KR20210072040A - 코엘렌테라진 및 이의 유사체 및 유도체를 안정화하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

코엘렌테라진 및 이의 유사체 및 유도체를 안정화하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20210072040A
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Abstract

코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체를 안정화하고, 코엘렌테라진 및 이의 유사체 및 유도체의 용해도 및 재구성 효율을 개선하기 위한 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다.

Description

코엘렌테라진 및 이의 유사체 및 유도체를 안정화하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호인용
본 출원은 2018년 10월 3일자로 출원된 미국 가특허 출원 제 62/740,622 호 및 2019년 2월 14일자로 출원된 미국 가특허 출원 제 62/805,517 호의 우선권 및 이익을 주장하며, 이들 각각의 전문은 모든 목적상 본 명세서에서 참고로 포함된다.
코엘렌테라진, 및 이의 유사체 및 유도체를 안정화하고 코엘렌테라진 및 이의 유사체 및 유도체의 용해도 및 재구성 효율(reconstitution efficiency)을 개선하기 위한 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다.
발광은 생물학적 분석에서 리포터 분자(reporter molecule)의 활성의 측정치로서 사용된다. 리포터 분자는 결국 발광 측정치를 전사(유전자 발현), 번역(단백질 발현), 단백질-단백질 상호 작용 등과 같은 목적한 생물학적 프로세서와 결합하며, 이로써 생물학적 프로세스에서 발생하는 변화의 정량적 측정을 가능하게 한다. 리포터 분자는 일반적으로는 발광성 기질(luminogenic substrate)과 함께 제공될 때 광(light)의 생성(즉, 발광)을 초래하는 발광성 효소(예를 들어, 반딧불이 루시페라아제, 레닐라(Renilla) 루시페라아제, 오플로포러스(Oplophorus) 루시페라아제, 등)이다.
코엘렌테라진, 및 이의 유사체 및 유도체와 같은 발광성 기질은 저장(예를 들어, 유기 용매 중에 저장, 고온에서의 저장, 부정확한 pH에서의 저장, 등) 중에 분해되고, 이로써 생물학적 분석에서 첨가하거나 또는 사용하기 전에 기질의 소실을 초래할 수 있다. 이러한 분해는 온도에 의존하여 시간이 지남에 따라 용액 중의 발광성 기질의 불안정을 초래할 수 있다. 이러한 분해는 발광성 기질의 낭비뿐만 아니라 분해된 발광성 기질을 사용하는 생물학적 분석으로부터 유도되는 발광 측정의 감도 및 재현성의 감소를 초래한다. 이러한 분해의 생성물은 또한 발광 반응을 억제한다. 또한, 일부 코엘렌테라진은 다른 분석 완충액 중에서 또는 직접 테스트 샘플로 낮은 용해도를 갖거나 또는 다른 분석 완충액 중에서 일관되지 않은 재구성을 나타낼 수 있다. 코엘렌테라진은 적절한 완충 용액으로 희석하기 전에 유기 용매 중에 용해될 수 있지만, 코엘렌테라진 화합물의 유기 용액은 저장시에 불안정(열적 불안정 및 광-불안정 모두)하게 될 수 있다. 그러나, 고체 코엘렌테라진 및 코엘렌테라진 유사체 및 유도체(예를 들어, 퓨리마진)이 유기 용액보다 훨씬 더 안정하기는 하지만, 특히 비-유기성 용매가 요구되는 경우에는, 극히 열악한 재구성 속도 및 효율을 나타내고, 일관성 없이 용해되며, 분석 및 다른 방법에서 직접 사용하기가 어렵다. 이러한 결점들은 코엘렌테라진, 및 그의 유사체 및 유도체를 개발하는 응용 분야의 수와 유형을 크게 제한하여 왔다.
따라서, 발광성 기질을 안정화하고, 그의 용해도를 개선하고, 및/또는 재구성 효율을 증가시키기 위한 새로운 조성물 및/또는 방법이 요구되고 있다. 특히, 물리적 특성 및/또는 용해도가 개선된 기질을 갖는 것이 장기 저장(예를 들어, 실온에서 ≥ 12 개월), 분석 포맷(들) 호환성, 견고성 및 사용자 친화성에 유익하다.
코엘렌테라진 또는 이의 유사체 또는 유도체와 같은 발광성 기질을 안정화하고 용해도 및/또는 재구성 효율을 개선하기 위한 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 상이한 고체 조성, 제형, 및 포맷 내에서의 기질의 화학적 완전성 및/또는 재구성 효율의 특성화는 HPLC, 흡광도 및 질량 분광법을 이용하여 수행하였다. 분석 관련 조건 하에서의 기질의 추가적인 기능적 특성화는 NanoLuc® 효소의 존재하에 RLU(Relative Light Unit)를 통해 생물 발광을 모니터링함으로써 수행하였다.
코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물, 및 중합체를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 화합물은 코엘렌테라진, 코엘렌테라진-h, 코엘렌테라진-h-h, 퓨리마진, JRW-0238, JRW-1743, 및 JRW-1744로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 화합물은 퓨리마진이다. 일부 실시형태에서, 화합물은 JRW-0238이다. 일부 실시형태에서, 화합물은 JRW-1743이다. 일부 실시형태에서, 화합물은 JRW-1744이다.
일부 실시형태에서, 중합체는 자연-발생성 바이오 중합체(naturally-occurring biopolymer)이다. 일부 실시형태에서, 자연-발생성 바이오 중합체는 풀루란, 트레할로스, 말토스, 셀룰로스, 덱스트란, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 자연-발생성 바이오 중합체는 풀루란이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 사이클릭 사카라이드 중합체 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 하이드록시프로필 β-사이클로덱스트린이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 합성 중합체이다. 일부 실시형태에서, 합성 중합체는 폴리스티렌, 폴리(메트)아크릴레이트, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 합성 중합체는 적어도 하나의 폴리(프로필렌 옥사이드) 블록 및 적어도 하나의 폴리(에틸렌 옥사이드) 블록을 포함하는 블록 공중합체이다. 일부 실시형태에서, 합성 중합체는 폴록사머이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 완충액, 계면활성제, 환원제, 염, 라디칼 소거제, 킬레이트제, 단백질, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 인산염 완충액, 트리신, 및 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산으로부터 선택되는 완충액을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 및 폴리소르베이트 80으로부터 선택되는 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 티오우레아 및 6-아자-2-티오티민으로부터 선택되는 환원제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 염화나트륨 및 인산나트륨으로부터 선택되는 염을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 아스코르브산 및 아스코르브산 나트륨으로부터 선택되는 라디칼 소거제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 킬레이트제를 추가로 포함하며, 이러한 킬레이트제는 시트르산 및 트랜스-1,2-디아미노사이클로헥산-테트라아세트산으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 소 혈청 알부민, 젤라틴, 및 돼지 기원의 고도로 정제된 진피 콜라겐의 폴리펩티드 분획으로부터 선택되는 단백질을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 동결 건조된 분말 또는 케이크의 형태이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 가단성(malleable) 필름의 형태이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 용액이다.
코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물; 및 페이퍼 또는 섬유 매트릭스, 플라스틱, 유리, 또는 금속으로부터 선택되는 표면(surface)을 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 화합물은 코엘렌테라진, 코엘렌테라진-h, 코엘렌테라진-h-h, 퓨리마진, JRW-0238, JRW-1743, 및 JRW-1744로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 화합물은 퓨리마진이다. 일부 실시형태에서, 화합물은 JRW-0238이다. 일부 실시형태에서, 화합물은 JRW-1743이다. 일부 실시형태에서, 화합물은 JRW-1744이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 중합체를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체는 자연-발생성 바이오 중합체이다. 일부 실시형태에서, 자연-발생성 바이오 중합체는 풀루란, 트레할로스, 말토스, 셀룰로스, 덱스트란, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 자연-발생성 바이오 중합체는 풀루란이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 사이클릭 사카라이드 중합체 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 하이드록시프로필 β-사이클로덱스트린이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 합성 중합체이다. 일부 실시형태에서, 합성 중합체는 폴리스티렌, 폴리(메트)아크릴레이트, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 합성 중합체는 적어도 하나의 폴리(프로필렌 옥사이드) 블록 및 적어도 하나의 폴리(에틸렌 옥사이드) 블록을 포함하는 블록 공중합체이다. 일부 실시형태에서, 합성 중합체는 폴록사머이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 완충액, 계면활성제, 환원제, 염, 라디칼 소거제, 단백질 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 인산염 완충액, 트리신, 및 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산으로부터 선택되는 완충액을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 및 폴리소르베이트 80으로부터 선택되는 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 티오우레아 및 6-아자-2-티오티민으로부터 선택되는 환원제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 염화나트륨 및 인산나트륨으로부터 선택되는 염을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 아스코르브산 및 아스코르브산 나트륨으로부터 선택되는 라디칼 소거제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 킬레이트제를 추가로 포함하며, 이러한 킬레이트제는 시트르산 및 트랜스-1,2-디아미노사이클로헥산-테트라아세트산으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 소 혈청 알부민, 젤라틴, 및 돼지 기원의 고도로 정제된 진피 콜라겐의 폴리펩티드 분획으로부터 선택되는 단백질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 표면은 셀룰로스 페이퍼, 니트로셀룰로스 페이퍼, 나일론 페이퍼, 코튼지, 폴리에스테르 페이퍼, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 다공성 또는 중합체성 멤브레인, 고순도 코튼 섬유, 코튼/레이온 혼방 고순도 코튼, 및 유리 마이크로 섬유로부터 선택된다.
코엘렌테라진 화합물 또는 이의 유사체 또는 유도체를 유효량의 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉시켜 조성물을 형성하는 단계를 포함하는, 코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물을 안정화시키는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 화합물은 열적 분해, 화학적 분해, 광-유도 분해, 또는 이들의 임의의 조합에 대해 안정화된다.
코엘렌테라진 화합물 또는 이의 유사체 또는 유도체를 유효량의 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉시켜 조성물을 형성하는 단계를 포함하는, 코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물의 용해도를 개선하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 화합물의 용해도는 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉되지 않은 화합물에 비하여 수용액 중에서 개선된다.
코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물의 재구성 속도(reconstitution rate)를 개선하는 방법으로서, 코엘렌테라진 화합물 또는 이의 유사체 또는 유도체를 유효량의 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉시켜 조성물을 형성하는 단계를 포함하며, 상기 화합물에 대한 재구성 속도는 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉되지 않은 화합물에 비하여 개선되는 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시형태에서, 상기 화합물은 코엘렌테라진, 코엘렌테라진-h, 코엘렌테라진-h-h, 퓨리마진, JRW-0238, JRW-1743, 및 JRW-1744로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 화합물은 퓨리마진이다. 일부 실시형태에서, 화합물은 JRW-0238이다. 일부 실시형태에서, 화합물은 JRW-1743이다. 일부 실시형태에서, 화합물은 JRW-1744이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 자연-발생성 바이오 중합체이다. 일부 실시형태에서, 자연-발생성 바이오 중합체는 풀루란, 트레할로스, 말토스, 셀룰로스, 덱스트란, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 자연-발생성 바이오 중합체는 풀루란이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 사이클릭 사카라이드 중합체 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 하이드록시프로필 β-사이클로덱스트린이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 합성 중합체이다. 일부 실시형태에서, 합성 중합체는 폴리스티렌, 폴리(메트)아크릴레이트, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 합성 중합체는 적어도 하나의 폴리(프로필렌 옥사이드) 블록 및 적어도 하나의 폴리(에틸렌 옥사이드) 블록을 포함하는 블록 공중합체이다. 일부 실시형태에서, 합성 중합체는 폴록사머이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 완충액, 계면활성제, 환원제, 염, 라디칼 소거제, 단백질 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 인산염 완충액, 트리신, 및 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산으로부터 선택되는 완충액을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 및 폴리소르베이트 80으로부터 선택되는 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 티오우레아 및 6-아자-2-티오티민으로부터 선택되는 환원제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 염화나트륨 및 인산나트륨으로부터 선택되는 염을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 아스코르브산 및 아스코르브산 나트륨으로부터 선택되는 라디칼 소거제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 킬레이트제를 추가로 포함하며, 이러한 킬레이트제는 시트르산이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 소 혈청 알부민, 젤라틴, 및 돼지 기원의 고도로 정제된 진피 콜라겐의 폴리펩티드 분획으로부터 선택되는 단백질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 페이퍼 또는 섬유 매트릭스는 셀룰로스 페이퍼, 니트로셀룰로스 페이퍼, 나일론 페이퍼, 코튼지, 폴리에스테르 페이퍼, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 다공성 또는 중합체성 멤브레인, 고순도 코튼 섬유, 코튼/레이온 혼방 고순도 코튼, 및 유리 마이크로 섬유로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 접촉 단계는: 화합물을 유기 용매 중에 용해시켜 제 1 용액을 형성하는 단계; 상기 제 1 용액을 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; 및 상기 혼합물을 건조하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혼합 단계는 중합체를 제 2 용액 중에 용해시키는 단계 및 상기 제 2 용액을 제 1 용액과 혼합하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혼합 단계는 제 1 용액을 페이퍼 또는 섬유 매트릭스에 적용하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 건조 단계는 동결 건조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 건조 단계는 공기 건조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 건조는 불활성 대기 중 주위 온도에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 건조는 진공 건조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 건조는 약 30℃ 내지 약 70℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 용액 중 하나 또는 전부는 탈산소화된다.
일부 실시형태에서, 방법은 화합물을 중합체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 중합체를 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 중합체를 중합체 및 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉시키는 것을 포함한다.
본원에서 개시되는 조성물 중 임의의 하나를 포함하는 키트가 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 용기 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 복수의 튜브 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 복수의 페이퍼 스폿(paper spot)의 형태이고, 각각의 스폿은 약 2 mm 내지 약 5 mm의 직경을 갖는다.
도 1a-c는 본 개시에 따른 조성물을 실시예 1에 기술된 바와 같이 (A) 인산염 완충 염수(PBS: phosphate buffered saline), pH 7.0 및 (B) Nano-Glo® 루시페라아제 분석 완충액에서 발광 출력에 대해 테스트하였을 때의 신호 동력학(signal kinetics)을 나타낸다. 도 1(c)는 풀루란 기반 동결 건조된 케이크 및 풀루란 필름-액적(droplet) 제형에서 퓨리마진 기질 샘플의 이미지를 나타낸다.
도 2a-c는 본 개시에 따른 조성물을 실시예 1에 기술된 바와 같이 PBS, pH 7.0에서 발광 출력에 대해 테스트하였을 때의 정제된 NanoLuc® 효소의 첨가 후 다양한 시점에서의 RLU 값을 나타낸다.
도 3a-c는 본 개시에 따른 조성물을 실시예 1에 기술된 바와 같이 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 완충액에서 발광 출력에 대해 테스트하였을 때의 정제된 NanoLuc® 효소의 첨가 후 다양한 시점에서의 RLU 값을 나타낸다.
도 4a-c는 본 개시에 따른 조성물을 실시예 2에 기술된 바와 같이 PBS, pH 6.8에서 210 내지 600 nm의 범위에 걸친 흡광도에 대해 테스트하였을 때의 수용액 중에서의 흡광도 값을 나타낸다.
