CN105044003A - 比色/荧光双模态快速检测抗生素的纳米传感器以及检测抗生素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种比色/荧光双模态快速检测抗生素的纳米传感器，包括金纳米粒子，所述的金纳米粒子的表面通过静电吸附作用吸附有能够与特定的抗生素进行特异性结合的核酸适配体，所述的核酸适配体上标记有荧光染料，本发明旨在提供一种检测用时少、检测精度高的比色/荧光双模态快速检测抗生素的纳米传感器，同时本发明还提供了一种比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法。

Description

比色/荧光双模态快速检测抗生素的纳米传感器以及检测抗生素的方法

技术领域

本发明涉及生物医学和纳米医药领域，更具体地，涉及比色/荧光双模态快速检测抗生素的纳米传感器，以及比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法。

背景技术

核酸适配体是利用SELEX体系筛选出来的一类可以和靶分子特异性结合的RNA或DNA单链的寡聚核苷酸。它的亲和力很高、专一性也很好，不依赖于生物体存在，可以和很多物质如金属离子、氨基酸等特异性结合。当与目标物结合后，核酸适配体的三级结构发生变化，转化为发夹结构、口袋结构、G-四分体结构等，其吸附性质、空间位阻等也发生改变。利用金纳米粒子可以将这些信号转化为一些仪器如紫外-可见分光光度计可以识别的信号，从而实现对目标物的选择性测定。

氯霉素是一种价格低廉的广谱抗生素，是我国动物养殖中常用的抗菌药物之一，氯霉素对人类存在潜在的危害，可引起再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏症，新生儿、早产儿灰色综合症等疾病，因此动物源性食品中氯霉素的残留受到世界各国和地区的高度重视。欧盟、美国、加拿大等国家禁止在食用动物中使用氯霉素，欧盟规定进口食品中氯霉素不得检出，方法检出限要求为0.3μgkg^-1。目前，检测抗生素的方法主要有微生物法、酶联免疫法、高效液相色谱法、分光光度法、荧光法、电化学法等。这些方法多数需要进行复杂繁琐的样品前处理，并且不能同时筛选大量的样品，这对药物残留的及时监控是不适用的。为适应当前食品安全检测的要求，需要敏感、特异、省时和经济的筛选检测技术，缩短检测时间，提高检测的灵敏度和准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测用时少、检测精度高的比色/荧光双模态快速检测抗生素的纳米传感器。

同时，本发明的另外一个目的在于，提供一种检测用时少、检测精度高的比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法。

本发明的技术方案为：一种比色/荧光双模态快速检测抗生素的纳米传感器，包括金纳米粒子，所述的金纳米粒子的表面通过静电吸附作用吸附有能够与特定的抗生素进行特异性结合的核酸适配体，所述的核酸适配体上标记有荧光染料。

在上述的比色/荧光双模态快速检测抗生素的纳米传感器中，所述的金纳米粒子的粒径为13nm。

在上述的比色/荧光双模态快速检测抗生素的纳米传感器中，所述的特定的抗生素为卡那霉素或氯霉素或链霉素或氨苄青霉素或新霉素或四环素，优选地，所述的抗生素为氯霉素；

所述的荧光染料为Cy系列荧光染料或FAM荧光染料或Rox荧光染料或Alexa系列染料，优选地，所述的荧光染料为FAM荧光染料。

本发明还公开了一种比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法，包括以下步骤：

步骤1：将能够与特定的抗生素进行特异性结合的过量的核酸适配体的溶液与对应的特定的抗生素的溶液混合，使抗生素与核酸适配体反应，所述的核酸适配体上标记有荧光染料；

步骤2：向步骤1中加入过量的金纳米粒子溶液，使未与抗生素反应的核酸适配体与金纳米粒子反应，使核酸适配体通过静电吸附作用吸附在金纳米粒子的表面；

步骤3：加入足以使未与核酸适配体反应的金纳米粒子聚集的NaCl溶液，并加入磷酸缓冲溶液调节体系的体积至预设的体积；

步骤4：使用紫外-可见分光光度计测量体系在635nm与524nm处的吸收值；使用荧光分光光度计测量515nm波长处的荧光强度；

步骤5：根据吸收值和预先设置好的比色法标准曲线计算抗生素的浓度；同时根据荧光强度以及预先设置好的荧光法标准曲线计算抗生素的浓度。

在上述的比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法中，步骤1中，核酸适配体的溶液的浓度为10μM，体积为10μL；所述的NaCl溶液的浓度为0.25M；所述的磷酸缓冲溶液的浓度为1mM。

在上述的比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法中，所述的金纳米粒子的粒径为13nm。

在上述的比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法中，所述的特定的抗生素为卡那霉素或氯霉素或链霉素或氨苄青霉素或新霉素或四环素，优选地，所述的抗生素为氯霉素；

