CN105555964A - 生物样品中进行生物发光共振能量转移(bret)分析的方式和方法 - Google Patents

生物样品中进行生物发光共振能量转移(bret)分析的方式和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用发光进行体外检测方法的领域。本发明提供用于使用生物发光共振能量转移(BRET)检测样品中感兴趣的分析物的传感器分子，所述传感器分子包括系连至合成的调节分子的蛋白质部分。本发明还提供包含传感器的分析装置和使用所述传感器分子的方法。

Description

生物样品中进行生物发光共振能量转移(BRET)分析的方式和方法
本发明涉及使用发光进行体外检测方法的领域。发光是能量特异引导至分子以产生激发态的现象。回到低能量状态伴随着光子的释放。发光包括荧光、磷光、化学发光和生物发光。发光可用于分析游离分析物或生物相互作用。
2009年，发明人提出了生成针对小分子分析物的半合成蛋白质基的生物传感器的方法。荧光生物传感器称为SNap-标签指示蛋白，具有荧光分子内系连(Snifit)。参见Brun等JAmChemSoc.2009；131(16):5873-84和Brun等JAmChemSoc.2011；133(40):16235-42。
重要的是，Snifit是比率型(ratiometric)传感器，由单分子组成，其允许独立于实际传感器浓度而形成传感器读数。Snifit传感器由SNAP-标签、荧光蛋白和代谢物-结合蛋白组成。SNAP-标签用合成分子特异标记，所述分子含有代谢物-结合蛋白的配体和荧光团。在标记的传感器中，感兴趣的代谢物从所述结合蛋白中置换分子内配体，从而将传感器蛋白从封闭构型变为开放构型。读数是荧光蛋白和系连的荧光团的荧光强度中的伴随比率型变化。因此，分析物的存在与否导致传感器蛋白中的构型改变，从而两个荧光团相对彼此的位置改变，并且因此它们(读数)之间的FRET的效率也发生变化。通过选择合适的结合蛋白和其相关可系连配体，事实上任何小代谢物均可被检测，并且公开了数个示例。参见Brun等JAmChemSoc.2012；134(18):7676-8和Masharina等JAmChemSoc.2012；134(46):19026-34。
然而，当前已知的Snifit-方法至少受下述缺陷的限制：(i)比率变化较小并且目前没人能确定通过提高闭合状态中的RET效率来提高比率变化的方法；(ii)将比率型RET传感器直接用于定量吸收传感器的发射波长处光的复合样品(例如血清或其他体液)中的分析物易于出现假象，得到不可靠的分析结果。
为了确定通过使用传统Snifit提高闭合传感器中的RET效率来进一步改善比率变化的策略的大量尝试均告失败(JACS,2011(133,16235–16242)。此外，复合样品可包含各种浓度的荧光分子，这会干扰定量。比率型读数还会受到样品(例如血清或其他体液)光吸收的影响，从而使定量易于出现误差。
而理论上，基于作为内光源的荧光素酶的传感器(即BRET)会降低荧光背景问题并可能提高灵敏度，当前尚未提出适用于光吸收样品中分析物的混合-和-测量定量的比率型BRET基的传感器。
尽管生物发光技术的(医药)应用中有大发展，但当前没有可用的BRET基、便携、混合-和-测量传感器用于分析物的精确床边(point-of-care)定量(例如用于监控治疗药物)的事实表明产生此类传感器所面临的技术难度。
因此发明人提供比率型发光传感器及其使用方法，所述传感器包括由比率变化得到改善的单分子或由其组成，其克服了至少部分上述缺陷。具体地，其旨在结构优化产生较高的信号改变，并使传感器可用于直接定量分析物，例如体液或其他复合物、光吸收样品中的药物、代谢物或蛋白质。优选地，检测应与便携相机或智能手机兼容。
发现这些目标可通过提供特别设计的传感器分子实现，所述传感器分子包括含荧光素酶和分析物的结合伴侣的蛋白质部分，其中所述部分与荧光团和分子内配体系连，所述配体与感兴趣的分析物竞争结合所述结合伴侣。不存在分析物时，分子内配体结合所述结合伴侣，荧光团与荧光素酶紧密相邻，当荧光素底物存在时则发生强烈的生物发光共振能量转移(BRET)。相反，当感兴趣的分析物以足以置换分子内配体的浓度存在时，传感器变为开放构型，并且荧光素酶和合成的荧光团之间距离增加，产生较低的BRET-效率。参见图1-4的代表性传感器图示。令人惊奇的是，发现通过提高闭合状态中的RET效率，Snifit中荧光蛋白与荧光素酶的交换产生比率变化显著(2倍)增加的传感器。该预料之外的改进对传感器的实际应用非常重要。此外还惊奇的发现，通过将BRET传感器和所述样品吸附至固体载体(例如纸)或通过在测量前将BRET传感器固定至固体载体例如玻璃表面，样品在传感器的发射波长处的吸收干扰最小。这就可以分析复杂样品，例如血清。
因此，在一个实施方式中，本发明提供使用生物发光共振能量转移(BRET)检测样品中感兴趣分析物的传感器分子，所述传感器分子包括系连至合成的调节分子的蛋白质部分，其中
(i)所述蛋白质部分包含连接至结合蛋白(BP)的荧光素酶(Luc)，所述结合蛋白(BP)能结合所述感兴趣的分析物；
(ii)所述合成的调节分子包含能分子内结合BP的配体(L)，以及存在合适Luc底物时能接受通过共振能量转移(RET)来自所述Luc的能量的荧光受体，和
(iii)其中分析物与BP的结合导致传感器分子的开放和闭合状态之间的平衡发生变化，从而导致BRET功效的变化。
在一个实施方式中，分析物和L与BP的结合互相排斥，从而没有分析物时L结合BP，得到传感器分子的闭合构型，其中荧光受体与Luc空间上紧密相邻，使得BRET得以发生；当存在分析物时，其从BP中置换L，得到传感器分子的开放构型，从而BRET效率降低。
在另一实施方式中，分析物和L与BP的结合彼此协同，从而没有分析物时L不结合BP，得到传感器分子的开放构型，其中仅发生低BRET效率；当分析物结合至BP时，诱导L与BP的协同结合，得到传感器分子的闭合构型，其中荧光受体与Luc空间上紧密相邻，使高效的BRET得以发生。
本发明的传感器分子的特征包括蛋白质部分，所述部分包含连接至结合蛋白(BP)的荧光素酶(Luc)，所述结合蛋白(BP)能结合所述感兴趣的分析物。
本文所用Luc指能催化产能化学反应的荧光素酶，其中特异底物荧光素被氧化。各种类型的生物体(原核和真核，包括细菌、藻类、真菌、昆虫、鱼和其他水生形式)可用该方法发射光能量，其各具有特异荧光素酶活性和荧光素，它们与其他生物所具有的那些在化学上不同。荧光素/荧光素酶系统在形式、化学和功能上非常多样化。例如，一些细菌和蘑菇显示有促进连续化学发光的荧光素酶活性；在腰鞭毛虫藻类中则是适于促进偶尔或同时诱导发射的荧光素酶活性。作为化学能量转变为光能所带来的现象，生物发光并不限于活生物体，也不需要存在活生物体。其仅是需要荧光素酶活性的化学发光反应的一种类型，其在一个阶段或其他阶段时源于生物催化剂。因此，保存或构建必要的活性和化学足以产生生物发光现象。还涵盖的是非天然产生的荧光素酶，例如突变荧光素酶。因此具有荧光素酶活性的生物发光蛋白可获自各种来源或可通过各种方法获得。示例性的具有荧光素酶活性的生物发光蛋白可获自美国专利号5,229,285；5,219,737；5,843,746；5,196,524；或5,670,356。优选的荧光素酶包括Renilla荧光素酶、萤火虫荧光素酶和Gaussia荧光素酶。