도 5는 실시예 3에 기술된 바와 같이 PBS, pH 7.0으로 재구성하는 본 개시에 따른 조성물의 능력을 입증하는 이미지를 나타낸다.
도 6a-b는 실시예 4에 기술된 바와 같이 PBS, pH 6.8에서 풀루란의 210 내지 600 nm의 범위에 걸친 흡광도 값을 나타낸다.
도 7a-b는 실시예 5에 기술된 바와 같이 재구성 후 (A) 0 시간 및 (B) 5 시간 후에 퓨리마진을 함유하는 0% w/v 풀루란 기반 동결 건조된 케이크 제형에 대한 대표적인 HPLC 트레이스(HPLC trace)를 나타낸다.
도 8a-b는 실시예 5에 기술된 바와 같이 재구성 후 (A) 0 시간 및 (B) 5 시간 후에 퓨리마진을 함유하는 2.5% w/v 풀루란 기반 동결 건조된 케이크 제형에 대한 대표적인 HPLC 트레이스를 나타낸다.
도 9a-b는 실시예 5에 기술된 바와 같이 재구성 후 (A) 0 시간 및 (B) 5 시간 후에 퓨리마진을 함유하는 15% w/v 풀루란 기반 동결 건조된 케이크 제형에 대한 대표적인 HPLC 트레이스를 나타낸다.
도 10a-b는 실시예 5에 기술된 바와 같이 재구성 후 (A) 0 시간 및 (B) 5 시간 후에 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질에 대한 대표적인 HPLC 트레이스를 나타낸다.
도 11a-b는 실시예 5에 기술된 바와 같이 풀루란의 존재 또는 부재하에 제형화된 퓨리마진 샘플에 대한 HPLC 트레이스의 분석을 나타내며, (a)는 시간 경과에 따른 254 nm에서의 흡광도 및 (b)는 시간 경과에 따른 피크 면적을 나타낸다.
도 12는 실시예 5에 기술된 바와 같이 시간 경과에 따른 아미노피라진 분해 생성물의 생성을 나타내는 풀루란의 존재 또는 부재하에 제형화된 퓨리마진 샘플에 대한 HPLC 트레이스로부터의 데이터를 나타낸다.
도 13a-c는 (A) 조성물을 실시예 6에 기술된 바와 같이 발광 출력에 대해 테스트하였을 때의 RLU 값의 동력학적 분석 값; (B) 조성물을 실시예 6에 기술된 바와 같이 발광 출력에 대해 테스트하였을 때의 0시간에서의 RLU 값; 및 (C) 실시예 6에 기술된 바와 같이 제조된, 홀 펀칭(hole punching) Whatman® 903 단백질 세이버 카드(protein saver card)로부터 생성된 페이퍼 스폿의 이미지를 나타낸다.
도 14a-b는 실시예 7에 추가로 기술된 바와 같이 제형화된 퓨리마진 샘플을 Whatman® 903 단백질 세이버 카드 상에서 건조시킨 다음 (A) 4℃에서 2 주 또는 (B) 4℃ 또는 25℃에서 3 개월 동안 유지한 샘플의 이미지를 나타낸다.
도 15a-d는 실시예 8에 기술된 바와 같이 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성된 페이퍼 스폿으로 건조된 제형화된 퓨리마진 샘플의 분석 성능에 대한 첨가제의 효과를 나타내는 데이터를 나타낸다.
도 16은 실시예 9에 기술된 바와 같이 제조된 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성된 페이퍼 스폿에서 제형화된 퓨리마진 샘플의 RLU 출력을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 17a-c는 실시예 9에 기술된 바와 같이 제조된 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성되고 (A) 4℃, (B) 25℃, 및 (C) 37℃.에서 1일간 저장 후에 테스트한 페이퍼 스폿에서 퓨리마진 샘플의 RLU 출력을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 18a-c는 실시예 9에 기술된 바와 같이 제조된 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성되고 (A) 4℃, (B) 25℃, 및 (C) 37℃에서 3일 동안 저장한 후에 테스트한 페이퍼 스폿에서 제형화된 퓨리마진 샘플의 RLU 출력을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 19a-d는 실시예 10에 기술된 바와 같이 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성되고 상이한 단백질 완충액으로 전처리한 다음 정제된 NanoLuc® 효소로 테스트한 페이퍼 스폿 내에 배치된 제형화된 퓨리마진 샘플에 대한 데이터로서, (A) 60℃ 및 (B) 25℃에서 스폿 저장한 후의 RLU 출력 및 (C) 60℃ 및 (D) 25℃에서 스폿 저장한 후의 % 경시 활성을 나타낸다.
도 20a-d는 실시예 10에 기술된 바와 같이 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성되고 25℃ 또는 60℃에서 저장한 후 일수에 따른 기질 활성에 대해 테스트한 페이퍼 스폿에서 제형화된 퓨리마진 샘플의 RLU 출력을 입증하는 가속 안정성 데이터로로서, (A) 60℃ 및 (B) 25℃에서 스폿 저장한 후의 RLU 출력 및 (C) 60℃ 및 (D) 25℃에서 스폿 저장한 후의 % 경시 활성을 나타낸다.
도 21a-c는 실시예 11에 기술된 바와 같이 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성되고 상이한 건조 방법을 사용하여 제조된 페이퍼 스폿에서 제형화된 퓨리마진 샘플의 RLU 출력을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 22a-d는 실시예 11에 기술된 바와 같이 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성되고 상이한 건조 방법을 사용하여 제조된 페이퍼 스폿에서 제형화된 퓨리마진 샘플의 RLU 출력 및 일수에 따른 퍼센트 활성을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 23a-b는 실시예 12에 기술된 바와 같이 60℃에서 A - 0시간, 및 B - 48시간 동안 저장한 후의 대표적인 풀루란 기반 동결 건조된 퓨리마진 샘플에 대한 HPLC 트레이스를 나타낸다.
도 24a-b는 실시예 12에 기술된 바와 같이 저장(60℃에서 도 24a는 0시간, 도 24b는 48시간)한 후의 시판되고 있는 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질 샘플에 대한 HPLC 트레이스를 나타낸다.
도 25a-d는 실시예 12에 기술된 바와 같이 제형화된 퓨리마진 샘플의 열적 안정성을 원시 영역(raw area)(도 25a는 25℃, 도 25b는 60℃)으로서 및 퍼센트 영역(도 25c는 25℃, 도 25d는 60℃)으로서 나타내는 HPLC 분석 데이터를 나타낸다.
도 26a-f는 퓨리마진 샘플의 저장 후에 정제된 NanoLuc® 효소로 테스트한 제형화된 퓨리마진 샘플에 대한 RLU 데이터를 나타낸다. 도 26a-c는 50μM 기질(A), 10μM 기질(B) 및 0.1μM 기질(C)을 사용하여 재구성 및 테스트하기 전에 다양한 기간 동안 60℃에서 저장된 샘플에 대한 데이터를 보여주며; 도 26d-f는 실시예 12에 기술된 바와 같이 50μM 기질(D), 10μM 기질(E) 및 0.1μM 기질(F)을 사용하여 재구성 및 테스트하기 전에 다양한 기간 동안 25℃에서 저장된 샘플에 대한 데이터를 나타낸다.
도 27a-f는 제형화된 퓨리마진 샘플을 퓨리마진 샘플의 저장 후에 정제된 NanoLuc® 효소로 활성에 대해 테스트하였을 때 제로(0) 시간에서의 기질 활성 백분율을 나타낸다. 도 27a-c는 50μM 기질(A), 10μM 기질(B) 및 0.1μM 기질(C)을 사용하여 재구성 및 테스트하기 전에 다양한 기간 동안 60℃에서 저장된 샘플에 대한 데이터를 나타내며; 도 26d-f는 실시예 12에 기술된 바와 같이 50μM 기질(D), 10μM 기질(E), 또는 0.1μM 기질(F)을 사용하여 재구성 및 테스트하기 전에 다양한 기간 동안 25℃에서 저장된 샘플에 대한 데이터를 나타낸다.
도 28a-c는 실시예 13에 기술된 바와 같이 정제된 NanoLuc® 효소로 테스트하였을 때 퓨리마진 기질을 함유하는 제형화된 풀루란 필름 코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 대한 RLU 데이터를 나타낸다.
도 29는 실시예 13에 기술된 바와 같이 풀루란 필름 매트릭스 내에서 표준 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 바닥을 코팅하는 퓨리마진을 함유하는 풀루란 기반 필름 포맷의 대표적인 예를 나타낸다.
30a-c는 퓨리마진을 단독으로 함유하거나 또는 NanoLuc® 효소와의 반응 또는 웰용 PBS로 간단한 재구성 후 표준 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 바닥에 부착된 NanoLuc® 효소를 또한 함유하는 풀루란 기반 필름의 대표적인 예에 대한 데이터를 나타내며, 여기서 NanoLuc® 효소는 퓨리마진 제형과 동시에 배치되었으며; 도 30a는 미가공 RLU를 나타내고; 도 30b는 % 활성을 나타내며; 도 30c는 실시예 13에 기술된 바와 같이 10일간에 걸친 % 활성을 나타낸다.
도 31a-f는 실시예 14에 기술된 바와 같이 시판되고 있는 퓨리마진 제품과 비교하였을 때 각각의 조건에 대해 25℃(첫 번째 막대) 또는 60℃(두 번째 막대)에서 저장한 후 풀루란 기반 동결 건조된 케이크로서 제조된 퓨리마진에 대한 분해 생성물의 정규화된 흡광도를 나타낸다.
도 32a-f는 실시예 14에 기술된 바와 같이 시판되고 있는 퓨리마진 제품과 비교하였을 때 각각의 조건에 대해 25℃(첫 번째 막대) 또는 60℃(두 번째 막대)에서 저장한 후 풀루란 기반 동결 건조된 케이크로서 제조된 퓨리마진에 대한 분해 생성물의 상대적인 면적 백분율을 나타낸다.
도 33a-b는 실시예 15에 기술된 바와 같이 6개월 동안 실온에서 저장된 퓨리마진을 함유하는 풀루란 기반 포맷의 대표적인 예에 대한 데이터를 나타낸다.
도 34a-c는 실시예 16에 기술된 바와 같이 상이한 유형의 페이퍼 매트릭스 상에서 건조된 퓨리마진 샘플의 HPLC 분석의 대표적인 예를 나타낸다.
도 35a-b는 재구성 후 3개의 상이한 고상 물질 상에서 리포터 단백질인 LgTrip으로 제형화된 퓨리마진의 샘플로부터의 생물 발광 신호의 대표적인 예를 나타낸다.
도 36a-c는 실시예 17에 기술된 바와 같이 상이한 유형의 페이퍼 매트릭스 상에서 아스코르브산과 1:1 혼합물로서 저장된 퓨리마진 샘플의 HPLC 분석의 대표적인 예를 나타낸다.
도 37a-c는 실시예 18에 기술된 바와 같이 30% 시트르산으로 예비 처리된 페이퍼 매트릭스 상에서 저장된 퓨리마진 샘플의 HPLC 분석의 대표적인 예를 나타낸다.
도 38a-c는 실시예 19에 기술된 바와 같이 매트릭스를 물로 예비 처리하고 밤새 감압 하에 건조한 후 페이퍼 매트릭스 상에 저장된 퓨리마진 샘플의 HPLC 분석의 대표적인 예를 나타낸다.
도 39a-d는 실시예 20에 기술된 바와 같이 상이한 페이퍼 매트릭스 상에서 시트르산과 1:1 혼합물로서 저장된 퓨리마진의 HPLC 분석의 대표적인 예를 나타낸다.
도 40a-c는, 단백질 완충액의 존재 또는 부재 하에 실시예 21에 기술된 바와 같이 시트레이트 또는 아스코르베이트와 1:1 몰비의 퓨리마진으로 처리된, 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성되고 다양한 건조 방법을 사용하여 제조된 Whatman® 903 페이퍼 스폿에서 제형화된 퓨리마진 샘플의 최대 RLU(위) 및 % 활성(아래)의 대표적인 예를 나타낸다.
도 41은 실시예 22에 기술된 바와 같이 상이한 조건 하에 저장되고 25℃에서 저장 일수에 따라 샘플링된 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성된 페이퍼 스폿에서 제형화된 퓨리마진 샘플의 일수에 따른 RLU 출력 및 % 활성을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 42는 실시예 23에 기술된 바와 같이 기질이 고체 매트릭스 지지체로부터 방출되는 경우를 결정하기 위해 원래의 웰에서 스폿을 제거하기 전 및 후에 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성된 페이퍼 스폿에서 제형화된 퓨리마진 샘플의 RLU 출력 및 % 신호 복원율을 나타내는 데이터를 나타낸다.
도 43a-c는 실시예 24에 기술된 바와 같이 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성된 페이퍼 스폿에서 다양한 pH에서 아스코르베이트의 존재 또는 부재뿐만 아니라 상이한 사카라이드 또는 중합체 성분을 함유하는 다양한 제형화된 퓨리마진 용액의 RLU 출력 및 % 활성을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 44a-c는 실시예 25에 기술된 바와 같이 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성된 페이퍼 스폿에서 고정 pH = 7.0에서 다양한 제형화된 퓨리마진 용액 성분의 RLU 출력 및 % 활성을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 45a-b는 실시예 26에 기술된 바와 같이 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성되고 25℃에서 저장 일수에 따라 샘플링된 페이퍼 스폿에서 다양한 제형화된 퓨리마진 용액의 RLU 출력을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 46a-b는 실시예 27에 기술된 바와 같이 홀 펀칭 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 생성되고 25℃에서 저장 일수에 따라 샘플링된 페이퍼 스폿에서 Prionex, 아스코르베이트 및/또는 ATT를 함유하는 다양한 제형화된 퓨리마진 용액의 RLU 출력을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 47a-b는 실시예 28에 기술된 바와 같이 96-웰 마이크로타이터 플레이트 내에 직접 동결 건조된 퓨리마진 제형의 RLU 출력을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 48은 실시예 29에 기술된 바와 같이 퓨리마진 제형이 다층 장치의 하나의 층에 배치되는 예시적인 층상 분석 포맷의 어셈블리의 예언적 도면(prophetic drawing)을 나타낸다.
도 49는 실시예 30에 기술된 바와 같이 37℃에서 나트륨 아스코르베이트를 함유하는 Nano-Glo® 기질(Promega Cat# N113) 제형의 RLU 출력을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 50은 실시예 31에 기술된 바와 같이 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린을 함유하고 동결 건조된 Nano-Glo® 기질(Promega cat# N113) 제형의 RLU 출력을 나타내는 데이터를 나타낸다.
도 51a-b는 실시예 32에 기술된 바와 같이 특정의 개별 또는 조합된 완충액 첨가제를 함유하는 Nano-Glo® 기질(Promega cat# N113) 제형의 RLU 출력을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 52는 실시예 33에 기술된 바와 같이 풀루란 및 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린의 혼합 중합체를 다른 완충액 첨가제와 함께 함유하는 Nano-Glo® 기질(Promega cat# N113) 제형의 RLU 출력을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 53은 실시예 34에 기술된 바와 같은 제형화된 기질의 대표적인 예의 이미지를 나타낸다.