所述的荧光染料为Cy系列荧光染料或FAM荧光染料或Rox荧光染料或Alexa系列染料，优选地，所述的荧光染料为FAM荧光染料。

在上述的比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法中，步骤4中，在495nm的激发波长下，使用荧光分光光度计测量515nm波长处的荧光强度。

本发明克服了已有技术存在的不足，结合高亲和性和高特异性的核酸适配体，金纳米粒子对很宽波谱范围内的荧光物质的强猝灭作用以及金纳米粒子的表面等离子效应，构建了一种新型比色荧光双读出模式的纳米传感体系以及该体系用于食品中抗生素的定量检测。

本发明的原理在于：在稳定的呈红色的金纳米溶液中，加入一定量的尾端标记有荧光染料且能特异性识别抗生素的核酸适配体后，核酸适配体通过静电吸附作用吸附到金纳米粒子表面，起到保护金纳米粒子的作用，可以使金纳米溶液继续保持稳定，颜色呈红色；同时，FAM与金纳米粒子的距离非常接近，通过高效率的荧光共振能量转移作用，FAM的荧光被金纳米粒子猝灭。当有目标物即抗生素存在时，由于核酸适配体与抗生素的特异性结合作用大于它与金纳米粒子的吸附作用，核酸适配体从金纳米粒子表面脱离，并且发生结构改变。这一变化使金纳米粒子处于暴露状态，当加入高浓度的NaCl溶液后，由于离子强度很高，破坏了金纳米粒子间的静电斥力，使得金纳米粒子发生聚集，宏观上颜色由红变蓝，发生聚集的金纳米粒子在635nm左右有一个吸收峰；同时，FAM与金纳米粒子之间的距离变大，荧光共振能力转移效率急剧下降，导致FAM的荧光重新恢复。因此，我们可以通过金纳米粒子聚集时的光学吸收变化，利用635nm与524nm处的紫外吸收值之比来建立氯霉素检测的标准曲线，从而达到比色法测量氯霉素的目的；同时，在495nm的激发波长下，测量515nm波长处的荧光强度，建立抗生素检测的标准曲线，从而达到荧光法测量抗生素的目的。

本发明与现有技术相比，具有如下显著优点：

1)、比色和荧光的双重检测手段结合，提高了检测的精度和检测的速度，首先，比色法是从金纳米粒子的浓度的角度上去测定抗生素的浓度，荧光法是从与核酸适配体结合的抗生素的量的角度上去测定抗生素的浓度，两种检测方法结合在一起，可以有效的提高检测精度，并且提高检测可靠性，降低了检测用时；

2)、利用金纳米粒子极好的淬灭效应，显著地降低了体系的背景荧光，提高了检测的灵敏度，降低了最低检测浓度和检出限。而利用金纳米粒子的距离相关光学性能的比色检测方法十分方便、快捷，能够用裸眼进行定性分析。

3)、引入核酸适配体，不仅能检测DNA、RNA等核酸类物质，还可以检测蛋白质、多肽、金属离子、药物、病毒、细胞等，扩大了检测范围。同时，核酸适配体与目标物特异性高，有很好的选择性，是检测结果更加准确。

附图说明

图1为实施例1的利用纳米传感器检测氯霉素的浓度原理示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

用于氯霉素测量的纳米传感器的制备以及比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法：

(1)直径13nm的金纳米粒子(AuNPs)的制备：称取0.04726gHAuCl₄溶于已经放有100mL超纯水的圆底烧瓶中，放入磁力搅拌子，然后在双颈瓶的两个口上接上冷凝管和塞子，开启冷凝水，打开磁力搅拌器并开始加热。另外取1.3693g柠檬酸三钠溶解在超纯水中，配置成120mL溶液得到38.8mM的柠檬酸三钠溶液。当看到反应液沸腾，冷凝水开始以1秒1滴的速度回流时，取出塞子，快速加入12mL38.8mM柠檬酸三钠，重新塞上塞子。这时溶液的颜色会从淡黄色逐渐变为深红色，变为深红色后继续加热回流15分钟。然后停止加热，同时持续搅拌，使反应系统自然冷却至室温(25℃)。将冷凝好的溶液用孔径0.45μm的醋酸滤膜过滤即可。将制备好的溶液在室温条件下储存于干净的棕色玻璃瓶中。需要说明的是：在本发明中，mM、μM、M均为浓度单位，M的意思为mol/L。

(2)比色/荧光双模态检测氯霉素：本实施例选择对氯霉素有高亲和性和高特异性的、并标记有FAM荧光分子的核酸适配体作为识别分子，其序列为：

特异性识别氯霉素的核酸适配体：5′-

AGCAGCACAGAGGTCAGATG-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-FAM-3′