在具体实施方式中，本发明的传感器包括前述NanoLucTM荧光素酶(Nluc)，其为19.1kDa，单体，ATP依赖性酶，采用新底物产生高强度，进行辉光型发光。参见WO2012/061530和Hall等ACSChemBiol.2012；7(11):1848-57。所述酶用定向进化从深海虾荧光素酶中生成，产生比其他形式的荧光素酶(包括萤火虫(Photinuspyralis)和海肾荧光素酶)更亮的荧光素酶。NanoLuc酶的高强度发光与复立玛津(furimazine)的低自发光的组合，得到对低水平荧光素酶的灵敏检测。
本发明的传感器分子中，荧光素酶融合至能结合感兴趣分析物的结合蛋白，以及融合至分子内配体L。BP可为天然或非天然产生的分析物的蛋白结合伴侣。在一个实施方式中，其为天然产生的结合伴侣或其功能性片段。还涵盖天然产生的结合蛋白的工程突变体或其片段，例如通过环状排列(circularpermutation)的工程突变体或其片段。
如下述实施例所示，本发明的具体实施方式包括BP是天然产生的受体、酶、结合蛋白或其片段的传感器分子。
在另一实施方式中，BP是分析物的专门设计的非天然产生的结合伴侣。本领域已知提供给定感兴趣分析物的结合蛋白的方法。例如，噬菌体展示技术可从含随机肽序列的库中快速筛选结合蛋白候选物。例如，小分子的结合体已使用噬菌体展示从抗运载蛋白(anticalin)支架的随机库中选取(SkerraFEBSJ.2008年6月；275(11):2677-83)。已开发并可等同使用许多其他支架例如硫氧还蛋白A、DARPins、单体(monobodies)、亲和体、抗体、抗体的单链可变片段(scFv)及其他。对于选择技术也一样，噬菌体展示的替代示例包括核糖体、酵母、mRNA或细菌展示以及酵母双杂交系统和酵母三杂交系统。
作为另一替代，BP是计算机设计的结合蛋白。例如，本领域已公开用于设计结合具体配体的蛋白的常规计算机方法。参见Fleishman等Science2011；332(6031):816-21和Tinberg等Nature2013(在印)。例如，提供BP是计算机设计的地高辛结合蛋白DIG10.3的传感器(Tinberg等Nature2013(在印))，其中传感器适用于检测地高辛、地高新或其他DIG10.3配体。
例如，提供BP是(环状排列)二氢叶酸还原酶(DHFR)的传感器，其中传感器适用于检测氨甲蝶呤或其他DHFR抑制剂。
另一示例中，BP是碳酸酐酶或其片段，从而传感器可检测碳酸酐酶抑制剂、优选托吡酯(商品名Topamax)，其为抗惊厥(抗癫痫)药物。
另一示例中，BP是检测免疫抑制分子雷帕霉素或相关大环内酯类他克莫司(旧称FK506)的FK506结合蛋白(FKBP)，雷帕霉素或相关大环内酯类他克莫司用于治疗器官移植后的患者、患有自身免疫紊乱的患者以及癌症患者。
在另一示例中，BP是检测免疫抑制分子环孢霉素的(环状排列)亲环蛋白A，环孢霉素用于治疗器官移植后的患者、和患有自身免疫紊乱的患者。
融合蛋白中Luc和BP的相对顺序是其允许在传感器处于闭合状态时(即当内源配体L结合BP时)于Luc和荧光团受体之间产生高BRET效率，并且当传感器处于开放状态时在Luc和合成荧光团之间产生低BRET效率。然而，功能性传感器不必然在传感器开放后显示RET效率的降低，但只要传感器开放后发生彻底变化，其还可反转。通常，BP位于传感器分子的子末端，L位于另一末端。然而，BP、Luc和合成的调节分子的特异结合的结合位置的最佳顺序取决于BP的结构，尤其是BP的末尾相对于配体结合位置的空间排列。在一个实施方式中，BP通过其N-末端融合至Luc。然而，若BP的几何形状使其N末端与配体/分析物结合位置的距离比C末端更高，则融合蛋白的顺序可反转从而实现闭合状态中Luc和荧光团之间的紧密相邻。因此，还提供BP通过其C末端融合至Luc的传感器分子。Luc与BP的融合可为直接或间接(例如通过接头序列)。多肽序列可为天然或非天然序列。通常，Luc和BP之间的空间为0-10、优选0-4个氨基酸。
含Luc和BP的蛋白质部分系连至合成的调节分子。合成的调节分子优选以位置特异方式系连至蛋白质部分以确保单一同源产物。结合位置可从蛋白质部分的任何部分进行选择，即Luc、BP或存在的其他任何(接头)序列。合成的调节分子结合至蛋白质部分的位置经选择，从而当传感器分子在开放和闭合构型之间变化时其允许BRET信号变化。在一个实施方式中，合成分子系连至Luc的N末端，从而顺序是(合成的调节分子)-Luc-BP。
合成的调节分子的位置特异结合可通过本领域已知方法实现。例如，可合适地使用显示独特反应性的氨基酸(天然或非天然)。合适的氨基酸包括合适的合成的调节分子的半胱氨酸和其上允许位置特异性化学偶联反应(例如点击化学)的任何(非天然)氨基酸。例如，可使用非天然氨基酸叠氮基高丙氨酸(AHA)。
在另一实施方式中，合成的调节分子以位置特异的方式通过蛋白质标记标签系连至蛋白质部分。优选地，所述蛋白质标记标签是本领域已知的自标记蛋白质，例如SNAP-标签、CLIP-标签或Halo-标签，且其中所述合成的调节分子通过合适的反应基团进行系连。在一个实施方式中，自标记蛋白质标签基于人O6-甲基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(hAGT)，合成的调节分子通过针对hAGT的反应基团与之系连。例如，所述蛋白质标签是SNAP-标签或CLIP-标签。所述反应基团优选O6-苄基鸟嘌呤(BG)、O4-苄基-2-氯代-6-氨基嘧啶(CP)或O2-苄基胞嘧啶(BC)衍生物。在另一实施方式中，自标记蛋白质标签基于修饰的卤代烷烃脱卤酶，合成的调节分子通过氯烷烃(Halo-标签)与之系连。
或者，蛋白质标记标签可为通过酶的作用标记有合成的调节分子的标签，所述酶例如分选酶(和其突变体)、硫辛酸连接酶(和其突变体)、生物素连接酶(和其突变体)、磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase；和其突变体)。标记可通过直接转移载有合成的调节分子的分子至蛋白质标签来实现，或通过两部法来实现，其中第一步中含生物正交基团的分子结合，第二步中所述生物正交基团与含合适功能基团的合成的调节分子反应。例如，载有合成的调节分子的修饰的磷酸泛酰巯基乙胺衍生物的酶转移使得源自酰基载体蛋白的某些肽序列内的特定丝氨酸受到标记，并因此允许合成的调节分子精确连接所述蛋白中存在的一个残基(参见N.George等.JAmChemSoc.2004126,8896)。ACP-标签和MCP-标签是源自酰基载体蛋白的此类序列。磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的存在是ACP-标签或MCP-标签与其底物之间形成共价键所需，其为辅酶A(CoA)的衍生物。在标记反应中，偶联CoA的基团通过磷酸泛酰巯基乙胺转移酶共价结合ACP标签或MCP标签。两步策略的示例是这样一种标记，其中在第一步中，硫辛酸连接酶(LplA)的突变体将反式环辛烯衍生物连接到LplA受体肽上，LplA受体肽为传感器分子的一部分。在第二步中，连接的反式环辛烯是用偶联四嗪的合成的调节分子化学选择性衍生的。该两步法的详细内容参见Liu等(JAmChemSoc.2012年1月18日；134(2):792-5)。