도 54a-c는 실시예 34에 기술된 바와 같이 Pluronic® F-127로 제형화된 JRW-0238 샘플의 HPLC 분석의 대표적인 예를 나타낸다.
도 55a-c는 실시예 35에 기술된 바와 같이 Pluronic® F-127로 제형화된 퓨리마진 샘플의 HPLC 분석의 대표적인 예를 나타낸다.
도 56은 실시예 36에 기술된 바와 같이 Pluronic® F-127로 제형화된 JRW-0238의 용액 샘플의 대표적인 이미지를 나타낸다.
도 57은 실시예 36에 기술된 바와 같이 Pluronic® F-127로 제형화된 JRW-0238 샘플의 HPLC 분석의 대표적인 예를 나타낸다.
도 58a-b는 실시예 37에 기술된 바와 같이 Pluronic® F-127로 제형화된 JRW-0238 샘플의 대표적인 이미지를 나타낸다.
도 59a-b는 실시예 38에 기술된 바와 같이 제형화된 JRW-0238 샘플의 대표적인 이미지를 나타낸다.
도 60a-b는 실시예 38에 기술된 바와 같이 재구성된 제형화된 JRW-0238로 복강내 주입된 마우스로부터의 트레이스 및 이미지를 나타낸다.
도 61a-b는 실시예 38에 기술된 바와 같이 재구성된 제형화된 JRW-0238로 피하 주입된 마우스로부터의 트레이스 및 이미지를 나타낸다.
도 62a-b는 실시예 39에 기술된 바와 같이 스케일 업 및 제조 후 호박색 유리 바이알 내의 제형화된 퓨리마진 동결 건조 케이크의 이미지, 및 시점일(timepoint day) "0"에서 새롭게 제조된 NanoGlo® 생세포(live cell) 기질에 대한 이러한 기질의 활성을 나타낸다.
도 63은 실시예 39에 기술된 바와 같이 본 개시에 따른 조성물을 25℃ 또는 60℃에서 배양한 다음 0.01% BSA를 함유하는 PBS, pH 7.0에서 발광 출력에 대해 테스트하였을 때의 정제된 NanoLuc® 효소의 첨가 후 다양한 시점에서의 RLU 값을 나타낸다.
도 64a-c. 다양한 합성/제형 단계에서의 JRW-1743의 이미지: (A) 왼쪽의 바이알은 용융된 Pluronic® F-127을 함유하는 반면, 오른쪽의 바이알은 EtOH 중에 용해된 JRW-1743을 함유한다; (B) EtOH를 제거한 다음, 기질/중합체 혼합물을 2.6 mL의 순수(pure water) 중에서 8.5 mM의 최종 농도로 재구성한 후의 JRW-1743; (C) 동결 건조 후의 제형화된 JRW-1743의 대표적인 예: 건조 Pluronic® F-127 매트릭스 중의 JRW-1743(왼쪽) 및 순수 중에서 재구성한 후의 동일한 물질(중간 및 오른쪽)이 묘사되어 있다.
도 65. Pluronic® F-127로 제형화되고 나노-순수 중에서 재구성된 후의 JRW-1743의 대표적인 흡광도 트레이스. 용액 중 기질의 농도는 흡광도에 의해 결정되었다. JRW-1743의 평균 농도는 물 중에서 8.5 mM인 것으로 실험적으로 결정되었다. 건조 제형화된 기질의 계산된 이론 농도는 8.7 mM이었다.
정의
본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본원에 기술된 실시형태의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 일부 바람직한 방법, 조성물, 장치 및 물질들이 본원에 기술되어 있다. 그러나, 본 발명의 물질 및 방법들을 기술하기 전에, 본 발명은 일상적인 실험 및 최적화에 따라 달라질 수 있으므로 본원에서 기술되는 특정 분자, 조성물, 방법론 또는 프로토콜로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 설명에서 사용되는 용어는 특정 버전 또는 실시형태를 설명하기 위한 것으로 본원에서 기술되는 실시형태의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그러나, 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 따라서, 본원에서 기술되는 실시형태의 맥락에서, 다음 정의를 적용한다.
본원에서 사용되는 용어 "오플로포러스 루시페라아제(Oplophorus luciferase)" 및 "오플로포러스-유래 루시페라아제(Oplophorus-derived luciferase)"는 상호 교환적으로 사용되며, 야생형, 변이체, 및 그의 돌연변이를 포함하는 심해 새우 오플로포러스 그라실리로스트리스(Oplophorus gracilirostris)(예를 들어, 서열 번호(SEQ ID NO): 1)에서 분비되는 루시페라아제를 지칭한다. 예를 들어, 적합한 오플로포러스 루시페라아제 변이체는 미국 특허 제 8,557,970 호 및 제 8,669,103 호에 기술되어 있으며, 이들 각각의 전문은 본원에서 참고로 포함된다. 예시적인 오플로포러스-유래 루시페라아제는, 예를 들어, 서열 번호: 2의 것을 포함한다(또한, 본원에서는 "NanoLuc", "Nluc", "Nluc 루시페라아제" 및 "Nluc 효소"로서 상호 교환적으로 지칭됨).
본원에서 사용되는 용어 "중합체"는 사슬이 선형 또는 분지형일 수 있는 사슬 중에 공유 결합된 2개 이상의 반복 단위를 포함하는 유기 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 중합체는 공유 화학 결합에 의해 함께 결합되어 선형 골격을 형성하는 하나 이상의 반복 단위로 구성된다. 반복 단위는 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, A가 반복 단위인 -A-A-A-A- 유형의 구조는 중합체로서, 또한 단독 중합체로도 알려져 있다. A 및 B가 반복 단위인 -A-B-A-B- 또는 -A-A-A-B-A-A-A-B- 유형의 구조도 또한 중합체로서, 때로는 공중합체라고도 한다. 본원에 사용되는 용어 "중합체"는 디사카라이드와 같은 단지 2개의 반복 단위의 사슬을 명시적으로 포함하고, 또한 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드와 같은 더 많은 반복 단위의 사슬을 포함한다. 용어 "중합체"는 또한 합성 중합체와 같은 비사카라이드계 중합체(및 단지 2개 정도로 적은 단량체 단위의 올리고머)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체(예를 들어, 폴리사카라이드) 및 올리고머(예를 들어, 올리고사카라이드)는 정의된 길이(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 750, 1000개, 또는 그 이상, 또는 이들 사이의 범위, 예를 들어, 2 내지 10개, 5 내지 25개, 10 내지 50개, 100개 초과, 등)로 제한된다.
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an"및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "중합체"에 대한 언급은 하나 이상의 중합체 및 당업자에게 공지된 이의 등가물 등에 대한 언급이다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하다" 및 이의 언어적 변형어는 추가적인 특징 (들), 요소(들), 방법 단계(들), 등의 존재를 배제하지 않고 인용된 특징(들), 요소(들), 방법 단계(들) 등의 존재를 나타낸다. 역으로, 용어 "~로 이루어진" 및 이의 언어적 변형어는 인용된 특징(들), 요소(들), 방법 단계(들) 등의 존재를 나타내며, 통상적으로 연관된 불순물을 제외한 임의의 인용되지 않은 특징(들), 요소(들), 방법 단계(들) 등은 배제한다. "~로 본질적으로 이루어진"이라는 문구는 인용된 특징(들), 요소(들), 방법 단계(들), 등, 및 조성, 시스템 또는 방법의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 임의의 추가적인 특징(들), 요소(들), 방법 단계(들), 등을 나타낸다. 본원의 많은 실시형태는 개방형 언어 "포함하는(comprising)"을 사용하여 기술한다. 이러한 실시형태는 대안적으로는 그러한 언어를 사용하여 청구하거나 기술할 수 있는 복수의 폐쇄된 "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진" 실시형태를 포함한다.
코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물 및 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스 또는 플라스틱 또는 유리와 같은 다른 표면을 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 분해(예를 들어, 열적 분해, 화학적 분해, 광-유도 분해, 등)에 대해 화합물을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 조성물은 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스 또는 다른 표면을 함유하지 않는 조성물에 비하여 분해에 대해 화합물을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 조성물은 (예를 들어, 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스 또는 다른 표면을 함유하지 않는 조성물에 비하여) 화합물로부터 하나 이상의 분해 생성물의 형성을 감소시키거나 억제한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 코엘렌테라진 또는 이의 유사체 또는 유도체의 재구성 효율을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 조성물은 (예를 들어, 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스 또는 다른 표면을 함유하지 않는 조성물에 비하여) 동적 용해도를 향상시킨다.
조성물은 코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물을 포함한다. 조성물에 혼입되었을 때, 화합물은 분해(예를 들어, 열적 분해, 화학적 분해, 광-유도 분해, 등)로부터 보호될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화합물은 하기 화학식을 갖는 코엘렌테라진이다:
Figure pct00001
코엘렌테라진
일부 실시형태에서, 화합물은 코엘렌테라진 유사체 또는 유도체이다. 예시적인 코엘렌테라진 유사체는 코엘렌테라진-h (2-데옥시코엘렌테라진 또는 2,8-디벤질-6-(4-하이드록시페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온), 코엘렌테라진-hh (디데옥시코엘렌테라진 또는 2,8-디벤질-6-페닐이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온), 퓨리마진 (8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-페닐이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온), JRW-0238 (8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(3-하이드록시페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온), JRW-1744 (6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-α]피라진-3(7H)-온, 및 JRW-1743 (6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-(2-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-α]피라진-3(7H)-온)을 포함하며, 이들은 각각 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00002
코엘렌테라진-h 코엘렌테라진-hh 퓨리마진 JRW-0238
Figure pct00003
Figure pct00004
추가의 예시적인 코엘렌테라진 유사체는 코엘렌테라진-n, 코엘렌테라진-f, 코엘렌테라진-hcp, 코엘렌테라진-cp, 코엘렌테라진-c, 코엘렌테라진-e, 코엘렌테라진-fcp, 코엘렌테라진-I, 코엘렌테라진-icp, 코엘렌테라진-v, 2-메틸 코엘렌테라진 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 화합물은 국제 공개 WO 2003/040100 호; 미국 특허공개 제 2008/0248511 호(예를 들어, 단락 [0086]); 미국 특허 제 8,669,103 호; 국제 공개 WO 2012/061529 호; 미국 특허공개 제 2017/0233789 호; 미국 특허 제 9,924,073 호; 미국 특허공개 제 2018/0030059 호; 미국 특허 제 10,000,500 호; 미국 특허공개 제 2018/0155350 호; 미국 가특허 출원 제 62/665,346 호; 미국 특허출원 제 16/399,410 호; 미국 가특허 출원 제 62/721,708 호; 미국 특허출원 제 16/548,214 호; 미국 특허공개 제 2014/0227759 호; 미국 특허 제 9,840,730 호; 미국 특허 제 7,268,229 호; 미국 특허 제 7,537,912 호; 미국 특허 제 8,809,529 호; 미국 특허 제 9,139,836 호; 미국 특허 제 10,077,244 호; 미국 특허 제 9,487,520 호; 미국 특허 제 9,924,073 호; 미국 특허 제 9,938,564 호; 미국 특허 제 9,951,373 호; 미국 특허 제 10,280,447 호; 미국 특허 제 10,308,975 호; 미국 특허 제 10,428,075 호에 기술된 코엘렌테라진 유사체일 수 있으며; 이들 문헌의 개시내용은 그의 전문이 본원에서 참고로 포함된다. 일부 실시형태에서, 코엘렌테라진 유사체는, 예를 들어, 미국 특허공개 제 2008/0248511 호; 미국 특허공개 제 2012/0707849 호; 미국 특허공개 제 2014/0099654 호; 미국 특허 제 9,927,430 호; 미국 특허 제 10,316,070 호에 기술된 것과 같은 프로-기질을 포함하며; 이들 문헌의 전문은 본원에서 참고로 포함된다. 일부 실시형태에서, 화합물은 퓨리마진이다. 일부 실시형태에서, 화합물은 JRW-0238이다. 일부 실시형태에서, 화합물은 JRW-1743이다. 일부 실시형태에서, 화합물은 JRW-1744이다.
코엘렌테라진 및 이의 유사체 및 유도체는 본원에 기술된 생물 발광 분석 및 방법과 같은 많은 분석에서 사용되는 완충액 시스템으로의 재구성과 관련된 문제를 겪을 수 있다. 예를 들어, 퓨리마진과 같은 코엘렌테라진 또는 이의 유사체 또는 유도체는 (예를 들어, 고체 물질의 불균질한 미세결정성 특성으로 인해) 비-유기 완충 용액 중에서 서서히 및/또는 일관성없이 용해될 수 있다. 완충액으로 희석하기 전에 유기 용매에 용해하면 더 빠르고 보다 일관된 결과를 얻을 수 있지만, 코엘렌테라진 화합물은 저장 중에 열적 불안정 및 광 불안정을 포함하여 유기 용액 중에서 불안정하게 될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제 9,676,997 호를 참조한다. 일부 실시형태에서, 코엘렌테라진 또는 이의 유사체 또는 유도체를 본원에 기술된 조성물에 혼입하면 이러한 불안정 문제없이 보다 신뢰할 수 있고 일관된 용해를 제공한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 중합체를 추가로 포함한다. 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 특정 실시형태에서, 중합체의 존재는 분해에 대해 화합물을 안정화시키고, 중합체의 존재는 물 또는 수용액 중에서 화합물의 용해도를 개선시킨다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 유기 용매 중의 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체와 비교하여) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 또는 유도체를 안정화함으로써, (예를 들어, 중합체 부재 하의 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 또는 유도체와 비교하여) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 또는 유도체의 수용해도를 개선하고, 및/또는 비-유기 완충액 중에서의 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체의 재구성 효율을 개선한다. 본원의 조성물 및 시스템은 비제형화 및/또는 유기상 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체가 덜 적합한(예를 들어, 온도 및 광 안정성이 아닌) 현장 관리, 사전 패키징 및/또는 고상 시스템, 방법 및 분석에서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 또는 유도체의 사용을 가능하게 한다.
중합체는 자연-발생성 바이오 중합체 또는 합성 중합체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체는 자연-발생성 바이오 중합체이다. 적합한 자연-발생성 바이오 중합체는 디사카라이드(예를 들어, 트레할로스, 말토스, 및 수크로스), 폴리사카라이드(예를 들어, 풀루란, 덱스트란, 및 셀룰로스), 및 비황화 글리코사미노글리칸(예를 들어, 히알루론산)을 포함한 탄수화물이다. 자연-발생성 바이오 중합체의 혼합물도 또한 사용될 수 있다. 중합체는 작용화된 셀룰로스(예를 들어, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 등)와 같은 자연-발생성 중합체의 유도체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 중합체는 말토트리오스 반복 단위를 포함하는 폴리사카라이드인 풀루란이다. 말토트리오스는 α-1,4 글리코사이드 결합을 통해 연결된 3개의 글루코스 단위를 포함하는 트리사카라이드이다. 풀루란 중합체 내의 말토트리오스 단위는 α-1,6 글리코사이드 결합을 통해 서로 연결된다. 풀루란은 균류 오레오바시둠 플루란스(Aureobasidum pullulans)에 의해 전분으로부터 자연적으로 생성되며, 일반적으로는 약 4.5 x 104 내지 약 6 x 105 Da의 질량 범위를 갖고 다양한 공급업체로부터 시판(CAS No. 9057-02-7)되고 있다.