标准曲线的制备：先加入10μL10μM核酸适配体溶液和不同体积(0、1、3、9、18、27、40、54、72、90μL)600μM氯霉素标准溶液，反应5min后加入200μLAuNPs溶液。继续反应5min后，加入75μL0.25MNaCl，最后加入1mMPBS保持溶液总体积为600μL。反应6min后，使用紫外-可见分光光度计测量波长为635nm与524nm处的吸收值，建立两个波长处吸光度的比值与氯霉素浓度关系的比色法检测标准曲线；同时，在495nm的激发波长下，使用荧光分光光度计测量515nm波长处的荧光强度，建立荧光强度与氯霉素浓度关系的荧光法检测的标准曲线。

(3)待测的氯霉素的浓度的检测：先加入待测样品和10μL10μM的核酸适配体溶液，反应5min后加入200μLAuNPs溶液。继续反应5min后，加入75μL0.25MNaCl，最后加入1mMPBS保持溶液总体积为600μL。反应6min后，使用紫外-可见分光光度计测量波长为635nm与524nm处的吸收值，根据该两个波长处的吸光值的比值在步骤(2)所获得的比色法标准曲线上的位置可以计算出样品中氯霉素的浓度；同时，在495nm的激发波长下，使用荧光分光光度计测量515nm波长处的荧光强度，根据该波长处的荧光强度在步骤(2)所获得的荧光法标准曲线上的位置可以计算出样品中氯霉素的浓度。

具体来说，如图1所示，核酸适配体溶液和待测样品先进行反应，形成核酸适配体2和氯霉素6的结合体5，由于核酸适配体2是过量的，因此溶液中还存在没有与待测样品反应的核酸适配体2，此时加入金纳米粒子1，核酸适配体2通过静电吸引力吸附在金纳米粒子1的表面，形成纳米传感器3，该纳米传感器3由于金纳米粒子1极好的淬灭效应此时并未有荧光发生；

核酸适配体2和氯霉素6的结合体5之间作用力远大于金纳米粒子1与核酸适配体2的静电吸引力，此时核酸适配体2和氯霉素6的结合体5是处于游离的状态，核酸适配体2和氯霉素6的结合体5会有荧光发生；此时测定荧光强度可以得到与核酸适配体反应的氯霉素的量。

当加入高浓度NaCl后，体系的离子强度增加，部分金纳米粒子1因斥力减小发生聚集，此时聚集的金纳米粒子4在635nm有吸收峰，未聚集的金纳米粒子1在524nm有吸收峰，通过两个吸收值的比值，可以确定聚集的金纳米粒子4的量和未聚集的金纳米粒子的量，进而确定与核酸适配体反应的氯霉素的量。

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种比色/荧光双模态快速检测抗生素的纳米传感器，包括金纳米粒子，其特征在于，所述的金纳米粒子的表面通过静电吸附作用吸附有能够与特定的抗生素进行特异性结合的核酸适配体，所述的核酸适配体上标记有荧光染料。

2.根据权利要求1所述的比色/荧光双模态快速检测抗生素的纳米传感器，其特征在于，所述的金纳米粒子的粒径为13nm。

3.根据权利要求1所述的比色/荧光双模态快速检测抗生素的纳米传感器，其特征在于，所述的抗生素为氯霉素，所述的荧光染料为FAM荧光染料。

4.一种比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将能够与特定的抗生素进行特异性结合的过量的核酸适配体的溶液与特定的抗生素的溶液混合，使抗生素与核酸适配体反应，所述的核酸适配体上标记有荧光染料；

步骤2：向步骤1中加入过量的金纳米粒子溶液，使未与抗生素反应的核酸适配体与金纳米粒子反应，使核酸适配体通过静电吸附作用吸附在金纳米粒子的表面，形成纳米传感器；

步骤3：加入过量的NaCl溶液，并加入缓冲溶液调节体系的体积至预设的体积；

步骤4：使用紫外-可见分光光度计测量体系在635nm与524nm处的吸收值；使用荧光分光光度计测量515nm波长处的荧光强度；

步骤5：根据吸收值和预先设置好的比色法标准曲线计算抗生素的浓度；同时根据荧光强度以及预先设置好的荧光法标准曲线计算抗生素的浓度。

5.根据权利要求4所述的比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法，其特征在于，步骤1中，核酸适配体的溶液的浓度为10μM；所述的NaCl溶液的浓度为0.25M；所述的磷酸缓冲溶液的浓度为1mM。

6.根据权利要求4所述的比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法，其特征在于，所述的金纳米粒子的粒径为13nm。

7.根据权利要求4所述的比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法，其特征在于，所述的抗生素为氯霉素，所述的荧光染料为FAM荧光染料。

8.根据权利要求4至7任一所述的比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法，其特征在于，步骤4中，在495nm的激发波长下，使用荧光分光光度计测量515nm波长处的荧光强度。

9.根据权利要求4至7任一所述的比色/荧光双模态快速检测抗生素的方法，其特征在于，所述的步骤3中，体系中的NaCl的浓度为0.03125M。