或者，合成的调节分子通过基于内含肽的标记而位置特异地系连至蛋白质部分。例如，使用所谓表达的蛋白连接(T.Muir,Annu.Rev.Biochem.2003.72:249–289)会使得蛋白质部分表达为具有C末端内含肽的融合蛋白，并且随后相应C末端硫酯发生分离。然后该硫酯与合成的调节分子所连接的半胱氨酸残基反应，形成功能性传感器分子。在基于断裂蛋白质内含肽(split-intein)的蛋白质标记(VolkmannG,LiuX-Q(2009)PLoSONE4(12):e8381)中，传感器分子的蛋白质部分可表达为具有C或N末端断裂蛋白质内含肽的融合蛋白。添加代表断裂蛋白质内含肽的其他部分并且也载有所述合成的调节分子的合适的合成肽产生如下结果：功能性内含肽的形成、从蛋白质中后续剪切内含肽、以及形成功能性传感器分子(VolkmannG,LiuX-Q(2009)PLoSONE4(12):e8381)。
优选地，传感器分子中的合成的调节分子的特异结合位置通过蛋白质接头部分与蛋白质部分的其他部件连通。接头部分可为人工多肽序列或天然产生的蛋白质，设计用于确保合成的调节分子和传感器的开放状态中的荧光素酶之间充分的距离。
聚L脯氨酸接头可用作精确分子标尺，由于其在水溶液中形成每个残基螺距的稳定和刚性螺旋结构(聚脯氨酸II螺旋)方面的明确性质。因此，接头部分优选富含脯氨酸的螺旋接头，产生结构刚性并使得合成的调节分子从连接的荧光素酶分离。用由至少15个脯氨酸残基组成的聚L脯氨酸接头(例如Pro15或Pro30或更长)获得良好效果。Brun等(2011)研究了插入传统传感器中的SNAP-和CLIP-标签之间的各种长度的聚脯氨酸接头(0,6,9,12,15,30,60)。发现长度为30或60个脯氨酸残基产生改善的传感器最大比率变化。因此，在一个实施方式中，接头部分由聚L脯氨酸接头组成，包括至少15、优选至少20、更优选至少30个残基。
合成的调节分子包含能与BP进行分子内结合的配体(L)，以及能接受来自Luc的能量的荧光受体，所述能量在它们空间上邻近时发出。通常，L位于调节分子的游离端，允许与BP的有效相互作用。优选地，传感器组分的相对顺序为在传感器的开放状态中，合成的调节分子与荧光素酶之间的距离尽量远。合成的调节分子的设计和制备根据本领域已公开的内容在传统基于FRET的Snifit上进行。参见例如Brun等.JAmChemSoc.2009；131(16):5873-84；Brun等.JAmChemSoc.2011；133(40):16235-42；Brun等.JAmChemSoc.2012；134(18):7676-8。
选择荧光受体分子与荧光素酶一起发挥BRET对的功能，即用于接受存在合适Luc底物时来自Luc的生物发光能量。此外，荧光受体分子适用于在接受生物发光后发射光。选择基于荧光素酶发射光谱和/或传感器分子的应用。形成BRET对的合适荧光受体包括任何荧光团，其激发光谱与对应荧光素酶的发射光谱至少部分重叠。可在本发明传感器分子中用作发光受体的可系连的荧光团包括AlexaFluor染料,具体为AlexaFluor488,AlexaFluor594；花青染料例如Cy3,Cy3.5,Cy5,Cy7及其衍生物,具体为磺酸盐衍生物；SYTO染料；SYBR染料,Bodipy染料；荧光蛋白例如EGFP和mCherry；Atto染料例如Atto647N；若丹明染料例如羧基四甲基若丹明(TMR),德克萨斯红,硅若丹明；荧光素衍生物例如羧基荧光素和FITC；俄勒冈绿；三芳基甲烷染料如孔雀石绿；萘酰亚胺染料如萤光黄；呫吨染料例如SNARF-1；吖啶染料例如吖啶橙；香豆素；IRDye染色例如IRDye700DX。非常合适的受体包括Cy3和TMR。
本领域技术人员应理解，通过选择合适的结合蛋白和分子内配体的对，本发明的传感器分子可设计用于检测任何感兴趣的分析物。若配体和分析物与结合蛋白的结合相互排斥，那么对没有游离分析物时待进入闭合状态的传感器分子来说，配体对结合蛋白的亲和性必须足够强。若配体和分析物与结合蛋白的结合相互协同，那么对存在游离分析物时待进入闭合状态的传感器分子来说，配体对结合蛋白的亲和性必须足够强。在一个实施方式中，结合蛋白和配体之间的相互作用的强度由平衡解离常数(Kd)表征，高至100μM、优选高至50、更优选高至10μM。
例如，感兴趣的分析物是药物、代谢物、蛋白质、生物标记物或核酸分子。在优选实施方式中，分析物是药物，其前体或代谢物。优选使用本发明传感器在各种临床设定中测量血液、血清或血浆的药物浓度，例如用于监控治疗、证实住院患者的中毒诊断、甚至协助法医学死亡研究。
在一个实施方式中，提供检测下述药物的传感器：抗癌药例如氨甲蝶呤或免疫抑制药例如雷柏霉素、或抗细菌药例如甲氧苄啶、或用于治疗心脏病症的药物例如地高辛、或抗癫痫药例如托吡酯。
在另一实施方式中，感兴趣的分析物是生物标记物。本文所用生物标记物或生物标记是生物状态的指示剂，或具是体类型的生物体以前存在或当前存在的指示剂。使用本发明传感器作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药学响应的指示剂，可客观测量并评估生物标记物。
本领域技术人员应理解，本发明传感器分子可设计用于检测任何感兴趣的分析物。
在第一具体方面，传感器包含人碳酸酐酶(HCA)作为BP，优选与作为分子内配体的4-(氨基甲基)苯磺酰胺或其变体组合。如图1所示，该传感器优选用于分析托吡酯(Topamax)或任何其他HCA配体。
在第二具体方面，本发明提供的传感器分子中BP是二氢叶酸还原酶(DHFR)或其环状排列的变体。优选地，BP与作为分子内配体的甲氧苄啶、氨甲蝶呤或其变体组合使用。如图2所示，该传感器优选用于分析氨甲蝶呤、甲氧苄啶或其他DHFR配体。
在第三方面，本发明提供的传感器分子中的BP是计算机设计的地高辛结合蛋白DIG10.3，优选与作为分子内配体的孕酮或其变体组合。如图3所示，该传感器优选用于分析地高辛、地高新或其他DIG10.3配体。
在第四具体方面，传感器分子包含FK506结合蛋白(FKBP)，优选与作为分子内配体的三甲氧基苯基脯氨酰胺N-苯甲酰苯胺或其变体组合。如图4所示，该传感器优选用于检测FK506(他克莫司)、雷柏霉素或其他FKBP配体。
在另一方面，传感器分子包括亲环蛋白A(CypA)或其环状排列的变体作为BP，优选与作为分子内配体的5-(对-氨基苄基)-海因酸(hydantoate)乙酯、环孢霉素A或其变体组合。该传感器用于检测环孢菌素A或任何其他CypA配体。
本发明还涉及提供本发明传感器分子的方法。如实施例1-4所示，蛋白质部分和合成的调节分子(或其前体)通常作为分别实体生成，之后使用合适的偶联反应将合成分子系连至蛋白质分子。因此，所述方法包括提供蛋白质部分和合成的调节分子或其前体的步骤和将它们组装产生传感器分子的步骤。