일부 실시형태에서, 중합체는 글루코스 반복 단위를 포함하는 복합 분지형 폴리사카라이드인 덱스트란이다. 직쇄 결합은 일반적으로 α-1,6 글리코시드 결합에 의해 형성되는 반면 분지는 일반적으로 α-1,3 결합에서 시작된다. 자연-발생성 덱스트란은 약 9 kDa 내지 약 2000 kDa 범위의 분자량을 가질 수 있다. 덱스트란은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)를 포함한 특정 박테리아에 의해 수크로스로부터 합성될 수 있다. 류코노스톡 메센테로이데스에 의해 생성되는 시판 덱스트란(CAS No. 9004-54-0)은 Sigma Aldrich를 비롯한 다양한 공급업체에서 구입할 수 있으며, 약 1 kDa 내지 약 670 kDa 범위의 다양한 분자량 범위를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 중합체는 사이클로덱스트린과 같은 사이클릭 사카라이드 중합체이다. 전형적인 사이클로덱스트린은 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, 및 γ-사이클로덱스트린이며, 각각 6개, 7개, 및 8개의 글루코피라노스 단위를 가지고 있다. 글루코피라노스 단위는 작용화될 수 있다. 예시적인 사이클로덱스트린은 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린이다.
일부 실시형태에서, 중합체는 비-황화 글리코사미노글리칸이다. 글리코사미노글리칸은 디사카라이드 반복 단위를 갖는 선형 폴리사카라이드로서, 각각의 반복 단위는 하나의 아미노 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민) 및 우론 당 (글루쿠론산 또는 이두론산) 또는 갈락토스를 포함한다. 예시적인 비-황화 글리코사미노글리칸은 반복되는 디사카라이드가 교대하는 β-(1 → 4) 및 β-(1 → 3) 글리코사이드 결합을 통해 연결된 N-아세틸글루코사민 및 글루쿠론산을 포함하는 히알루론산이다. 히알루론산의 중합체는 5 내지 20000 kDa 크기의 범위일 수 있다.
일부 실시형태에서, 중합체는 β-1,4 결합 D-글루코스 선형 반복 단위를 갖는 폴리사카라이드인 셀룰로스이다. 천연 섬유는 최대 10,000개의 글루코스 단위로 존재할 수 있으며, 분자량은 1000 Da 초과이다.
일부 실시형태에서, 중합체는 합성 중합체이다. 합성 중합체는 단독 중합체, 공중합체, 블록 공중합체(예를 들어, 디블록 공중합체, 트리블록 공중합체 등)일 수 있다. 적합한 중합체의 비제한적인 예로는 폴리아민, 폴리에테르, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리카바메이트, 폴리우레아, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리이미드, 폴리설폰, 폴리우레탄, 폴리아세틸렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌이민, 폴리이소시아네이트, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아릴레이트를 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다. 특정 중합체의 비 제한적인 예로는 폴리(카프로락톤)(PCL), 에틸렌 비닐 아세테이트 중합체(EVA), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(L-락트산-코-글리콜산)(PLLGA), 폴리(D,L-락타이드)(PDLA), 폴리(L-락타이드)(PLLA), 폴리(D,L-락타이드-코-카프로락톤), 폴리(D,L-락타이드-코-카프로락톤-코-글리콜라이드), 폴리(D,L-락타이드-코-PEO-코-D,L-락타이드), 폴리(D,L-락타이드-코-PPO-코-D,L-락타이드), 폴리알킬 시아노아크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리-L-라이신(PLL), 하이드록시프로필 메타크릴레이트(HPMA), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리-L-글루탐산, 폴리(하이드록시 산), 폴리 무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리(에스테르 아미드), 폴리아미드, 폴리(에스테르 에테르), 폴리카보네이트, 폴리알킬렌(예를 들어, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌), 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG)) 및 이들의 공중합체(예를 들어, 폴록사머), 폴리알킬렌 테레프탈레이트(예를 들어, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 등), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르(예를 들어, 폴리(비닐 아세테이트), 등), 폴리비닐 할라이드(예를 들어, 폴리(비닐 클로라이드)(PVC), 등), 폴리비닐피 롤리돈, 폴리실록산, 폴리스티렌(PS), 폴리우레탄, 유도체화된 셀룰로스(예를 들어, 알킬 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 에스테르, 니트로 셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 등), 아크릴산의 중합체("폴리아크릴산")(예를 들어, 폴리(메틸(메트)아크릴레이트)(PMMA), 폴리(에틸(메트)아크릴레이트), 폴리(부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(이소부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(헥실(메트)아크릴레이트), 폴리(이소데실(메트)아크릴레이트), 폴리(라우릴(메트)아크릴레이트), 폴리(페닐(메트)아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트), 폴리디옥사논 및 이의 공중합체(예를 들어, 폴리하이드록시알카노에이트, 폴리프로필렌 푸마레이트), 폴리옥시메틸렌, 폴리(오르토)에스테르, 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락티드-코-카프로락톤), 트리메틸렌 카보네이트, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리(1-비닐피롤리돈-코-비닐 아세테이트)(PVP-VA), 폴리(4-비닐피리딘), 폴리(4-비닐피리딘-코-부틸 메타크릴레이트), 폴리(4-비닐피리딘-코-스티렌), 폴리[4-비닐피리디늄 폴리(불화수소), 메틸아크릴레이트(p(MAA-코-MMA)) 공중합체, 폴리(1-비닐피롤리돈-코-2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트), 폴리(1-비닐피롤리돈-코-스티렌), 폴리(4-비닐피리디늄 p-톨루엔설포네이트), 하이드록시프로필 아세테이트 숙시네이트(HPMC), 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 숙시네이트(HPMCAS), 폴리(에틸렌-알트-프로필렌)(PEP), 2-메틸 아크릴아미도 글루코피라노스(MAG), 디메틸 아디프이미데이트(DMA), 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트, 및 이들의 임의의 혼합물 및 공중합체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 합성 중합체는 폴리알킬렌 글리콜이다. 일부 실시형태에서, 합성 중합체는 폴리알킬렌 글리콜 공중합체이다. 일부 실시형태에서, 합성 중합체는 적어도 하나의 폴리(프로필렌 옥사이드) 블록 및 적어도 하나의 폴리(에틸렌 옥사이드) 블록을 포함하는 블록 공중합체, 예를 들어 플록사머이다. 폴록사머는 2개의 폴리(에틸렌 옥사이드) 블록을 좌우측에 가지고 있는 중앙 폴리(프로필렌 옥사이드) 블록을 갖는 비이온성 트리블록 공중합체이다. 폴록사머는 또한 Pluronic® 및 Kolliphor®를 포함한 특정 상표명으로도 알려져 있다. 예시적인 폴록사머는 폴록사머 188(Pluronic® F-68) 및 폴록사머 407(Pluronic® F-127)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 화합물(즉, 코엘렌테라진 또는 그의 유사체 또는 유도체) 및 중합체는 약 0.001:1 내지 약 0.50:1, 또는 약 0.0025:1 내지 약 0.40:1의 중량비로 조성물 중에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 페이퍼 또는 섬유 매트릭스 또는 기타 다른 물질을 추가로 포함하며, 조성물은 페이퍼 또는 섬유 매트릭스 또는 기타 다른 물질 내에 또는 위에 배치된다. 일부 실시형태에서,이러한 물질은 현장 테스트와 같은 광범위한 환경에서 사용되는 코엘렌테라진(또는 이의 유사체 또는 유도체)을 허용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 페이퍼 또는 섬유 매트릭스는 100% 순면 린터와 같은 고품질 코튼 린터로 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 페이퍼 또는 섬유 매트릭스는 회분이 없을 수 있다. 일부 실시형태에서, 페이퍼 또는 섬유 매트릭스는 0.06 중량% 이하의 회분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 페이퍼 또는 섬유 매트릭스는 약 0.1 μm 내지 약 1 mm의 두께를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 페이퍼 또는 섬유 매트릭스는 약 0.02 μm 내지 약 12 μm 범위의 기공 크기를 가질 수 있다. 페이퍼 또는 섬유 매트릭스는 결합 친화성, 다공성, 작용성(예를 들어, 고 산성 또는 염기성 작용기를 가짐) 등을 포함한 다양한 특성을 가질 수 있다.
예시적인 페이퍼 또는 섬유 매트릭스로는 Whatman® 브랜드 페이퍼(예를 들어, W-903 페이퍼, FTA 페이퍼, FTA Elute 페이퍼, FTA DMPK 페이퍼, 등), Ahlstrom 페이퍼(예를 들어, A-226 페이퍼, 등), M-TFN 페이퍼, FTA 페이퍼, FP705 페이퍼, Bode DNA 수집 페이퍼, 니트로셀룰로스 페이퍼, 나일론 페이퍼, 셀룰로스 페이퍼 및 샘플 패드(예를 들어, EMD Millipore CFSP20300M), Dacron 페이퍼, 코튼 페이퍼, 폴리에스테르 페이퍼(예를 들어, Ahlstrom 폴리에스테르 섬유 등급 6613, Ahlstrom 처리된 폴리에스테르 섬유 등급 6613H), 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, NoviplexTM 플라즈마 프렙 카드, Ahlstrom CytoSep®, Cobas® 플라즈마 분리 카드, 다공성 및 중합체성 멤브레인, 고순도 면 섬유(예를 들어, Ahlstrom 등급 237), 면/레이온 혼방 고순도 면(예를 들어, Ahlstrom 등급 1218), 유리 마이크로섬유(예를 들어, Ahlstrom 934-AH, EMD Millipore GFDX103000), 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
페이퍼 또는 섬유 매트릭스 대신에 사용될 수 있는 다른 잠재적인 물질로는 유기 또는 무기 물질(예를 들어, 금속 또는 세라믹 물질), 균질 또는 불균질 고체, 액체, 또는 용해 가능한 타정 물질로부터 제조된 합성 및/또는 중합체성 멤브레인을 포함한다. 예시적인 추가의 물질은, 예를 들어, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 에스테르, 셀룰로스 에테르, 폴리설폰, 폴리에테르 설폰, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알코올, 전분, 등을 포함한다. 페이퍼 또는 섬유 매트릭스 대신에 사용될 수 있는 추가의 물질은 플라스틱 또는 유리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 물질은 플라스틱 또는 유리로 제조된 큐벳, 슬라이드, 플레이트, 또는 다른 적절한 표면일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 물질은 금속 표면일 수 있으며, 여기서 금속은 단일 금속 또는 금속 합금, 예를 들어 강철, 구리, 황동, 청동, 또는 은이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 (i) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유도체 또는 유사체, (ii) 적합한 중합체, 및 (iii) 페이퍼 또는 섬유 매트릭스 또는 유리, 플라스틱 또는 금속과 같은 다른 표면을 포함한다.
화합물 및 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스 또는 기타 다른 표면 이외에도, 조성물은 완충액, 계면활성제, 환원제, 염, 라디칼 소거제, 킬레이트제, 단백질, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 추가의 성분을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 인산염 완충액, 보레이트 완충액, 아세테이트 완충액 또는 시트레이트 완충액와 같은 완충액, 또는 비신(bicine), 트리신(tricine), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스), N-[트리스](하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판설폰산(TAPS), 3-[N-트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-2-하이드록시프로판설폰산(TAPSO), 2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]에탄설폰산(HEPES), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄설폰산(TES), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)(PIPES), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 등과 같은 다른 통상적인 완충액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 인산염 완충액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 트리신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산을 포함한다. 조성물은 또한 완충액의 임의의 조합을 포함할 수도 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 세제 또는 계면활성제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세제 또는 계면활성제는 약 0.01 mol% 내지 5 mol%(예를 들어, 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 또는 이들 사이의 임의의 범위(예를 들어, 0.1 내지 0.5%))로 존재한다. 예시적인 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 및 쯔비터이온성 계면활성제를 포함한다. 비이온성 세제의 예로는 Brij 35, TritonTM X 시리즈(TritonTM X-100, TritonTM X-100R, TritonTM X-114 등과 같은 옥틸페놀 에톡실레이트)와 같은 TritonTM 계면활성제, 옥틸 글루코시드, 폴리옥시에틸렌(9)도데실 에테르, 디지토닌, 옥틸페닐 폴리에틸렌 글리콜(IGEPAL CA630), n-옥틸-베타-D-글루코피라노시드(베타OG), n-도데실-베타-D- 말토시드, Tween® 20(폴리소르베이트 20 또는 폴리에틸렌 글리콜(20) 소르비탄 모노라우레이트), Tween® 40(폴리소르베이트 40 또는 폴리에틸렌 글리콜(20) 소르비탄 모노팔미테이트), Tween® 80(폴리소르베이트 80 또는 폴리에틸렌 글리콜(20) 소르비탄 모노올레이트), 폴리도카놀, n-도데실 베타-D-말토시드(DDM), Nonidet P40-치환체, NP-40 노닐페닐 폴리에틸렌 글리콜, C12E8(옥타에틸렌 글리콜 n-도데실 모노에테르), 헥사에틸렌글리콜 모노-n-테트라데실 에테르(C14E06), 옥틸-베타-티오글루코피라노시드(옥틸 티오글루코시드, OTG), Pluronic® F-68(폴록사머 188), Pluronic® F-127(폴록사머 407), 사포닌, Emulgen, 폴리에틸렌 글리콜 트리메틸노닐 에테르, 및 폴리옥시에틸렌 10 라우릴 에테르(C12E10)를 포함한다. 이온성 세제(음이온성 또는 양이온성)의 예로는 데옥시콜레이트, 나트륨 콜레이트, 나트륨 도데실 설페이트(SDS), N-라우로일사르코신, 및 세틸트리메틸암모늄브로마이드(CTAB)를 포함한다. 쯔비터이온성 시약의 예로는 Chaps, 쯔비터이온 3-14, 및 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다. 조성물은 또한 계면활성제의 임의의 조합을 포함할 수도 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 환원제, 예를 들어 디티오트레이톨(DTT), 2-메르캅토에탄올(BME), 시스테아민, (2S)-2-아미노-1,4-디메르캅토부탄(DTBA), 티오우레아, 6-아자-2-티오티민(ATT), 등을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 환원제는 티오우레아이다. 일부 실시형태에서, 환원제는 ATT이다. 조성물은 또한 환원제의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 인산나트륨 등과 같은 염을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 염은 염화나트륨이다. 일부 실시형태에서, 염은 인산나트륨이다. 조성물은 또한 염의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 아스코르브산, 나트륨 아스코르베이트 등과 같은 라디칼 소거제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산, 트랜스-1,2-디아미노사이클로헥산-테트라아세트산 등과 같은 금속 킬레이터를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 나트륨 아스코르베이트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 시트르산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 트랜스-1,2-디아미노사이클로헥산-테트라아세트산을 포함한다. 조성물은 라디칼 소거제 및/또는 킬레이터의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 Nano-Glo® Luciferase Assay Buffer(Promega Catalog No. N112), Nano-Glo® Live Cell Substrate(LCS) Dilution Buffer(Promega Catalog No. N206), 등과 같은 완전한 완충액 조성물을 포함할 수 있다. 완전한 완충액 조성물은 완충액 자체 및 하나 이상의 염, 금속 킬레이터, 환원제, 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 본원에서 개시되는 성분들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 다운스트림 분석시에 첨가될 수 있는 발광성 효소의 표면 흡착을 방지하기 위해 운반 단백질(carrier protein)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질은 소 혈청 알부민(BSA)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질은 돼지 기원의 고도로 정제된 진피 콜라겐(예를 들어, Prionex)의 폴리펩티드 분획일 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질은 젤라틴일 수 있다. 조성물은 또한 단백질의 임의의 조합을 포함할 수도 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 용매를 포함할 수 있다. 일부 조성물은 임의의 용매가 제거될 수 있도록 완전히 건조되는 반면, 다른 조성물은 용매 또는 일정량의 잔류 용매를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 메탄올, 에탄올, 이소-프로판올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등과 같은 유기 용매 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 에탄올과 프로필렌 글리콜의 조합을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 조성물은 전술한 성분들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 조성물은 단백질, 완충액, 및 환원제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 조성물은 단백질, 완충액, 및 금속 킬레이터를 포함할 수 있다.
