(Hela)和4T1细胞分别以1×10⁴接种到96孔板中，在37℃、含5％CO₂的培养箱中培养12小时使细胞贴壁。以每孔100μL的量加入不同浓度HMPB的细胞培养液到96孔板中培养4小时后，用808nm激光1W/cm²下辐照5min继续培养20h，倒掉上层培养液，每孔加入MTT的DMEM培养液(0.5～1mg/mL)各100μL培养4h。最后除去MTT的培养液加入100μL DMSO，轻轻摇晃后在酶标仪上测其在490nm吸光度。热疗效果用0mM细胞活力的百分比表示，如图13所示，可以看出随HMPB-Mn浓度增大，激光辐照后，细胞存活率逐渐变低，即对细胞的杀伤力越来越强。

本发明中，HMPB-Mn外壳产生的热能有效杀死肿瘤细胞并加上pH响应和温度响应释放的抗癌药物DOX，实现对肿瘤的热疗与化疗协同治疗。同时，pH响应释放的锰离子作为核磁共振成像造影剂，实现对肿瘤的诊断和对药物释放的监控。本发明制备过程简单，原料成本低廉，诊疗剂具有良好的生物相容性和生物安全性，在生物医药领域具有潜在的临床应用前景。

Claims (10)

1.一种基于空心介孔普鲁士蓝的pH响应核磁共振成像和光声成像双模式引导下热疗与化疗协同治疗肿瘤的纳米诊疗剂，其特征在于，所述纳米诊疗剂包括具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒，以及所述空心介孔普鲁士蓝纳米颗粒的表面包覆的K_xMn_y[Fe(CN)₆]_z，其中0.05≤x≤0.3，0.5≤y≤0.98，z=1，所述纳米诊疗剂形成为核壳结构空心介孔纳米粒子。

2.根据权利要求1所述的纳米诊疗剂，其特征在于，所述纳米诊疗剂的表面带负电荷，所述普鲁士蓝纳米颗粒的粒径范围为100～1000 nm，壳层厚度为10～100 nm，所述普鲁士蓝纳米颗粒表面具有微孔和介孔，其中微孔的大小为0.5～2 nm，介孔的大小为3.2～30nm。

3.根据权利要求1或2所述的纳米诊疗剂，其特征在于，在所述纳米诊疗剂中，Fe/Mn的摩尔比在30:1～1:1范围内。

4.根据权利要求1或2所述的纳米诊疗剂，其特征在于，所述纳米诊疗剂还装载有抗肿瘤药物和/或基因。

5.一种权利要求1至4中任一项所述的纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）按质量比例，将1～3份+2价锰盐、1～3份柠檬酸钠、100～300份聚乙烯吡咯烷酮或者PEG、1～3份表面具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒和水混合搅拌均匀，得到混合溶液；

2）将铁氰化钾在搅拌下加入步骤1）所得的混合溶液中，搅拌2～6小时后，陈化12～36小时；

3）从步骤2）的产物中收集沉淀，即制得所述纳米诊疗剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述+2价锰盐为醋酸锰、硫酸锰、氯化锰、和硝酸锰中的至少一种。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述表面具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：

A）按质量比例，将0.132～0.396份铁氰化钾和2～10 份聚乙烯吡咯烷酮，加入到酸中，混合搅拌均匀后于烘箱中60～100 ℃陈化，冷却后分离、洗涤，得到具有介孔的普鲁士蓝纳米颗粒；

B）将所得的具有介孔的普鲁士蓝纳米颗粒分散于酸中，在120～140℃陈化后，分离得到表面具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤A）中，酸的量为30～100份，酸为0.01～2M的盐酸，陈化时间为12～20小时。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤B）中，酸的量为50～200份，酸为浓度1～2M的盐酸，陈化时间为2～4小时。

10.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，还包括装载抗肿瘤药物和/或基因的步骤：按质量比例，将1～2份的步骤3）所得的纳米诊疗剂与1～2份抗癌药物和/或基因溶解于50～100份的PBS溶液中，进行磁搅拌1～24小时后，进行离心，洗涤即可获得装载抗癌药物和/或基因的纳米诊疗剂。