蛋白质部分可用本领域技术人员已知的标准重组DNA技术制备。例如，通常可将BP编码序列导入含荧光素酶序列的细菌表达载体的多克隆位点，从而BP序列可操作地连接至Luc编码序列。其他蛋白质组分例如蛋白标记标签和/或接头序列也可用标准技术纳入。用于本发明BRET传感器的蛋白质组分的各种构型的DNA构建体可转染/转化入合适的细胞系(真核或原核)用于生产。各种构型的融合蛋白在细胞中生成，然后从转染/转化的细胞中纯化或半纯化。纯化蛋白质部分的常规程序是通过亲和色谱，例如使用工程改造入DNA构建体的His-和/或Strep-标签。可单独使用标准生化技术，或与亲和色谱组合使用，来纯化各种融合蛋白至各种水平。最后，这些纯化的融合蛋白在系连至合成的调节分子之前还可经化学或酶修饰。
在另一实施方式中，蛋白质部分通过体内和体外方法的组合产生。首先融合蛋白通常在细胞中用重组技术工程改造并表达。然后融合蛋白经纯化或半纯化，之后通过化学或酶修饰连接其他蛋白质元件，例如可作为结合蛋白的元件例如抗体。结合其他元件可基于肽或基于化学。
合成的调节分子或其前体可通过偶联受体荧光团至分子内配体来合成，使用本领域已知方法。本领域技术人员应理解所用方法可基于荧光团和/或配体的化学性质进行选择。受体荧光团和分子内配体的偶联根据本领域已公开的内容在传统基于FRET的Snifit上进行。而且，调节分子或其前体可包含介导与蛋白质部分的系连的元件。例如，若合成的调节分子将通过自标记蛋白(例如SNAP-标签、CLIP-标签或Halo-标签)位置特异地系连至传感器分子的蛋白质部分，所述合成的调节分子必须包含合适的反应基团例如用于hAGT、O6-苄基鸟嘌呤(BG)、O4-苄基-2-氯代-6-氨基嘧啶(CP)或O2-苄基胞嘧啶(BC)衍生物或氯烷烃的反应基团。介导系连的反应基团可优选通过含数个聚乙二醇(PEG)单元的间隔子偶联至荧光团受体分子。例如，适合使用10-15PEG单元的间隔子。参见例如Brun等.JAmChemSoc.2009；131(16):5873-84，示例如下所示。
待与半胱氨酸或酶介导的偶联组合使用的调节分子可基于下述示例合成，其中BG用马来酰亚胺置换用于半胱氨酸偶联，或用CoA衍生物置换用于通过磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的偶联。
如本文所述，发明人观察到将比率型RET传感器直接用于定量吸收传感器发射波长处的光的复杂样品(例如血清或其他体液)中的分析物易于产生假象，得到不可靠的分析结果。发明人假定当光在样品中行进的距离降低时，改变所测比率的传感器发射的光的吸收显著降低或甚至完全消失，从而来自样品组分的吸收不影响所测比率。发现这可通过将待分析样品应用装置(载体)来实现，所述装置中从任意传感器分子发射的和由检测器收集的光子穿过所述样品的(平均)距离短于约330μm。具体地，当传感器吸附于纸时，BRET传感器分子的性能显著增加。参见下述实施例5，其表明胆红素吸收对溶液中BRET传感器分子发射的信号的效果相比胆红素吸收对吸附于白纸上的相同样品发射的信号的效果。然而，降低路径长度的各种其他方法是可想象的。例如，当传感器固定于玻片或一些其他透明支持物上时，以及当固定的传感器接触玻片对侧的样品后通过玻片检测BRET信号时，得到相似的优良效果。此外，当含比率型传感器分子的样品作为薄膜应用到玻片表面上时，以及当通过玻片的另一侧检测BRET信号时，得到相似的优良效果。可通过添加表面活性剂促进薄膜的形成。
因此，本发明还涉及一种包含前述权利要求中任一项所述的BRET传感器分子的分析装置，其中所述传感器分子以如下方式排列，当使用所述装置时，从所述传感器分子发射的和由检测器收集的光子穿过所述样品的(平均)距离短于330μm。
在一个实施方式中，传感器分子固定于或吸附于固体载体。优选的载体包括玻璃或透明塑料、凝胶和纸。
优选的载体是纸和玻璃片。合适类型的纸包括本领域已知的用作纤维素色谱纸的那些。例如，可使用Whatman公司销售的1级Chr世界标准色谱纸，其为平滑表面、0.18mm厚，线性流速(水)为130mm/30分钟。惊奇的发现吸附(点)在纸上的本发明传感器分子在例如-20摄氏度储存数周后仍可使用。这打开了传感器应用的全新领域。具体地，预点在纸上的BRET传感器可容易地在临床环境中使用，例如“床边”设定中，其中体液样品仅通过将样品施加在含固定了传感器的纸上来经过分析。所述纸优选还含有预点的荧光素酶底物，从而除了待测样品之外不需要加入其它试剂。在一个实施方式中，蜡基打印机和热原可用于在纸上打印微流化亲水路径，通过其的流动(由毛细作用驱动)可指向具体“检测区域”。参见Pollock等.SciTranslMed.2012；4(152):152ra129。还可堆叠有图案的纸的层来产生3D装置。例如，可包括血浆分离膜和聚酯膜的层叠覆盖以保护装置免受环境的影响和限制蒸发。层叠覆盖上的孔允许将全血或血清的指棒或吸液滴(如30ul)施加至血浆分离膜。若施加全血，通过血浆分离膜捕获血并保持细胞，同时血浆经毛细作用进入第一层纸的个体“区域”。在那些区域，血浆流重建干燥的试剂并产生BRET信号，其可经解释和定量。
在一个实施方式中，传感器分子固定于固体载体。固定化可为共价或非共价，且可用本领域已知方法实现。参见例如P.Jonkheijm等.Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,9618–9647。
在一个实施方式中，传感器通过特异配体/结合部分的对(例如生物素/链霉亲和素)来进行非共价固定。例如，生物素部分或Strep-标签可加入传感器分子中以允许在链霉亲和素包被的载体(玻璃)上固定。
本领域技术人员应理解，本发明装置高度适用于便携、“混合-和-计量”传感器，用于精确床边药物定量，例如用于治疗药物监控、特别是用于分析复杂(生物)样品。在优选方面，分析装置为或可为手持式，这就允许现场分析物测量。
孵育后，BRET信号可通过普通相机检测，甚至可通过手持式带相机的智能手机检测。因此，本发明还提供固定或吸附于固体载体的BRET传感器分子，其中包含所述固定的传感器分子的区域还包括荧光素酶底物。
然而固体载体方法并不局限于本发明所述的新的改良型BRET基的传感器分子，其还可优选用于其他定量(比率型或非比率型)BRET传感器，包括本领域已知的那些和尚未开发的那些。
因此本发明还涉及一种使用生物发光共振能量转移(BRET)体外检测样品中感兴趣分析物的方法，所述方法包括步骤：(a)将所述样品与BRET传感器接触，所述传感器包含作为分开实体或单一分子的生物发光供体蛋白和荧光受体，所述接触在允许分析物诱导的BRET变化发生的条件下进行；和(b)在至少所述BRET传感器或其生物发光供体蛋白(如荧光素酶)组分固定于或吸附于固体载体的条件下分析能量共振转移。在一个实施方式中，固体载体是纸并检测纸发射的光。在另一实施方式中，BRET传感器或其荧光素酶组分固定于玻片表面或一些其他透明支持物上，并且固定的传感器接触玻片对侧的样品后通过玻片检测BRET信号。在另一实施方式中，固体载体是透明或非透明载体，例如玻璃或塑料片，并且在玻璃或塑料表面扩散的实验混合物发出的光从通过玻璃或塑料片的底部(在透明载体的情况中)或从固体载体的底部或顶部(在透明载体或非透明载体的情况中)进行测量。