조성물은 동결 건조된 분말 또는 케이크의 형태일 수 있다. 이러한 조성물은 하기에서 추가로 설명되는 바와 같이 조성물의 성분들의 혼합물을 동결 건조함으로써 제조될 수 있다. 분말 제품은 병과 같은 용기, 바이알, 스냅 튜브, 마이크로타이터 플레이트 내에, 페이퍼 또는 섬유 매트릭스 또는 기타 고체 물질 지지체 상에, 랩온칩(lab-on-chip) 등 내에 제공될 수 있다. 분말 제품은 적절한 양의 용액에 용해되어 관심있는 분석에 직접 사용되는 미리 결정된 양의 조성물을 각각 함유하는 튜브를 가진 복수의 스냅 튜브에 포함될 수 있다.
조성물은 또한 "드롭" 캐스트("drop" cast) 또는 필름과 같은 경질이지만 가단성이 있는 물질의 형태일 수도 있다. 이러한 조성물은 조성물의 성분들을 함유하는 용액을 표면에 적용한 다음, 조성물을 건조, 예를 들어 공기 건조하거나, 주위 온도에서 건조하거나, 승온(예를 들어, 약 30℃ 내지 약 70℃, 또는 약 30℃ 내지 약 40℃, 예를 들어 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 또는 약 70℃의 온도)에서 건조하거나, 불활성 대기 하에서 건조하거나 또는 진공 하에 건조하여 제조할 수 있다. 드롭 캐스트 또는 필름은 병과 같은 용기, 바이알, 스냅 튜브, 마이크로타이터 플레이트, 마이크로타이터 플레이트 내에, 페이퍼 또는 섬유 매트릭스 또는 기타 고체 물질 지지체 상에, 랩온칩 등 내에 제공될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 용액(예를 들어, 수용액)의 형태이다. 조성물이 용액일 때, 조성물은 약 5.5 내지 약 8.0, 예를 들어, 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 77.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0의 pH를 갖는다.
조성물은 또한 완충액 또는 생물학적 샘플과 같은 샘플에 적하될 수 있는 용해성 정제 또는 캡슐을 포함하는 정제 또는 캡슐과 같은 다른 형태로 제공될 수도 있다. 조성물은 또한 96-웰 플레이트의 웰과 같은 표면 상에 미리 형성된 필름으로 포함될 수 있어, 조성물이 적절한 양의 용액 중에 곧바로 용해되어 관심있는 분석에 직접 사용될 수 있다.
조성물이 페이퍼 또는 섬유 매트릭스 상에 제공되는 경우, 페이퍼 또는 섬유 매트릭스는 스폿이 재구성되고 관심있는 분석에 직접 사용될 수 있도록 펀칭할 수있는 스폿을 가진 카드의 형태일 수 있다. 대안적으로, 페이퍼 또는 섬유 매트릭스는 관심있는 분석에 사용하기 위해 재구성될 수 있는 미리 펀칭된 스폿(예를 들어, 약 1 내지 5 mm의 직경)의 형태로 제공될 수 있다. 조성물을 갖는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스는, 예를 들어 공기 건조하거나, 주위 온도에서 건조하거나, 승온(예를 들어, 약 30℃ 내지 약 70℃, 또는 약 30℃ 내지 약 40℃, 예를 들어 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 또는 약 70℃의 온도)에서 건조하거나, 불활성 대기 하에서 건조하거나 또는 진공 하에 건조함으로써 건조시킬 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 루시페라아제 기질, 예를 들어 코엘렌테라진 및 이의 유사체 및 유도체를 사용하는 임의의 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조성물은 코엘렌테라진 또는 이의 유사체 또는 유도체를 사용하여 샘플에서 하나 이상의 분자, 예를 들어, 효소, 효소 반응을 위한 보조 인자, 효소 기질, 효소 억제제, 효소 활성화제 또는 *OH 라디칼, 또는 하나 이상의 조건, 예를 들어, 산화 환원 조건(redox condition)을 검출하는 생물 발광 방법에서 사용될 수 있다. 샘플은 동물(예를 들어, 척추 동물), 식물, 진균, 생리학적 유체(예를 들어, 혈액, 혈장, 뇨, 점액 분비물), 세포, 세포 용해물, 세포 상청액, 또는 세포의 정제된 분획(예를 들어, 준세포 분획)을 포함할 수 있다. 이러한 분자의 존재, 양, 스펙트럼 분포, 방출 동역학 또는 특정 활성을 검출하거나 정량화할 수 있다. 분자는 다상 용액(예를 들어, 에멀젼 또는 현탁액)을 포함하는 용액 중에서 또는 고체 지지체(예를 들어, 입자, 모세관 또는 분석 용기) 상에서 검출하거나 정량화할 수 있다.
특정 실시형태에서, 조성물은 원하는 분자를 정량화하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 특정의 생화학적 활성, 예를 들어 아포프토시스(apoptosis) 또는 약물 대사의 프로브로서 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 조성물은 살아있는 세포 또는 동물 내에서, 예를 들어 생체 내에서 발광을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 루시페라아제는 세포(리포터로서 또는 다른 방법으로) 및 조성물로 처리된 세포에서 발현될 수 있다. 코엘렌테라진, 또는 이의 유사체 또는 유도체는 배양시에 세포에 침투하여 루시페라아제와 반응하여 발광을 생성할 것이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 보다 강건한 생세포 루시페라아제 기반 리포터 분석에 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 루시페라아제 및 본 개시내용의 조성물을 함유하는 샘플(세포, 조직, 동물 등을 포함함)은 다양한 현미경 및 이미징 기술, 예를 들어 생체 내 이미징을 사용하여 분석할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 분비성 루시페라아제는 생세포 리포터 시스템의 일부로서 세포 내에서 발현된다.
또한, 화합물을 유효량의 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉시켜 조성물을 형성하는 단계를 포함하는, 코엘렌테라진 또는 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물을 안정화시키는 방법이 본원에서 제공된다. 화합물은 열적 분해, 화학적 분해, 광-유도 분해, 또는 이들의 임의의 조합에 대해 안정화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원의 조성물은 약 -80℃ 내지 약 80℃, 약 -75℃ 내지 약 80℃, 약 -70℃ 내지 약 80℃, 약 -65℃ 내지 약 80℃, 약 -60℃ 내지 약 80℃, 약 -55℃ 내지 약 80℃, 약 -50℃ 내지 약 80℃, 약 -45℃ 내지 약 80℃, 약 -40℃ 내지 약 80℃, 약 -35℃ 내지 약 80℃, 약 -30℃ 내지 약 80℃, 약 -25℃ 내지 약 80℃, 약 -20℃ 내지 약 80℃, 약 -15℃ 내지 약 80℃, 약 -10℃ 내지 약 80℃, 약 -5℃ 내지 약 80℃, 약 0℃ 내지 약 80℃, 약 -80℃ 내지 약 75℃, 약 -80℃ 내지 약 70℃, 약 -80℃ 내지 약 65℃, 약 -80℃ 내지 약 60℃, 약 -80℃ 내지 약 55℃, 약 -80℃ 내지 약 50℃, 약 -80℃ 내지 약 45℃, 약 -80℃ 내지 약 40℃, 약 -80℃ 내지 약 35℃, 약 -80℃ 내지 약 30℃, 약 -80℃ 내지 약 25℃, 약 -20℃ 내지 약 60℃, 약 -20℃ 내지 약 55℃, 약 -20 내지 약 50℃, 약 -20℃ 내지 약 45℃, 약 -20℃ 내지 약 40℃, 약 -20℃ 내지 약 35℃, 약 -20℃ 내지 약 30℃, 또는 약 -20℃ 내지 약 25℃의 온도에서 (예를 들어, 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉되지 않은 코엘렌테라진 화합물 또는 이의 유사체 또는 유도체와 비교하여) 분해에 대해 화합물(즉, 코엘렌테라진 또는 이의 유사체 또는 유도체)을 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 본원의 조성물은 약 -80℃, -79℃, -78℃, -77℃, -76℃, -75℃, -74℃, -73℃, -72℃, -71℃, -70℃, -69℃, -68℃, -67℃, -66℃, -65℃, -64℃, -63℃, -62℃, -61℃, -60℃, -59℃, -58℃, -57℃, -56℃, -55℃, -54℃, -53℃, -52℃, -51℃, -50℃, -49℃, -48℃, -47℃, -46℃, -45℃, -44℃, -43℃, -42℃, -41℃, -40℃, -39℃, -38℃, -37℃, -36℃, -35℃, -34℃, -33℃, -32℃, -31℃, -30℃, -29℃, -28℃, -27℃, -26℃, -25℃, -24℃, -23℃, -22℃, -21℃, -20℃, -19℃, -18℃, -17℃, -16℃, -15℃, -14℃, -13℃, -12℃, -11℃, -10℃, -9℃, -8℃, -7℃, -6℃, -5℃, -4℃, -3℃, -2℃, -1℃, 0℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 75℃, 또는 80℃에서 (예를 들어, 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉되지 않은 코엘렌테라진 화합물 또는 이의 유사체 또는 유도체와 비교하여) 분해에 대해 화합물(즉, 코엘렌테라진 또는 이의 유사체 또는 유도체)을 안정화시킨다. 조성물은 약 -80℃, 약 -20℃, 약 4℃, 약 20℃, 약 25℃, 또는 약 37℃에서 분해에 대해 화합물을 안정화시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원의 조성물은 광의 존재 하에 (예를 들어, 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉되지 않은 코엘렌테라진 화합물 또는 이의 유사체 또는 유도체와 비교하여) 분해에 대해 화합물(즉, 코엘렌테라진 또는 이의 유사체 또는 유도체)을 안정화시킨다. 이러한 조성물은 중합체 또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스를 함유하지 않는 조성물에 비하여 광의 존재 하에 화합물의 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 조성물은, 중합체 또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스를 함유하지 않는 조성물에 비하여, 광의 존재 하에 화합물의 반감기를 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3.0배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4.0배, 4.1배, 4.2배, 4.3배, 4.4배, 4.5배, 4.6배, 4.7배, 4.8배, 4.9배, or 5.0배 이상 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원의 조성물은, 중합체 또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스를 함유하지 않는 조성물에 비하여, 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 35일, 40일, 45일, 50일, 55일, 60일, 65일, 70일, 75일, 80일, 85일, 90일, 100일, 110일, 120일, 130일, 140일, 150일, 160일, 170일, 180일, 190일, 200일, 210일, 220일, 230일, 240일, 250일, 260일, 270일, 280일, 290일, 300일, 310일, 320일, 330일, 340일, 350일, 360일, 1년, 2년, 3년, 4년, 또는 5년 동안 (예를 들어, 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉되지 않은 코엘렌테라진 화합물 또는 이의 유사체 또는 유도체와 비교하여) 분해에 대해 화합물(즉, 코엘렌테라진 또는 이의 유사체 또는 유도체)을 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 이러한 조성물은, 중합체 또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스를 함유하지 않는 조성물에 비하여, (예를 들어, 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉되지 않은 코엘렌테라진 화합물 또는 이의 유사체 또는 유도체와 비교하여) 분해에 대해 화합물(즉, 코엘렌테라진 또는 이의 유사체 또는 유도체)의 반감기를 적어도 약 1.25배, 1.5배, 1.75배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 또는 25배 증가시킨다.
코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물의 용해도를 개선하는 방법으로서, 상기 화합물을 유효량의 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 코엘렌테라진 화합물 또는 이의 유사체 또는 유도체의 용해도는 중합체와 접촉되지 않은 화합물에 비하여 개선되는 방법이 본원에서 제공된다. 화합물의 용해도는 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉되지 않은 상응하는 화합물에 비하여 수용액 중에서 개선될 수 있다. 화합물의 용해도는 동결 건조된 분말, 드롭 캐스트 필름 또는 "액적"의 재구성 후 중합체가 존재하는 경우, 또는 화합물이 그위에 또는 그안에 배치된 페이퍼 또는 섬유 매트릭스 또는 기타 고체 지지체 물질을 재수화하는 경우에 개선될 수 있다.
조성물은, 예를 들어, 순수한 물 또는 완충액, 염, 단백질, 환원제, 라디칼 소거제, 계면활성제 등, 또는 이러한 성분들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 것과 같은 수용액 중에서 화합물(즉, 코엘렌테라진 또는 이의 유사체 또는 유도체)의 용해도를 증가시킬 수 있다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 인산염 완충된 염수(PBS)와 같은 수성 완충액 중 약 6.5 내지 약 7.5의 pH(예를 들어, 약 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5, 또는 이들 사이의 임의의 범위의 pH)에서 또는 Nano-Glo® Luciferase Assay Buffer와 같은 다른 적합한 완충액 중에서 화합물의 용해도를 증가시킬 수 있다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 대상물로부터의 생물학적 샘플, 배양 배지(예를 들어, 조직 배양 배지) 등과 같은 생물학적 유체 또는 환경 유체 중에서 화합물의 용해도를 증가시킬 수 있다.
예를 들어, 이러한 조성물은, 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스를 함유하지 않는 조성물에 비하여, 광의 존재 하에 화합물의 용해도를 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3.0배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4.0배, 4.1배, 4.2배, 4.3배, 4.4배, 4.5배, 4.6배, 4.7배, 4.8배, 4.9배, 또는 5.0배 이상 증가시킬 수 있다.
또한, 코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물의 재구성 속도(reconstitution rate)를 개선하는 방법으로서, 상기 화합물을 유효량의 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 화합물에 대한 재구성 속도는 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉되지 않은 화합물에 비하여 개선되는 방법이 본원에서 제공된다.
이러한 조성물은, 예를 들어, 순수한 물 또는 완충액, 염, 단백질, 환원제, 계면활성제 등, 또는 이러한 성분들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 것과 같은 수용액 중에서 화합물의 재구성 속도를 증가시킬 수 있다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 인산염 완충된 염수(PBS)와 같은 수성 완충액 중 약 6.5 내지 약 7.5의 pH(예를 들어, 약 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5, 또는 이들 사이의 임의의 범위의 pH)에서 또는 Nano-Glo® Luciferase Assay Buffer와 같은 다른 적합한 완충액 중에서 화합물의 재구성 속도를 증가시킬 수 있다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 대상물로부터의 생물학적 샘플, 배양 배지(예를 들어, 조직 배양 배지) 등과 같은 생물학적 유체 또는 환경 유체 중에서 화합물의 용해도를 증가시킬 수 있다.
예를 들어, 이러한 조성물은, 중합체를 함유하지 않는 조성물에 비하여, 광의 존재 하에 화합물(예를 들어, 코엘렌테라진 화합물 또는 이의 유사체 또는 유도체)의 재구성 속도를 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3.0배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4.0배, 4.1배, 4.2배, 4.3배, 4.4배, 4.5배, 4.6배, 4.7배, 4.8배, 4.9배, 또는 5.0배 이상 증가시킬 수 있다.
조성물은 본원에서 개시되는 특성들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 본원에서 기술되는 증가된 용해도, 본원에서 기술되는 개선된 재구성 속도, 본원에서 기술되는 증가된 안정성, 및/또는 본원에서 개시되는 증가된 반감기를 가질 수 있다. 조성물은 개시된 특성들 중 하나 또는 개시된 특성들의 임의의 조합을 가질 수 있으며, 다른 개선된 특성을 추가로 가질 수 있다.
본원에서 기술되는 방법의 실시형태들에서, 접촉 단계는: 화합물(즉, 코엘렌테라진 또는 이의 유사체 또는 유도체)을 제 1 용매 중에 용해시켜 제 1 용액을 형성하는 단계; 상기 제 1 용액을 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; 및 상기 혼합물을 건조하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 접촉 단계는: 화합물을 제 1 용매 중에 용해시켜 제 1 용액을 형성하는 단계; 중합체를 제 2 용매 중에 용해시켜 2 용액을 형성하는 단계; 상기 제 1 용액 및 상기 제 2 용액을 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; 및 상기 혼합물을 건조하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접촉 단계는: 화합물을 용매 중에 용해시켜 제 1 용액을 형성하는 단계; 상기 제 1 용액을 페이퍼 또는 섬유 매트릭스에 적용하는 단계; 및 상기 페이퍼 또는 섬유 매트릭스를 건조하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접촉 단계는: 화합물을 제 1 용매 중에 용해시켜 제 1 용액을 형성하는 단계; 중합체를 제 2 용매 중에 용해시켜 2 용액을 형성하는 단계; 상기 제 1 용액 및 상기 제 2 용액을 조합하여 제 3 용액을 형성하는 단계; 상기 제 3 용액을 페이퍼 또는 섬유 매트릭스에 적용하는 단계; 및 상기 페이퍼 또는 섬유 매트릭스를 건조하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 건조 단계는 동결 건조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 건조 단계는 공기 건조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 건조 단계는 불활성 대기 하에(예를 들어, 질소 또는 아르곤 하에) 주위 온도에서의 건조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 건조 단계는 승온(예를 들어, 30℃)에서의 건조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 건조 단계는 진공 건조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법에서 사용되는 용액 중 하나 또는 전부는 탈산소화될 수 있다. 탈산소화는 진공 하에서 용액을 탈기하거나, 용액을 통해 불활성 가스(예를 들어, 질소 또는 아르곤)를 버블링함으로써 달성될 수 있다.
조성물을 발광을 생성하기 위한 루시페라아제에 대한 기질로서 사용하고 재구성 후 조성물로부터 발광을 분석함으로써 조성물을 테스트할 수 있다. "발광"은 적절한 조건하에서의, 예를 들어 코엘렌테라진 유사체와 같은 적절한 기질의 존재하에서의 루시페라아제의 광 출력을 지칭한다. 광 출력은 코엘렌테라진 기질의 첨가시에 개시될 수 있는 발광 반응의 시작 시점에서의 광 출력(때로는 "T = 0" 발광 또는 "플래시"라 지칭됨)의 즉각적인 또는 거의 즉각적인 측정치로서 측정할 수 있다.
발광 반응은 다양한 실시형태에서 용액 중에서 수행된다. 용액은, 예를 들어, 원핵 또는 진핵 발현 시스템 내의 세포로부터의 용해물을 함유할 수 있다. 용액은 발광성 효소 성분으로 태그된 정제 단백질, 펩티드 또는 소분자를 함유할 수 있다. 다른 실시형태에서, 발현은 무 세포 시스템에서 발생하거나 또는 루시페라아제 단백질이 세포 외 배지로 분비되므로, 후자의 경우에는 용해물을 생성할 필요가 없다. 일부 실시형태에서, 반응은 적절한 물질, 예를 들어, 본 개시내용의 조성물, 완충액 등을 발광 단백질을 함유하는 반응 챔버(예를 들어, 96-웰 플레이트와 같은 다중-웰 플레이트의 웰, 시험관 또는 바이알, 큐벳 등)에 첨가함으로써 시작된다. 반응 챔버는, 예를 들어, 발광계, 광전자 배증관(photomultiplier) 또는 카메라(예를 들어, 스마트폰 카메라, CCD 카메라, 또는 이미지를 기록할 수 있는 기타 휴대용 장치)를 사용하여 광 출력을 측정할 수 있는 판독 장치 내에 위치할 수 있다. 광 출력 또는 발광은 또한 시간에 따라, 예를 들어 동일한 반응 챔버에서 초, 분, 시간 등의 기간 동안 측정할 수 있다. 광 출력 또는 발광은 시간에 따른 평균, 신호 감쇠의 반감기, 일정 기간에 걸친 신호의 합, 또는 피크 출력으로 기록될 수 있다. 발광은 상대 발광 단위(RLU: Relative Light Unit)로 측정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 이를 오플로포러스 루시페라아제에 대한 기질로 사용하여 테스트할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 루시페라아제 및/또는 조성물은 숙주에 도입되고, 전체 유기체 또는 세포, 조직, 외식편 또는 이의 추출물을 포함할 수 있는 숙주 또는 이의 일부에서 발광 측정이 이루어진다.
다른 실시형태에서, 발광 반응은 고체 지지체 상에서 수행된다. 고체 지지체는, 예를 들어, 비드, 수지, 자성 입자, 멤브레인, 또는 바이알, 마이크로타이터 플레이트, 카세트, 큐벳, 면봉 등의 표면과 같은 표면일 수 있다. 이어서, 이러한 반응은 특정 고체 지지체 포맷으로부터 광 출력을 측정할 수 있는 판독 장치 내에 위치할 수 있다.
다른 실시형태에서, 발광 반응은 전체 동물 이미징을 위해 생체 내에서 수행된다. 동물에 기질을 주입하기 위한 비히클은 비독성이며 포유류 생물학과 매우 호환 가능해야 하므로 사용 가능한 옵션은 상당히 제한적이다. 본원에서 기술되는 풀루란 및 기타 많은 중합체는 비독성이고, 심지어는 식품 첨가물로 승인되어 있으므로 주사용 용액의 성분으로 특히 적합하다. 또한, 퓨리마진과 같은 코엘렌테라진 유사체의 PBS와 같은 간단한 완충액으로의 개선된 용해도와 재구성은 정맥 주사, 복강내 주사, 두개내 투여 등과 같은 동물 투여에 이상적이다. 조성물 성분은 주입 직전에 조합될 수 있으며, 우수한 재구성으로 샘플이 신속하게 균질해질 수 있으므로, 이는 용해되지 않은 미세 결정의 존재가 치명적일 수 있는 동물 작업에 중요하다. 기질 제형이 동물에 도입되면(예를 들어, 정맥내 또는 복강내 주사), 진정 된 동물을 이미징 챔버에 배치하고 생체 발광의 생체내 생성에 대해 분석할 것이다.
특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 조성물은 키트의 일부로 제공된다. 조성물은 단일 용기 내에 함유될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 사용자가 본원에서 개시되는 것과 같은 분석을 수행할 수 있도록 하는데 적합한 시약 및 설명서와 함께 하나 이상의 루시페라아제(폴리펩타이드, 폴리뉴클레오티드 또는 둘 모두의 형태)를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 본원에서 개시되는 것과 같은 하나 이상의 완충액을 포함할 수도 있다. 키트는 조성물 및/또는 조성물을 함유하는 단일 용기를 저장하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 키트에 포함된 설명서는 포장 재료에 부착되거나 포장 삽입물로 포함될 수 있다. 설명서는 일반적으로 서면 또는 인쇄물이지만 이에 국한되지 않는다. 이러한 설명서룰 저장하고 이를 최종 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 개시에 의해 고려된다. 이러한 매체는 전자 저장 매체(예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체(예를 들어, CD ROM) 등을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "설명서"는 설명서을 제공하는 인터넷 사이트의 주소를 포함할 수 있다.
실험
본원에서 실시형태의 개발 과정에서 수행된 실험은 본원에서 기재되는 조성물 및 방법의 유용성을 입증한다. 달리 명시되지 않는 한, 풀루란은 Sigma-Aldrich(CAS No. 9057-02-7)로부터 입수하였다.
실시예에서 사용된 약어들은 다음 정의를 포함한다: ATT는 6-아자-2-티오티민이고; EtOH는 에탄올이고; Fz는 퓨리마진이고; HPLC는 고성능 액체 크로마토그래피이고; NGB는 Nano-Glo® Luciferase Assay Buffer(Promega catalog # N112)이고; PBS는 인산염-완충 염수이며; TFA는 트리플루오로아세트산이다.
실시예 1
퓨리마진-풀루란 조성물
샘플을 다음과 같이 제조하였다. 각각의 하기 조건에 대해, 모든 기질 및 첨가제는 물 중 풀루란의 다양한 백분율(w/v)의 용액에서 나열된 농도로 조합하였다. 각각의 경우에, 중합체를 함유하는 최종 용액 중의 에탄올의 총량(v/v)이 10% v/v를 초과하지 않도록 에탄올 중 저장 용액으로부터 기질을 첨가하였다.
조건 1: 물 중 0, 2.5, 5 또는 10%(w/v) 풀루란을 사용하여 용액을 제조하였다. 에탄올 중 30 mM 퓨리마진의 스톡 용액을 제조하였다. 퓨리마진의 최종 농도가 2 mM인 풀루란을 함유하는 46μL의 용액에 4μL의 퓨리마진 스톡을 첨가하였다. 에탄올의 총 농도는 모든 경우에 최종 용액에서 <10% v/v였다. 샘플을 냉동시킨 다음 밤새 동결 건조하여 분말 제품을 형성하였다.
조건 2: <10% v/v 에탄올/물 중의 15%(w/v) 풀루란, 200 mM 트리신 및 2 mM 퓨리마진의 용액을 상술된 바와 같이 제조하였다. 일련의 60 μL 분취량을 파라필름(parafilm) 상에 피펫팅하고 어두운 곳에서 적어도 3시간 동안 25℃에서 건조하여 경질의 가단성 "드롭(drops)"을 형성하였다.
조건 3: <10% v/v 에탄올/물 중의 15%(w/v) 풀루란 및 2 mM 퓨리마진의 용액을 상술된 바와 같이 제조하였다. 일련의 60 μL 분취량을 파라필름(parafilm) 상에 피펫팅하고 어두운 곳에서 적어도 3시간 동안 25℃에서 건조하였다.
제형화된 퓨리마진을 필요에 따라 볼텍싱(vortexing)하면서 NGB 또는 PBS, pH 7.0 내에 용해시켜 샘플을 테스트하였다. 각각의 경우에, 샘플을 5 mL의 완충액 중에서 10 μM 퓨리마진의 최종 작업 농도로 희석하였다.
실험 결과는 다음과 같다. 2.5%(w/v) 풀루란을 갖는 조건 1에 따른 샘플은 1분 이내에 NGB 및 PBS, pH 7.0의 용액 내로 용이하게 유입되었다. 5%(w/v) 및 10%(w/v)를 갖는 조건 1에 따른 샘플은 수분 이내에 PBS, pH 7.0 중에 완전히 용해되었다. 조건 2에 따른 샘플은 추가의 볼텍싱이 필요했으며, PBS, pH 7.0 중에 완전히 용해되는데 약 10 내지 15분이 필요하였다. 풀루란이 없는 조건 1에 따른 샘플은 PBS(실험적으로 결정), pH 7.0 중에 완전히 용해되는데 약 10분이 필요하였다.
샘플을 4℃에서 5주 동안 저장한 후, 샘플을 20 μM 스톡에 대해 1x NGB로 6 mL로 희석하거나 또는 20μM 스톡에 대해 1x PBS, pH 7.0으로 6 mL로 희석하였다. 정제된 NanoLuc®(Nluc) 루시페라아제 효소를 최종 1x 농도로 첨가하였다(여기서, 2x 스톡 용액은 NanoLuc® 효소, Promega # E499의 1000x 스톡에서 시작하여 PBS 또는 NGB에서 제조하였다). 대조군 샘플은 10 μM 최종 Nano-Glo® 기질을 갖는 분석 완충액 중의 Nluc를 포함하였다. 전체 발광을 수집하는 발광계(구체적으로는 GloMax® Discover Multimode Microplate 판독기-Promega Cat.# GM3000) 상에서 동역학적 판독을 사용하여 100 μL의 총 분석 부피를 갖는 고체 백색 비결합 표면(NBS) 플레이트 상에서 분석을 수행하였다.
PBS에서 재구성된 샘플에 대한 동력학적 트레이스는 도 1A에 나타나 있고, NGB에서 재구성된 샘플에 대한 동력학적 트레이스는 도 1B에 나타나 있다. 도 1C는 동결 건조된 케이크 및 필름 액적 제형의 이미지를 나타낸다. 지정된 시점에서의 도 1A의 데이터는 도 2A-C에서 막대 그래프로 나타나 있고, 지정된 시점에서의 도 1B의 데이터는 도 3A-C에서 막대 그래프로 나타나 있다.
도 1 내지 3에 예시된 결과는 유기 용매 또는 특수 완충액 조건이 필요없는 중성 완충액 중의 퓨리마진 조성물의 증가된 용해도를 입증한다. 퓨리마진 조성물로부터의 발광은 시판되는 퓨리마진 제형에 비해 강하다.
실시예 2
재구성된 퓨리마진 조성물의 흡광도
벌크 고체 퓨리마진을 에탄올 중에 10 mM(용액 1)의 최종 농도로 희석하였다. 건조 풀루란을 순수한 물에 0%, 2.5%, 5%, 10%, 15% w/v(각각 2a, 2b, 2c, 2d 및 2e 용액)의 최종 농도로 용해하였다. 45 μL의 용액 2a-e를 별도의 1.5 mL 스냅-튜브 바이알에 피펫팅하였다. 이어서, 5 μL의 용액 1을 각각의 바이알에 첨가하고 피펫팅한 다음 격렬하게 혼합하여 각각 50 μL의 용액 중의 1 mM(19.08 μg) 퓨리마진의 최종 농도를 함유하는 용액 3a-e를 형성하였다. 혼합 후, 용액 3a-e를 함유하는 바이알을 드라이아이스에 넣어 1시간 동안 동결하였다. 이어서, 이러한 동결된 스톡을 밤새 동결 건조하여 퓨리마진을 함유하는 건조 풀루란 매트릭스를 형성하였다.