如实施例6所述，检测BRET信号可通过(数字)相机方便进行，即通过获取各点的红色和蓝色通道的平均像素强度。
优选地，生物发光供体蛋白具有荧光素酶活性并且步骤(a)在存在合适底物时进行，所述底物例如腔肠素、复立玛津(NanoLuc的情况中)或其衍生物。
使用本发明的BRET传感器分子的方法中获得非常好的结果。
样品可为生物来源或人工来源的任何样品。在一个实施方式中，其为生物样品或其组分。例如，其为体液，优选选自：血液、血清、唾液、尿液、脊液、泪液、精液、汗液、乳液。如上所述，本发明方法优选用于光吸收样品，尤其是吸收蓝光区域的样品，例如含血清组分的样品。本发明方法还兼容非常低的样品体积，例如低于5微升的体积依然得到满意的分析结果。本发明方法还优选用于感兴趣的分析物的精确定量，并且因此可产生直接的治疗行为。
其他应用包括(现场)分析废料流或表面水质监控。例如，在一个实施方式中，所述方法检测新鲜的海洋娱乐用水中粪便指示剂生物体。感兴趣的分析物选自所有粪便大肠菌群的常见表面抗原，例如粪肠球菌(E.faecalis)或屎肠球菌(E.faecium)的核心脂多糖抗原(乙醇胺、特定荚膜糖等)和甘油磷壁酸，从而可检测大肠菌群至肠球菌的广泛范围。其他有用的应用领域包括监控作为细菌代谢物的细菌污染的指示剂或群体感应的信号分子、食物对照的质量(例如维生素和其他营养素)、以及存在毒素化合物或污染物。
应理解，本文所述BRET传感器具有许多实际应用，不限于基于载体的检测方法。因此，提供用BRET体外检测样品中感兴趣分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将样品与本发明所述的传感器分子于荧光素酶底物存在下接触，所述接触在允许分析物诱导的BRET变化发生的条件下进行；和(b)分析能量共振转移，其中荧光素酶和系连的荧光团的发射比率中的变化指示分析物是否存在。步骤(b)可在溶液中进行。或者，例如如上所述的原因，可进行所述方法同时至少BRET传感器固定或吸附于固体载体。因此，在一个实施方式中，所述方法包括分析能量共振转移，而至少所述传感器分子以如下方式排列，从所述传感器分子发射的和由检测器收集的光子穿过所述样品的(平均)距离短于330μm。例如，传感器分子固定或吸附于固体载体，优选玻璃或透明塑料。在具体方面，所述方法使用物理固定的传感器。样品和传感器分子可吸附于固体载体或凝胶，优选纸。所述方法可包括固定或吸附BRET传感器和荧光素酶底物至固体载体，优选纸，然后将至少部分样品施加至含传感器和荧光素酶的固体载体上，并测量载体发出的光。添加样品、传感器和荧光素酶底物的精确顺序可根据具体目的和环境变化。例如，传感器和荧光素酶底物可点在纸上并在纸上干燥，然后加入样品(如血浆)。然后测量纸发出的光信号，即荧光素酶和系连的荧光团的发射的相对强度。或者，样品和传感器分子为薄膜的一部分，或限制在管中、毛细管中或(微流体)室中。然而，实际试验可以许多不同方式进行，如上所述用于分析装置。可包括阳性和阴性对照样品，以及标准曲线。
还提供多部分试剂盒，包括本发明所述的传感器分子和固体载体。传感器分子和载体可以分别实体存在，从而用户可在用之前固定或吸附传感器。或者，传感器已经物理连接至固体载体，例如以预点纸的形式。所述试剂盒可用于使用本发明所述方法的诊断方法等。优选地，固体载体是纸或透明物体，优选玻璃或透明塑料。试剂盒还可包括荧光素酶底物。在传感器分子基于NanoLuc的情况中，试剂盒优选包含复立玛津。其他有用的组件包括用户说明、缓冲液、样品预处理材料(例如裂解液)、参考样品和构建标准曲线的化合物。
附图说明
图1.(A)示例性BRET传感器分子的结构和传感机制的图示，采用人碳酸酐酶(HCA)作为结合蛋白；(B)合成分子BG-TMR-氨基甲基SA的结构。(C)用人血清中的托吡酯滴定的传感器的响应曲线。详细见实施例1。
图2.(A)示例性BRET传感器分子的结构和传感机制的图示，采用二氢叶酸还原酶(DHFR)作为结合蛋白。(B)合成分子BG-Cy3-tmp的结构。(C)野生型(左)和环状排列(右)的DHFR之间差异的示意图。闭合状态的传感器的BRET效率可通过使用环状排列形式将荧光团靠近荧光素酶来得到提高。(D)用氨甲蝶呤滴定的含野生型或环状排列的DHFR的传感器的响应曲线。环状排列变体的情况中发射比率变化大了超过10倍。详细见实施例2。
图3.(A)传感器分子的结构和传感机制的图示，采用DIG10.3作为结合蛋白。(B)合成分子BG-TMR-prog的结构。(C)用人血清中的地高辛滴定的传感器的响应曲线。详细见实施例3。
图4(A)传感器分子的结构和传感机制的图示，采用FKBP作为结合蛋白。(B)合成分子BG-Cy3-fkl的结构。(C)用人血清中的FK506滴定的传感器的响应曲线。详细见实施例4。
图5.血清胆红素吸收对BRET传感器SNAP-Pro30-NanoLuc-DHFRcpL24G5的影响，(A)溶液中(B)吸附于纸上。详细见实施例5。
图6.(A)实施例6所示实验的示意图。(B)数码相机拍摄的图片以及红色和蓝色通道的像素强度的直方图。(C)获自红色和蓝色通道的平均像素强度的比率的传感器的响应曲线。
实验部分
下述实施例显示本发明示例性BRET传感器的设计和构建及其在分析装置或分析方法中的应用。试剂和溶剂购自密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)(St.Louis,MO)或马萨诸塞州沃特汉姆的阿科斯有机品公司(AcrosOrganics)(Waltham,MA)，使用无需进一步纯化。存在二异丙基乙胺(DIEA)作为无水二甲基亚砜(DMSO)中的碱时，于室温下通过用O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸(TSTU)或N,N,N’,N’-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(HBTU)活化相应羧酸进行肽偶联。
实施例1：托吡酯传感器
本实施例描述能传感药物托吡酯(Topamax)的浓度的BRET的设计和构建。传感器包含人碳酸酐酶II(HCA)作为结合蛋白，芳香磺酰胺作为分子内配体。荧光素酶和TMR形成BRET对(参见图1A、B)。
含O6-苄基鸟嘌呤(BG)基团用于SNAP-标签标记、荧光团四甲基若丹明(TMR)、和作为系连配体的4-(氨基甲基)苯磺酰胺(氨基甲基SA)的合成传感器分子根据方案1合成。
方案1：合成分子BG-TMR-氨基甲基SA的方案示例。
如上所述制备BG-EG11-TMR-COOH(I-1)(Brun等.JAmChemSoc.2009；131(16):5873-84；Kvach等.BioconjugChem.2009,20(8),1673-82)并且将其与盐酸4-(氨基甲基)苯磺酰胺(I-2)偶联，以得到标记化合物BG-TMR-氨基甲基SA(I-3).