풀루란 매트릭스(0%-15% w/v) 내의 퓨리마진(19.08 μg)의 분말 제형을 0.5 mL의 PBS 완충액, pH 6.8에 희석하고, 실온에서 30분 동안 평형화한 다음, 흡광도를 254 nm에서 기록하였다. PBS 완충액에서 재구성한 후 풀루란의 양이 증가하는 제형화된 건조 퓨리마진(50 nmol)의 흡광도 스펙트럼이 도 4A에 나타나 있다. 풀루란과 함께 제형화된 퓨리마진은 수용액에서 퓨리마진 흡광도를 증가시켰다. 메탄올 중 퓨리마진의 흡광 계수(21000 M-1cm-1)를 254 nm에서 측정된 흡광도와 함께 사용하여 Beer의 법칙에 의해 퓨리마진의 농도를 결정하였다. 벌크 퓨리마진은 0.0082 mM의 계산된 농도에 해당하는 0.0571의 흡광도를 가졌다. 2.5%-5% 풀루란 w/v를 갖는 퓨리마진 제형은 0.2204 및 0.2467의 흡광도를 나타내어 각각 0.032 mM 및 0.035 mM의 계산된 농도를 제공하였다. 10-15% 풀루란 w/v로 제형화된 퓨리마진은 0.3964 및 0.3836의 흡광도를 나타내어 PBS에서 각각 0.055 mM 및 0.052 mM의 계산된 농도를 제공하였다. 도 4A에 표시된 흡광도 데이터의 개요는 풀루란을 함유하지 않는 샘플에 비해 퓨리마진이 풀루란과 함께 제형화될 때 용액 중에서 퓨리마진(Fz) 농도의 증가를 보여주는 도 4C에서 확인할 수 있다.
별도로, 상술된 샘플과 유사하게 제조된 풀루란 매트릭스(0%-15% w/v) 내의 퓨리마진(95.4 μg)의 건조 제형을 0.5 mL의 PBS 완충액, pH 6.8에 희석하고, 실온에서 30분 동안 평형화한 다음, 흡광도를 254 nm에서 기록하였다. PBS 완충액에서 재구성한 후 풀루란의 양이 증가하는 제형화된 퓨리마진(95 μg)의 흡광도가 도 4B에 나타나 있다. 풀루란 매트릭스의 농도가 증가하는 제형화된 고체 퓨리마진은 풀루란없이 퓨리마진만을 함유하는 조건에 비해 흡광도가 증가하고, 따라서 PBS 완충액에서 퓨리마진 농도가 증가하였다.
실시예 3
저장된 샘플의 재구성
고체 퓨리마진을 에탄올에 용해시키고, 용해된 용액을 <10% v/v 에탄올을 함유하는 50 μL의 용액 중의 1 mM 퓨리마진의 총 농도로 풀루란의 수용액 (0 또는 15% w/v)에 첨가하였다. 샘플은 동결 건조하거나 주위 온도에서 건조하였다. 도 5는 이들 조성물이 PBS, pH 7.0으로 재구성되는 능력을 나타내는 이미지를 나타낸다. 15% w/v 풀루란을 갖는 주위 온도에서 건조된 "액적" 제형을 간단한 피펫팅 후 용액에 도입하였다. 15% w/v 풀루란을 갖는 동결 건조된 샘플은 PBS를 첨가한 직후에 용해되었다. 풀루란이 없는 샘플은 15분의 볼텍싱 후에도 PBS에 완전히 용해되지 않아 PBS에서 낮은 용해도를 나타내었다.
실시예 4
풀루란 샘플의 흡광도
PBS, pH 6.8 중의 순수한 2.5% w/v 풀루란 및 순수한 10% w/v 풀루란의 샘플을 흡광도에 대해 테스트하였다. 210-600 nm 범위의 흡광도 스펙트럼이 도 6A(2.5%) 및 도 6B(10%)에 예시되어 있다. 이러한 스펙트럼은 풀루란이 퓨리마진과 동일한 파장 범위에서 흡수하지 않으며 퓨리마진을 함유하는 샘플에서 흡광도 신호를 인위적으로 증가시키지 않음을 나타낸다.
실시예 5
퓨리마진 샘플의 HOLC 분석
벌크 고체 퓨리마진을 에탄올 중에 10 mM(용액 1)의 최종 농도로 희석하였다. 건조 풀루란을 순수한 물에 0%, 2.5%, 5%, 10%, 또는 15% w/v(각각 2a, 2b, 2c, 2d 및 2e 용액)의 최종 농도로 용해하였다. 45 μL의 용액 2a-2e를 별도의 1.5 mL 스냅-튜브 바이알에 피펫팅하였다. 이어서, 5 μL의 용액 1을 각각의 바이알에 첨가하고 피펫팅한 다음 격렬하게 혼합하여 각각 1 mM 퓨리마진의 최종 농도를 함유하는 용액 3a-e를 형성하였다. 혼합 후, 용액 3a-e를 함유하는 바이알을 드라이아이스에 넣어 1시간 동안 동결하였다. 이어서, 이러한 동결된 스톡을 밤새 동결 건조하여 퓨리마진을 함유하는 건조 풀루란 매트릭스를 형성하였다.
모든 HPLC 트레이스에 대한 일반적인 방법: 상술된 퓨리마진 샘플(19.08 μg의 퓨리마진 함유)을 소형 스냅 캡 튜브에서 0.5 mL PBS, pH 6.8을 사용하여 38.16 μg/mL로 희석하였다. 15 μL의 이 용액을 5시간에 걸쳐 HPLC(삽입물이 있는 바이알)에 깔끔하게 주입하여 시간 경과에 따른 안정성과 용해도를 평가하였다. 기기: Synergi Max-RP 50x4.6mm, 2.54u. 용매: 0.1% TFA/수성, 아세토니트릴. 시판되는 퓨리마진(5 mM, Promega cat. #N113)을 PBS에서 38.16 μg/mL로 희석하고 또한 비교를 실행하였다.
0.5 mL PBS, pH 6.8로 희석한 직후, 및 희석 5시간 후 샘플의 HPLC 트레이스를 수득하였으며, 그 결과가 각각 도 7(0% 풀루란 - (A) 0시간, (B) 5시간), 도 8(2.5% 풀루란 - (A) 0시간, (B) 5시간), 도 9(15% 풀루란 - (A) 0시간, (A) 5시간) 및 도 10(Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질 - (A) 0시간, (B) 5시간)에 나타나 있다. (5% 풀루란 및 10% 풀루란 제형 및 시판되는 퓨리마진 샘플에 대한 트레이스를 유사하게 수득하였으며, 데이터는 표시하지 않았다.) 체류 시간 5-10-5.13분에서의 피크(각 스펙트럼에서 우세한 피크)는 퓨리마진을 나타낸다. 5.36-5.37분의 체류 시간에서의 피크(별표로 표시됨)는 (분광학적으로 확인된) 퓨리마진의 알려진 분해 생성물인 아미노피라진을 나타낸다. 특이 피크 및 면적 백분율이 하기 표 1에 요약되어 있다.
샘플 도 체류 시간(분) 면적 백분율
0% 풀루란, 0시간 7(a) 5.11
5.37		 94.15
5.85
0% 풀루란, 5시간 7(b) 1.81
5.11
5.20
5.37
5.71
6.05
6.74		 1.07
56.80
7.26
10.11
1.30
144.44
9.01
2.5% 풀루란, 0시간 8(a) 5.13
6.74
8.13		 99.51
0.16
0.33
2.5% 풀루란, 5시간 8(b) 5.10
5.36
6.04
6.73
8.13		 94.53
3.55
0.71
0.82
0.39
15% 풀루란, 0시간 9(a) 5.11
5.37
6.75
8.14		 98.11
1.11
0.29
0.49
15% 풀루란, 5시간 9(b) 5.10
5.37
6.05
6.73
8.13		 95.85
1.72
1.10
0.87
0.41
Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질, 0시간 10(a) 5.11
5.37
6.05
6.75
8.13
8.50		 85.05
6.07
1.80
3.87
1.57
1.65
Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질, 5시간 10(b) 5.10
5.36
6.04
6.73
8.13
8.49		 60.05
17.18
9.45
9.14
1.92
2.25
도 11 및 도 12는 추가 시점에서 동일한 방법을 통해 얻은 트레이스와 함께 도 7 내지 도 10에 도시된 HPLC 트레이스로부터 컴파일되고 처리된 데이터의 분석값을 나타낸다.
도 11A는 시간 0으로 정규화된 각 트레이스를 사용하여 254 nm에서 흡광도에 의해 측정된 각 샘플의 순도 분석을 나타낸다. 풀루란을 함유한 건조 제형으로 제조된 모든 조건은 수용액에서 높은 수준의 순도를 나타냈으며 상당한 흡광도 손실이 없었다. 풀루란이 결여된 조건(0% 조건 및 시판되는 퓨리마진 용액, Promega cat. # N113)은 화학적 분해로 인해 약 6시간 동안 상당한 흡광도 손실을 나타내었다.
도 11B는 풀루란의 양이 증가하는(0%-15% w/v) PBS에서 제형화된 퓨리마진 샘플(50 nmol)의 피크 면적의 분석값을 나타낸다. (분석값은 도 11A에서 분석된 동일한 트레이스에 대한 것이다). 시판되는 퓨리마진의 순도의 손실과 도 11a의 그래프에서 0% 조건은 피크 면적의 감소에도 해당하며, 신호의 손실은 시간 경과에 따른 용해도의 변화가 아니라 실험 과정에 따른 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질 및 0% 풀루란 조건에서의 제품 분해 때문임을 나타낸다. 따라서, 풀루란의 존재는 퓨리마진의 수용성을 향상시킬뿐만 아니라 용액에서의 분해를 방지하는데 도움이 된다.
도 12는 상술된 샘플에서 퓨리마진의 아미노피라진 부산물의 형성을 나타낸다. 이러한 데이터는 풀루란의 존재가 용액에서 아미노피라진의 형성을 방지하는데 도움이 되었음을 시사한다. 풀루란을 함유한 퓨리마진의 제형은 PBS에서 재구성 후 5.5시간에 걸쳐 최소의 아미노피라진 형성을 나타내었다. 이와 대조적으로, 풀루란이 결여된 벌크 퓨리마진(0% 조건)과 시판되는 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질 제형은 모두 실험 과정에 따라 아미노피라진이 약 12% 증가하였음을 나타내었다. 이러한 데이터는 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질 및 0% 풀루란 샘플에서 퓨리마진 분해로 인하여 도 11B에 나타난 순도의 변화와 일치한다.
실시예 6
페이퍼 매트릭스 상의 퓨리마진 조성물
표준 3.2 mm 휴대용 홀드 펀치(Darice® 브랜드)를 사용하여 Whatman® 903 단백질 세이버 카드에서 3.2 mm 직경의 원형 "스폿"을 가압하여 페이퍼 스폿을 생성하였다. 퓨리마진의 200 μM 및 2 μM 스톡 용액을 에탄올 중에서 제조하였다. 5 μL의 이러한 용액을 각각의 페이퍼 스폿에 적용하고 60분 동안 진공하에 건조시켰다. 이들 스폿을 테스트 전까지 4℃의 어두운 곳에 저장하였다.
테스트시, 각각의 스폿을 표준 96-웰 플레이트의 개별 웰에 배치하고 2 ng/mL의 최종 농도에서 정제된 NanoLuc®(Nluc) 효소를 함유하는 100 μL의 PBS 완충액, pH 7.0으로 재구성하였다. 퓨리마진의 최종 작업 농도는 각각 10 μM 및 0.1 μM이었다. 새롭게 준비된 시판되는 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질은 비교를 위해 10 μM 및 0.1 μM로 제조하였다.
결과는 도 13에 예시되어 있다. 도 13A는 페이퍼 스폿 샘플 및 새로 준비된 시판되는 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질 샘플에 대한 시간 경과에 따른 RLU의 변화를 나타낸다. 도 13B는 각 샘플에 대한 시간 0에서의 초기 RLU를 나타낸다. 도 13C는 튜브 내의 펀칭된 스폿의 이미지를 나타낸다. 이러한 결과는 제형화된 퓨리마진이 고체 매트릭스/페이퍼 내에서 건조되고 이후의 스폿에서 비유기성, 수성 완충액 조건으로 재구성될 수 있음을 나타낸다.
실시예 7
페이퍼 매트릭스 상의 퓨리마진 조성물
본 실험은 국제특허 공개 WO 2014/151736 호에 개시된 구조 보완 분석을 기본으로 한다. 분석 성분을 함유하는 Whatman® 903 단백질 세이버 카드는 먼저 20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 10% w/v 수크로스를 함유하는 495 μL 수크로스 단백질 완충액 중에 5 μL 염소 항-마우스 IgG3-SmBiT(0.4 mg/mL)를 희석하여 제조하였다. 5 μL의 이 스톡 용액을 Whatman® 903 카드 상의 위치 2 및 4에 첨가한 다음 35℃에서 1시간 동안 건조하였다. 5 μL 염소 항-마우스 IgG3-LgBiT(0.4 mg/mL)를 495 μL의 동일한 수크로스 단백질 완충액 중에 희석한 다음, 5 μL의 이 용액을 Whatman® 903 단백질 카드에 위치 2 및 4로서 직접 첨가하였다. Whatman® 903 카드를 35℃에서 1시간 동안 다시 건조하였다.
퓨리마진의 5 mM 스톡을 에탄올 중에서 제조한 다음, 5 μL의 이 스톡을 조건 1, 2 및 4로 카드 위치에 첨가하였다. 이어서, 카드를 15분 동안 고진공 하에 두었다.
카드를 4℃ 또는 25℃에서 유지하고 NanoLuc® 효소 접합 IgG를 첨가하여 활성에 대해 여러 시점에서 테스트하였다. PBS 중 10 pg의 새로운 NanoLuc® 표지된 항체를 1번 위치에 첨가하여 기질 활성을 테스트하였다. 이미지가 기록되었으며 도 14A에 예시되어 있다: 왼쪽-표준 카메라로 촬영한 이미지; 중앙-LAS300 이미저를 사용하여 촬영한 이미지; 오른쪽-iPhone 카메라로 촬영한 이미지. 스폿 1, 2 및 4는 모두 이러한 NanoLuc® 효소의 첨가 시점에서 생물 발광을 생성하였으며, 이는 기질이 활성을 유지하고 있음을 시사한다.