SNAP-标签、30-脯氨酸接头、NanoLuc荧光素酶(威斯康辛州菲奇堡的普洛麦格公司(Promega,Fitchburg,WI))和HCA的融合蛋白通过用标准克隆技术置换前述传感器SNAP-PP30-CLIP-HCA(Brun等.JAmChemSoc.2011；133(40):16235-42)中的CLIP-标签的编码序列为NanoLuc荧光素酶的编码序列而制备。融合蛋白在大肠杆菌(E.coli)Rosetta-gami株系中表达并用C末端His标签以及N末端Strep标签纯化。
通过用合成分子BG-TMR-氨基甲基SA标记SNAP标签来组装传感器分子(图1B)。我们开发该配体是因为用于前述FRET传感器(Brun等.JAmChemSoc.2009；131(16):5873-84；Brun等JAmChemSoc.2011；133(40):16235-42)的那些要么亲和性过高导致传感器的开放更难以降低灵敏度，要么亲和性过低阻碍无分析物时传感器完全闭合。纯化的蛋白质在HEPES缓冲液(50mMHEPES,50mMNaCl,pH7.2)中稀释至1μM，并与4倍摩尔过量的合成化合物BG-TMR-氨基甲基SA室温孵育一小时。
为了评估BRET传感器对不同托吡酯浓度的响应，组装的传感器分子在100μL正常人血清(马萨诸塞州比尔里卡的默克密理博公司(MerckMillipore,Billerica,MA))中稀释至10nM，所述血清在白色非结合96孔板中含有限定浓度的托吡酯(奥地利克雷姆斯米斯特的葛莱娜第一生化有限公司(GreinerBio-One,Kremsmünster,Austria))。室温孵育溶液至少10分钟以确保传感器达到平衡。生物发光在EnVision多标记读数计(帕金埃尔默公司(PerkinElmer))上进行测量：测量前5秒，将在HEPES缓冲液中稀释100倍的100μL复立玛津(威斯康辛州菲奇堡的普洛麦格公司)储液通过仪器注射器加入孔中并收集信号，用伞形酮(Umbelliferone)发射滤器(波长：460nm，带宽：25nm)记录NanoLuc发射和用Cy3滤器(波长：595nm，带宽：60nm)记录TMR发射。
图1C显示传感器对不同托吡酯浓度的响应。低浓度时，传感器为闭合构型，允许从NanoLuc向TMR的有效共振能量转移，并导致低NanoLuc/TMR发射比率。高托吡酯浓度时，分子内配体被置换，传感器切换为开放构型状态。该状态中从NanoLuc向TMR的共振能量转移无效，导致高NanoLuc/TMR发射比率。本领域技术人员应理解，传感器还可用于结合HCA的其他药物，例如，依索唑胺、乙酰唑胺等。
实施例2：氨甲蝶呤传感器
构建能感测抗癌药物氨甲蝶呤浓度的BRET传感器。其基于环状排列的二氢叶酸还原酶(DHFR)作为结合蛋白，甲氧苄啶作为分子内抑制剂，荧光素酶和Cy3作为BRET对(参加图2A、B)。含O6-苄基鸟嘌呤(BG)基团用于SNAP-标签标记、荧光团Cy3、和作为系连配体的三甲氧苄二氨嘧啶(tmp)的分子根据方案2合成。
在二甲基甲酰胺(DMF)中存在无水碳酸钾时用5-溴戊酸甲酯(II-2)烷基化4-去甲基甲氧苄啶(II-1)。反应混合物倒入1M氢氧化钠水溶液中，产生II-3，然后其用TSTU作为偶联剂偶联至乙二胺，获得甲氧苄啶衍生物II-4。如上所述制备BG-EG11-NH2(II-6)和Cy3(II-5)(Mujumdar等.BioconjugateChemistry1993,4,105-111)，两个构建嵌合物与II-4偶联在一起得到标记分子BG-Cy3-tmp(II-7)。
方案2：合成分子BG-Cy3-tmp的方案示例。
通过将传感器SNAP-PP30-NanoLuc-HCA(参见实施例1)中的HCA编码序列置换为野生型细菌DHFR或前述DHFR变体DHFRL24G5的编码序列(Brun等.JAmChemSoc.2009；131(16):5873-84；Iwakura等ProteinEng1998,11,707-713)，构建SNAP-标签、30-脯氨酸接头、NanoLuc荧光素酶(威斯康辛州菲奇堡的普洛麦格公司)和DHFR的融合蛋白，其在Asn23和Leu24残基之间环状排列，通过标准克隆技术用5-甘氨酸接头连接原始末端。选择DHFR的环状排列变体从而NanoLuc荧光素酶可紧密连接分子内配体的结合位置，将其靠近闭合状态传感器中的受体荧光团Cy3。
野生型DHFR中，末端远离激活位置，这样不允许构建闭合状态中高BRET效率的传感器。另一方面，位置Asn23,Leu24处于非常靠近所述蛋白的激活位置的环中(参见图2C)。
融合蛋白在大肠杆菌(E.coli)Rosetta-gami株系中表达并用C末端His标签以及N末端Strep标签纯化。通过用合成分子BG-Cy3-tmp标记SNAP标签来组装传感器分子(图1B)。纯化的蛋白质在HEPES缓冲液(50mMHEPES,50mMNaCl,pH7.2)中稀释至1μM，并与4倍摩尔过量的合成化合物BG-Cy3-tmp室温孵育一小时。
为了测试对不同氨甲蝶呤浓度的响应，组装的传感器分子在补充有100μMNADPH的100μLHEPES缓冲液中稀释至10nM的浓度，所述缓冲液在白色非结合96孔板中含有限定浓度的氨甲蝶呤(奥地利克雷姆斯米斯特的葛莱娜第一生化有限公司)。室温孵育溶液至少30分钟以确保传感器达到平衡。生物发光在EnVision多标记读数计(MultilabelReader)(帕金埃尔默公司)上进行测量：测量前5秒，将在HEPES缓冲液中稀释100倍的100μL复立玛津(威斯康辛州菲奇堡的普洛麦格公司)储液通过仪器注射器加入孔中并收集信号，用伞形酮(Umbelliferone)发射滤器(波长：460nm，带宽：25nm)记录NanoLuc发射和用Cy3滤器(波长：595nm，带宽：60nm)记录Cy3发射。
图2D显示传感器对不同氨甲蝶呤浓度的响应。低浓度时，传感器为闭合构型，允许从NanoLuc向Cy3的高效共振能量转移，并导致低NanoLuc/Cy3发射比率。高氨甲蝶呤浓度时，分子内配体被置换，传感器切换为开放构型状态。该状态中从NanoLuc向Cy3的共振能量转移无效，导致高NanoLuc/Cy3发射比率。
应理解，传感器可用于结合DHFR的其他(药物)分析物，例如培美曲塞、乙胺嘧啶、氯胍、甲氧苄啶等。
实施例3：地高辛传感器
构建能传感地高辛浓度的BRET传感器。其基于计算机设计的结合蛋白(DHFR)(Tinberg等Nature2013已接受)，孕酮作为分子内配体，荧光素酶和TMR作为BRET对(参加图3A、B)。
含O6-苄基鸟嘌呤(BG)基团用于SNAP-标签标记、荧光团四甲基若丹明(TMR)和作为系连配体的孕酮的分子根据方案3合成。
方案3：合成分子BG-TMR-prog的方案示例。
孕酮-(3-O-羧甲基)肟(III-1)通过偶联至1-N-Boc-3,6-二氧杂-1,8-二氨基辛烷(III-2)的肽系连至短PEG2系连体(tether)，得到III-3，然后通过用三氟乙酸(TFA)处理移除Boc保护基团，得到氨基衍生物III-4。如上所述制备BG-EG11-TMR-COOH(I-1)(Brun等.JAmChemSoc.2009；131(16):5873-84；Kvach等.BioconjugChem.2009,20(8),1673-82)并且将其与(III-4)偶联，以得到标记化合物BG-TMR-prog(III-5).
用标准克隆技术构建DIG10.3、NanoLuc荧光素酶(威斯康辛州菲奇堡的普洛麦格公司)、30-脯氨酸接头和SNAP-标签的融合蛋白。DIG10.3通过其C末端进行融合，因其位置靠近蛋白质的结合位置。这可使NanoLuc荧光素酶结合至靠近分子内配体的结合位置，将其靠近闭合态传感器的受体荧光团TMR。融合蛋白在大肠杆菌(E.coli)Rosetta-gami株系中表达并用C末端His标签以及N末端Strep标签纯化。
通过用合成分子BG-TMR-prog标记SNAP标签来组装传感器分子(图3B)。孕酮与DIG10.3结合较弱。其因此虽靠近传感器但仍容易被地高辛置换，使得传感器比使用地高辛作为系连配体时更灵敏。纯化的蛋白质在HEPES缓冲液(50mMHEPES,50mMNaCl,pH7.2)中稀释至1μM，并与4倍摩尔过量的合成分子BG-TMR-prog室温孵育一小时。
为了测试对不同地高辛浓度的响应，组装的传感器分子在100μL正常人血清(马萨诸塞州比尔里卡的默克密理博公司)中稀释至10nM，所述血清在白色非结合96孔板中含有限定浓度的地高辛(奥地利克雷姆斯米斯特的葛莱娜第一生化有限公司)。室温孵育溶液至少10分钟以确保传感器达到平衡。生物发光在EnVision多标记读数计(帕金埃尔默公司)上进行测量：测量前5秒，将在HEPES缓冲液中稀释100倍的100μL复立玛津(威斯康辛州菲奇堡的普洛麦格公司)储液通过仪器注射器加入孔中并收集信号，用伞形酮(Umbelliferone)发射滤器(波长：460nm，带宽：25nm)记录NanoLuc发射和用Cy3滤器(波长：595nm，带宽：60nm)记录TMR发射。
图3C显示传感器对不同地高辛浓度的响应。低浓度时，传感器为闭合构型，允许从NanoLuc向TMR的高效共振能量转移，并导致低NanoLuc/TMR发射比率。高地高辛浓度时，分子内配体被置换，传感器切换为开放构型状态。该状态中，从NanoLuc向TMR的共振能量转移无效，导致高NanoLuc/TMR发射比率。
实施例4：FK506传感器
构建能感测免疫抑制分子FK506浓度的BRET传感器。其基于FKBP12作为结合蛋白，FKBP的双特异抑制剂作为分子内抑制剂，和荧光素酶和Cy3作为BRET对(参见图4A、B)。
含O6-苄基鸟嘌呤(BG)基团用于SNAP-标签标记、荧光团Cy3和作为系连配体的FKBP双功能配体(fkl)的分子根据方案4合成。合成方案由双位置特异的FKBP-配体聚合组成，然后与短PEG-接头连接。根据前述程序(Rohrig等.ChemMedChem2007,2,1054-1070)，进行一些修改，通过用HBTU4-氨基苯酚(IV-1)和4-羟基苯甲酸(IV-2)偶联得到IV-3来制备第一配体。两种不同等分三甘醇双-对甲苯磺酸酯(IV-4)与各1当量的邻苯二甲酰亚胺钾或叠氮化钠在DMF中反应，分别得到IV-5和IV-6。IV-3在DMF中经过2步烷基化，使用碳酸钠作为碱：加入第一当量的IV-5以烷基化大多数反应型酚醛基团，然后加入过量IV-6以进行第二反应性羟基基团的烷基化，得到IV-7。用40％甲基胺水溶液移除邻苯二甲酰亚胺保护基团，获得IV-8中的游离氨基基团。分别制备第二配体：3',4',5'-三甲氧基苯乙酮(IV-9)用二氧化硒在吡啶中氧化得到酸IV-10，其与TSTU偶联至脯氨酸甲酯(IV-11)并用1M氢氧化钠水溶液处理以水解甲酯并得到IV-12。IV-8和IV-12用TSTU偶联，得到叠氮基-修饰的双特异配体IV-13。BG-EG11-NH2(II-6)和Cy3(II-5)如前所述进行制备(Brun等.JAmChemSoc.2009；131(16):5873-84；Brun等.JAmChemSoc.2011；133(40):16235-42)，两个构建嵌合物与炔丙胺偶联在一起得到炔-修饰的BG-Cy3-炔(IV-14)。IV-13通过点击化学用硫酸铜(II)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺和抗坏血酸钠在DMSO中偶联至IV-14，并得到标记化合物BG-Cy3-fkl(IV-15)。
通过将传感器SNAP-PP30-NanoLuc-HCA(参见实施例1)中的HCA编码序列置换为FKBP12编码序列，构建SNAP-标签、30-脯氨酸接头、NanoLuc荧光素酶(威斯康辛州菲奇堡的普洛麦格公司)和FKBP12的融合蛋白。融合蛋白在大肠杆菌(E.coli)Rosetta-gami株系中表达并用C末端His标签以及N末端Strep标签纯化。
通过用合成分子BG-Cy3-fkl标记SNAP标签来组装传感器分子(图4B)。该先前公开的配体由两部分组成，并结合至FKBP12的两个不同位点。第二部分-直接连接至BG-Cy3-fkl中的Cy3－与蛋白质的N末端紧密结合(Rohrig等.ChemMedChem2007,2,1054-1070.)。这使得Cy3靠近闭合态传感器中的NanoLuc荧光素酶，允许高效BRET。纯化的蛋白质在HEPES缓冲液(50mMHEPES,50mMNaCl,pH7.2)中稀释至1μM浓度，并与4倍摩尔过量的合成化合物BG-Cy3-fkl室温孵育一小时。
为了测试对不同FK506浓度的响应，组装的传感器分子在100μL正常人血清(马萨诸塞州比尔里卡的默克密理博公司)中稀释至1nM，所述血清在白色非结合96孔板中含有限定浓度的FK506(奥地利克雷姆斯米斯特的葛莱娜第一生化有限公司)。室温孵育溶液至少10分钟以确保传感器达到平衡。生物发光在EnVision多标记读数计(帕金埃尔默公司)上进行测量：测量前5秒，将在HEPES缓冲液中的100μL1μg/mL腔肠素-h(亚利桑那州派恩托普纳米光公司(NanoLight,Pinetop,AZ))通过仪器注射器加入孔中并收集信号，用伞形酮(Umbelliferone)发射滤器(波长：460nm，带宽：25nm)记录NanoLuc发射和用Cy3滤器(波长：595nm，带宽：60nm)记录Cy3发射。
图4C显示传感器对不同FK506浓度的响应。低浓度时，传感器为闭合构型，允许从NanoLuc向Cy3的高效共振能量转移，并导致低NanoLuc/Cy3发射比率。高FK506浓度时，分子内配体被置换，传感器切换为开放构型状态。该状态中从NanoLuc向Cy3的共振能量转移无效，导致高NanoLuc/Cy3发射比率。
传感器当然可用于结合FKBP12的其他药物，例如雷柏霉素。
实施例5：含BRET传感器的分析装置
本实施例证明将BRET传感器固定或吸附于固体载体上，并且当其用于分析吸收蓝光区域的样品时的惊人优势。为了测试人血清中不同浓度胆红素的效果，选取氨甲喋呤传感器SNAP-Pro30-NanoLuc-DHFRcpL24G5(参见实施例2)作为制备分析装置的代表示例。在正常人血清中用氨甲蝶呤的滴定BRET传感器，包含或不含10μM胆红素。
如实施例2所述组装传感器分子。将其在补充有20μM胆红素或不补充的50μL正常人血清中稀释至浓度10nM，所述血清在白色非结合96孔板中含有限定浓度的氨甲蝶呤(奥地利克雷姆斯米斯特的葛莱娜第一生化有限公司)。室温孵育溶液至少10分钟以确保传感器达到平衡。为了启动生物发光反应，在各孔加入HEPES缓冲液(50mMHEPES,50mMNaCl,pH7.2)中稀释50倍的50μL复立玛津(威斯康辛州菲奇堡的普洛麦格公司)。各孔取3μL然后点在Whatman1号色谱纸上(英国小查尔芬特的GE医疗公司(GEHealthcare,LittleChalfont,UnitedKingdom))，其用标准冲孔机生成并置于相同96-孔板的空孔中。含溶液的孔以及含纸的孔中的生物发光在EnVision多标记读数计(帕金埃尔默公司公司)上进行测量：收集信号，用伞形酮(Umbelliferone)发射滤器(波长：460nm，带宽：25nm)记录NanoLuc发射和用Cy3滤器(波长：595nm，带宽：60nm)记录Cy3发射。
图5A显示存在或不存在10μM胆红素的溶液中传感器对不同氨甲蝶呤浓度的响应。显然，胆红素强烈吸收蓝光，导致NanoLuc/Cy3(蓝光/红光)发射强度比率的降低。由于胆红素的浓度在人类血清样品中显著不同，传感器不能以这种方式使用来测量分析物浓度。相反，当传感器点在纸上时，没有再观察到胆红素的影响，如图5所示。推测此现象的原因是样品中信号的光路径显著降低。
实施例6：用相机进行BRET检测
为了证明使用普通数字相机检测BRET传感器的响应，选择氨甲蝶呤传感器SNAP-Pro30-NanoLuc-DHFRcpL24G5(参见例如2)作为示例。
如实施例2组装传感器分子。其在50μL正常人血清中稀释至100nM，所述血清掺有限定浓度的氨甲蝶呤。室温孵育溶液至少10分钟以确保传感器达到平衡。为了启动生物发光反应，加入HEPES缓冲液(50mMHEPES,50mMNaCl,pH7.2)中稀释50倍的50μL复立玛津(威斯康辛州菲奇堡的普洛麦格公司)。通过在Whatman1号色谱纸上(英国小查尔芬特的GE医疗公司)打印96孔板形状上孔形状的圆来生产由纸制成的多孔板，主要使用前述蜡打印机(Pollock等.SciTranslMed.2012；4(152):152ra129)。然后5μL的各溶液点在纸上的孔上。然后用CanonPowerShotSX150IS数字相机(日本东京的佳能公司(Canon,Tokyo,Japan))拍摄板的图片，所述拍摄通过厚纸板盒子中的孔进行以防止环境光干扰测量(参见图1A)。然后通过提取红色和蓝色通道并计算平均像素强度来分析所述图片。
6B显示所得图片，直方图显示两个孔中红色和蓝色通道中像素的强度分布。图6C显示不同氨甲蝶呤浓度下蓝色通道的平均像素强度除以红色通道的平均像素强度的比率。在板读数器的测量中也观察到相似结果(参见实施例2)。
实施例7：物理固定BRET-传感器
本实施例描述能感测药物托吡酯(Topamax；如实施例1所述)浓度的BRET传感器的合成和物理固定于玻片，以提供分析装置。传感器包含人碳酸酐酶II(HCA)作为结合蛋白，芳香磺酰胺作为分子内配体。荧光素酶和TMR形成BRET对(参见图1A、B)。此外，在传感器分子的N末端，添加用于生物素化所述传感器的AviTag肽序列(Beckett,Dorothy；Kovaleva,Elena；Schatz,PeterJ.(2008)ProteinScience8(4):921–9)。含O6-苄基鸟嘌呤(BG)基团用于SNAP-标签标记、荧光团四甲基若丹明(TMR)、和作为系连配体的4-(氨基甲基)苯磺酰胺(氨基甲基SA)的合成调节分子根据实施例1的方案1合成。
融合蛋白在大肠杆菌(E.coli)Rosetta-gami株系中表达并用C末端His标签纯化。通过用合成分子BG-TMR-氨基甲基SA标记SNAP标签来组装传感器分子(实施例1的图1B)。通过与生物素连接酶BirA、生物素和ATP孵育，用生物素标记蛋白质。生物素化的传感器分子稀释至终浓度1μg/μl。将作为薄膜的蛋白质溶液添加至包被有链霉素和素的市售可得的玻片(Arrayit公司)。玻片于4℃和环境湿度下孵育30分钟，使生物素化的传感器分子结合至固定化的链霉亲和素。然后洗涤玻片并用市售可得的封闭缓冲液(Arrayit公司)进行封闭。然后用PBS洗涤玻片三次并用0.1XPBS洗涤一次，用微阵列离心机旋转干燥并存于4℃。为了评估固定化的BRET传感器对不同托吡酯浓度的响应，HEPES缓冲液中含限定浓度的托吡酯和腔肠素-h(亚利桑那州派恩托普纳米光公司)的溶液点在玻片上，并用相机如实施例6所示收集信号。

Claims (27)

1.一种用于使用生物发光共振能量转移(BRET)检测样品中感兴趣的分析物的传感器分子，所述BRET传感器分子包括系连至合成的调节分子的蛋白质部分，其中
(i)所述蛋白质部分包含连接至结合蛋白(BP)的荧光素酶(Luc)，所述结合蛋白(BP)能结合所述感兴趣的分析物；
(ii)所述合成的调节分子包含能分子内结合BP的配体(L)，以及能接受存在合适Luc底物时通过共振能量转移的来自所述Luc的能量的荧光受体，和
(iii)其中分析物与BP的结合改变BRET传感器分子的BP和L的分子内结合的程度，从而导致BRET效率的变化。
2.如权利要求1所述的传感器分子，其中所述合成的调节分子，优选通过天然或非天然氨基酸或通过蛋白质标记标签，位置特异地系连至所述蛋白质部分。
3.如权利要求1所述的传感器分子，其中所述蛋白质标记标签是自标记蛋白质，例如SNAP-标签、CLIP-标签或Halo-标签，且其中所述合成的调节分子通过合适的反应基团进行系连。
4.如权利要求2所述的传感器分子，其中所述蛋白质标记标签是通过酶的作用进行标记的标签，所述酶例如分选酶、硫辛酸连接酶或磷酸泛酰巯基乙胺转移酶。
5.如权利要求2所述的传感器分子，其中所述氨基酸是半胱氨酸或非天然氨基酸，所述氨基酸允许位置特异性化学偶联反应，例如点击化学。
6.如前述权利要求中任一项所述的传感器分子，其中Luc是纳米荧光素酶(NanoLuc)。
7.如前述权利要求中任一项所述的传感器分子，其中所述感兴趣的分析物是药物、代谢物、蛋白质、生物标记物或核酸分子。
8.如权利要求7所述的传感器分子，其中所述BP是二氢叶酸还原酶(DHFR)或其环状排列的变体，优选与作为分子内配体的甲氧苄啶、氨甲蝶呤或其变体组合。
9.如权利要求7所述的传感器分子，其中所述BP是人碳酸酐酶(HCA)，优选与作为分子内配体的4-(氨基甲基)苯磺酰胺或其变体组合。
10.如权利要求7所述的传感器分子，其中所述BP是FK506结合蛋白(FKBP)，优选与作为分子内配体的三甲氧基苯基脯氨酰胺N-苯甲酰苯胺或其变体组合。
11.如权利要求7所述的传感器分子，其中所述BP是DIG10.3，优选与作为分子内配体的孕酮或其变体组合。
12.如权利要求7所述的传感器分子，其中所述BP是亲环蛋白A(CypA)或其环状排列的变体，优选与作为分子内配体的5-(对-氨基苄基)-海因酸乙酯、环孢霉素A或其变体组合。
13.一种包含前述权利要求中任一项所述的BRET传感器分子的分析装置，其中所述传感器分子以如下方式排列，当所述装置用于检测样品中感兴趣的分析物时，从所述传感器分子发射的和由检测器收集的光子穿过所述样品的距离短于330μm。
14.如权利要求13所述的装置，其中所述传感器分子固定于或吸附于固体载体，优选玻璃或透明塑料。
15.如权利要求13所述的装置，其中所述传感器分子吸附于纸载体或凝胶，优选色谱纸或滤纸。
16.如权利要求13所述的装置，其中所述传感器分子包含在薄膜中，或限制在管中、毛细管中或(微流体)室中。
17.多组件试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-12中任一项所述的BRET传感器分子和固体载体，优选所述固体载体是纸或透明物体，更优选色谱纸或滤纸、玻璃或透明塑料。
18.如权利要求17所述的试剂盒，还包括荧光素酶底物，优选腔肠素、复立玛津或其衍生物。
19.一种使用生物发光共振能量转移(BRET)体外检测样品中感兴趣的分析物的方法，所述方法包括步骤：
a)将所述样品与BRET传感器接触，所述传感器包含作为分开实体或单一分子的生物发光供体蛋白和荧光受体，所述接触在允许分析物诱导的BRET变化发生的条件下进行；和
b)在至少所述BRET传感器或其生物发光供体蛋白组分固定于或吸附于固体载体的条件下分析能量共振转移。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述BRET传感器或其生物发光供体蛋白组分固定于或吸附于固体载体，优选所述固体载体是纸或透明物体。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述生物发光供体蛋白具有荧光素酶活性且其中步骤(a)于合适底物存在下进行，所述底物优选腔肠素、复立玛津或其衍生物。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述BRET传感器分子是权利要求1-12中任一项所述的传感器分子。
23.一种使用生物发光共振能量转移(BRET)体外检测样品中感兴趣的分析物的方法，所述方法包括步骤：
(a)将所述样品与权利要求1-12中任一项所述的BRET传感器分子接触，所述接触在允许分析物诱导的BRET变化发生的条件下进行；和
(b)分析能量共振转移。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述步骤(b)在溶液中进行。
25.如权利要求23所述的方法，包括使用权利要求13-16中任一项所述的分析装置。
26.如权利要求19-25中任一项所述的方法，其中所述样品是生物样品或其部分，优选体液，更优选选自：血液、血清、唾液、尿液、脊液、脓液、汗液、泪液、乳液。
27.如权利要求19-26中任一项所述的方法，其中所述样品吸收蓝光区域中的光。
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