추가 샘플 세트를 유사하게 제조하여 4℃ 또는 25℃에서 3개월 동안 저장하였다. 이미지가 기록되었으며 도 14B에 예시되어 있다: 왼쪽 - 표준 카메라로 촬영 한 이미지; 중앙 - PBS에 10 pg NanoLuc® 표지된 항체를 첨가한 후 4℃에서 저장된 카드 이미지로 스폿 1, 2 및 3에 대한 기질 활성을 결정하고 스폿 4는 단지 PBS 만 음성 대조군으로 수용한다; 오른쪽 - PBS에 10 pg NanoLuc® 표지된 항체를 첨가한 후 25℃에서 저장된 카드 이미지. 단지 스폿 2만이 광을 생성한 반면 스폿 1은 광을 생성하지 못하였다. 본 실시예는 수크로스 단백질 로딩 완충액(20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 10% w/v 수크로스)의 모든 또는 일부 성분이 이 시점 및 온도에서 기질 활성에 필요하고, 그리고 퓨리마진은 고체 페이퍼 매트릭스 상에서 함께 건조되고 4℃ 또는 25℃에서 장기간 저장 후에 재구성될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 8
완충액 및 첨가제를 가진 페이퍼 매트릭스 상의 퓨리마진 조성물
본 실시예의 목표는 전반적인 재구성 효율 및 분석 성능에 대한 첨가제의 효과를 입증하는 것이었다. 다양한 열적 스트레스 요인을 시뮬레이션하고 이러한 조건 하에 전반적인 성능과 안정성을 테스트하기 위해 샘플을 다양한 온도에서 저장하였다.
Whatman® 903 단백질 세이버 스폿 카드(3.2 mm 펀치), 수크로스 단백질 완충액(20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 10% w/v 수크로스(사용 전 밤에 제조)); 에탄올 중 200 μM 퓨리마진 용액; 물 중의 6-아자-2-티오티민(ATT)의 20 mM 및 50 mM 스톡; 및 물 중의 티오우레아의 20 mM 및 100 mM 스톡.
3.2 mm Whatman® 903 단백질 세이버 카드 스폿에 하기와 같은 다양한 추가 성분과 함께 에탄올 중 5 μL의 200 μM 퓨리마진을 첨가하였다:
샘플 1: 퓨리마진
샘플 2: 퓨리마진 + 수크로스 단백질 완충액
샘플 3: 퓨리마진 + ATT (20mM)
샘플 4: 퓨리마진 + ATT (50mM)
샘플 5: 퓨리마진 + ATT (20mM) + 수크로스 단백질 완충액
샘플 6: 퓨리마진 + ATT (50mM) + 수크로스 단백질 완충액
샘플 7: 퓨리마진 + 티오우레아 (20mM)
샘플 8: 퓨리마진 + 티오우레아 (100mM)
샘플 9 : 퓨리마진 + 티오우레아 (20mM) + 수크로스 단백질 완충액
샘플 10: 퓨리마진 + 티오우레아 (100mM) + 수크로스 단백질 완충액
단백질 완충액을 함유하는 스폿을 다른 성분(퓨리마진, ATT 및/또는 티오우레아)을 첨가하기 전에 1시간 동안 35℃에서 건조하였다. ATT가 사용된 경우, 5 μL의 적절한 용액을 스폿에 첨가한 다음, 30분 동안 진공 하에 건조하였다(20 mM 용액 사용시 1 mM ATT, 50 mM 용액 사용시 2.5 mM ATT의 최종 농도를 제공). 티오우레아가 사용된 경우, 5 μL의 적절한 용액을 스폿에 첨가한 다음, 진공 하에 30분 동안 건조하였다(최종 농도는 20 mM 용액 사용시 1 mM, 100 mM 용액 사용시 5 mM의 최종 농도를 제공). 테스트 전 5일 동안 스폿을 만들어 4℃에서 저장하였다.
RLU 실험 조건 - 분석 완충액: PBS, pH 7.0; 플레이트: NBS 고체 백색 플레이트 (Corning® 3600). 다양한 최종 농도의 Nluc 효소를 사용하였다(20 μg/mL, 2 μg/mL, 또는 0.2 μg/mL).
데이터는 도 15A-D에 제시되어 있으며, 도 15A-C는 Nluc 효소의 다양한 농도(각각 20 μg/mL, 2 μg/mL, 및 0.2 μg/mL)에서 발광 반응에서 얻은 미가공 RLU를 보여주고, 도 15D는 Nluc 효소의 하나의 농도(0.2 μg/mL)에서 얻은 % 활성을 나타낸다. 본 데이터는 ATT 또는 티오우레아와 같은 첨가제의 첨가가 다른 제형에 비해 PBS에서 재구성되면 전체 RLU 및 신호 안정성을 개선하는데 도움이 될 수 있음을 시사한다.
실시예 9
상이한 중합체를 가진 페이퍼 매트릭스 상의 퓨리마진 조성물
물질 및 방법: Whatman® 903 단백질 세이버 스폿 카드(3.2 mm 펀치); 퓨리마진. 단백질 완충액은 아래에 기술된 성분으로 시험 전날 준비하였다.
단백질 완충액 1: 정제수
단백질 완충액 2: 20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 10% w/v 수크로스
단백질 완충액 3: 20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 2.5% w/v 풀루란
단백질 완충액 4: 20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 2.5% w/v 트레할로스
5 μL의 단백질 완충액 1-4 중 하나를 각각의 스폿에 적용한 다음, 스폿을 35℃에서 1시간 동안 건조하였다. 이어서, 에탄올 중 퓨리마진의 5 μL의 새로 제조한 200 μM 용액을 각각의 스폿에 도포하고, 스폿을 30분 동안 진공 하에 건조하였다. 이들 스폿을 4℃, 25℃ 및 35℃의 어두운 곳에 저장하였다.
발광 측정의 경우, 테스트 시점에, 각각의 스폿을 표준 96-웰 플레이트의 개별 웰에 배치하고 8 ng/mL의 최종 농도로 정제된 NanoLuc®(Nluc) 효소를 함유하는 100 μL의 PBS 완충액, pH 7.0으로 재구성하였다. 동력학적 판독을 즉시 시작하였다.
제조 직후에 테스트한 스폿의 결과는 도 16에 나타나 있으며, 비교를 위해 새로 제조한 Nano-Glo® 기질의 트레이스가 나타나 있다. 4℃, 25℃ 및 37℃에서 하루 동안 저장한 후 테스트한 스폿의 결과는 각각 도 17A, 17B 및 17C에 나타나 있다. 4℃, 25℃ 및 37℃에서 3일 동안 저장한 후 테스트한 스폿의 결과는 각각 도 18A, 18B 및 18C에 나타나 있다. 이들 데이터는 신호가 페이퍼 매트릭스 상의 퓨리마진 조성물에 대해 더 안정적이지만 전체 신호는 더 낮음을 나타낸다. 퓨리마진을 스폿에 첨가하기 전에 단백질 완충액을 첨가제와 함께 첨가하면 충분한 퓨리마진이 페이퍼에 완전히 유입되는 것을 방지할 수 있었지만, 샘플은 여전히 유용하고 안정적인 신호를 생성하였다.
실시예 10
페이퍼 매트릭스 중의 제형화된 퓨리마진 기질에 대한 가속 안정성 연구
페이퍼 퓨리마진 샘플을 공지된 퓨리마진 제형(Nano-Glo® 기질, Promega cat. #N113, 및 Nano-Glo® 생세포 기질, Promega cat. #N205).에 비하여 RLU에 의해 측정된 퓨리마진의 열 안정성 및 기능적 무결성에 대한 제형의 효과를 결정하기 위해 테스트하였다.
Whatman® 903 단백질 세이버 스폿 카드(3.2 mm 펀치)를 다음과 같이 처리하였다.
조건 1 및 2의 경우, 페이퍼 스폿을 5 μL의 물(조건 1) 또는 단백질 완충액(20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 10% w/v 수크로스 - 조건 2)로 전처리하였다. 조건 3은 수크로스 성분이 결여된 5μL 단백질 완충액(20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20)로 전처리하여 제조하였다. 모든 조건은 35℃에서 60분 동안 건조하였다. 퓨리마진의 200 μM 스톡 용액을 에탄올 중에서 제조한 다음, 5 μL의 이 스톡을 상술된 바와 같이 조건 1 및 2에 첨가하였다. 조건 3의 경우, 퓨리마진의 200 μM 스톡을 물 중 2.5% 풀루란과 <10% v/v 에탄올의 혼합물 중에서 제조하였다. 5 μL의 이 용액을 조건 3에 첨가한 다음, 모든 스폿을 추가로 30분 동안 감압 하에 건조하였다. 이어서, 스폿을 25℃ 또는 60℃에서 어두운 곳에 저장하였다. 측정시, 각각의 조건으로부터의 하나의 스폿을 개별 웰에 배치한 다음, Nluc를 함유하는 PBS로 희석하였다. 퓨리마진의 최종 이론 농도는 10 μM이고 Nluc의 최종 농도는 1 ng/mL이다.
컴파일된 RLU 데이터는 재구성 및 테스트 전 다양한 기간 동안: (A) 60℃ 및 (B) 25℃에서 저장된 샘플 데이터와 함께 도 19에 나타나 있다. 도 19는 또한 재구성 및 테스트 전 다양한 기간 동안 샘플을: (C) 60℃ 및 (D) 25℃에 저장한 후 시간 0에서의 효소 활성 백분율에 대한 데이터를 나타낸다.
상기 실험은 고농도(최종 1 mM 및 100 μM)와 저농도(최종 10 μM)의 퓨리마진을 포함하도록 확장되었다(도 20). 각각의 조건은 전술한 바와 같이 준비하였다: 스폿은 물, 단백질 완충액 또는 수크로스가 결여된 단백질 완충액으로 전처리하였다. 처음 2개의 조건에서, 에탄올 중 퓨리마진의 2 mM 또는 200 μM 용액 5 μL를 각각의 스폿에 첨가한 다음 추가로 30분 동안 35℃에서 건조하였다. 세 번째 조건에서, 퓨리마진의 20 mM 스톡 또는 200 μM 스톡을 물 중 2.5% 풀루란과 <10% v/v 에탄올의 혼합물 중에서 제조하였다. 5 μL의 이 용액을 조건 3에 첨가한 다음, 모든 스폿을 추가로 30분 동안 35℃에서 건조하였다. 이어서, 스폿을 25℃ 또는 60℃에서 어두운 곳에 저장하였다. 이어서, 스폿을 25℃ 또는 60℃에서 어두운 곳에 저장하였다.
도 20은 재구성 및 테스트 전 다양한 기간 동안: (A) 60℃ 및 (B) 25℃에서 저장된 샘플에 대한 컴파일된 RLU 데이터를 나타낸다. 도 20은 또한 재구성 및 테스트 전 다양한 기간 동안 샘플을: (C) 60℃ 및 (D) 25℃에 저장한 후 시간 0에서의 효소 활성 백분율에 대한 데이터를 나타낸다.
퓨리마진의 로딩 농도를 높이면, 최대 RLU와 활성 백분율 모두 전반적으로 개선된다. 그러나, 전처리(물)되지 않은 스폿은 아직도 필적하는 농도에서 단백질 완충액 또는 풀루란을 갖는 단백질 완충액을 함유하는 두 전처리에 비해 전반적으로 더 나은 성능을 발휘하였다.
실시예 11
페이퍼 샘플 중의 퓨리마진 제형의 건조 방법의 효과
3.2 mm 펀칭된 Whatman® 903 단백질 세이버 카드 스폿을 물 또는 단백질 완충액(20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 10% w/v 수크로스)로 처리한 다음, 35℃에서 1시간 동안 건조하였다. 에탄올 중 퓨리마진의 10 mM 스톡 용액을 제조한 다음, 이 용액 20 μL를 물 중 2.5%(w/v) 풀루란 또는 5%(w/v) 풀루란 용액 980 μL에 첨가하였다. 잘 혼합한 후, 이 용액 5μL를 각각의 스폿에 첨가하였다. 스폿을 진공 하에 또는 주위 온도에서 2시간 동안 어두운 곳에서 건조하였다. 건조 후, 스폿을 어두운 곳에서 밤새 4℃에서 저장하였다.
테스트를 위해, 스폿을 96-웰 NBS 플레이트의 개별 웰에 첨가하였다. PBS 완충액(pH 7.4) 중의 1.068 nM Nluc 용액 100 μL를 각각의 웰에 첨가 하였다. 플레이트를 발광계에 놓고 최대 60분 동안 판독하였다. 각각의 스폿은 세 번 실행하였다.
결과는 도 21에 나타나 있으며, 도 21A는 진공 하에 건조된 샘플에 대한 데이터를 나타내고 도 21B는 주변 공기 하에 건조된 샘플에 대한 데이터를 나타낸다. 기질 성능은 스폿이 진공 하에 또는 주변 온도에서 건조되었는지 여부에 관계없이 크게 영향을 받지 않는 것으로 생각된다.
도 21C는 풀루란의 존재가 전체 RLU 출력을 감소시키는 것을 나타내는 도 21A의 요약 데이터를 나타낸다. 경험적 관찰은 풀루란의 존재가 페이퍼 매트릭스의 표면을 경질의 왁스상으로 만들어 주는 것으로 나타났다. 이는 단백질에 대한 기질의 접근을 방해하여 광 출력의 저하를 초래할 수 있다. 이러한 관찰은 또한 페이퍼 매트릭스에 다른 성분이 추가되는 순서가 전체 기능에 일조할 수 있음을 나타낸다.
주위 온도에서 기질 첨가 후에 두 번째로 건조되거나 또는 35℃에서 건조된 추가의 스폿 세트를 비교하였다. 각각의 스폿을 물, 수크로스 단백질 완충액(20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 10% w/v 수크로스) 또는 풀루란 단백질 완충액(20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 2.5% w/v 풀루란)으로 전처리한 다음, 35℃에서 1시간 동안 건조하였다. 퓨리마진의 200 μM 스톡을 에탄올 중에서 제조한 다음, 5 μL의 이 퓨리마진 스톡을 각각의 스폿에 첨가하였다. 이어서, 스폿을 주위 온도 또는 35℃에서 30분 동안 어두운 곳에 놓아두었다. 이어서, 스폿을 25℃ 또는 60℃에서 최대 5일 동안 어두운 곳에 저장하였다. 테스트시, 각각의 조건에 해당하는 스폿을 표준 96-웰 플레이트의 웰에 넣고, 각각의 웰에서 100 μL PBS 용액, pH 7.0 및 2 ng/mL Nluc로 재수화하여 용액 중 10 μM 퓨리마진의 최종 농도를 얻었다.
결과는 도 22에 나타나 있다. 35℃에서 두 번째로 건조된 스폿은 주위 온도에서 두 번째로 건조된 스폿보다 더 높은 RLU 출력을 나타내었다. 이러한 결과는 조건(단백질 완충액 전처리 또는 물 제어) 또는 스폿이 25℃ 또는 60℃에서 최대 5일 동안 저장되었는지 여부에 관계없이 일관되었다(도 22A 및 22B에 표시된 최대 RLU 값 및 도 22C 및 22D에 표시된 %활성). 이러한 결과는 건조 방법의 차이가 전체 기판 성능에 영향을 미쳤으며 35℃에서 두 번째로 스폿을 건조하는 것이 기질 성능에 유리하다는 것을 시사한다.
실시예 12
분말 풀루란 제형에 대한 가속 기질 테스트
분말 퓨리마진 샘플을 테스트하여 공지된 퓨리마진 제형(Nano-Glo® 기질, Promega cat. #N113, 및 Nano-Glo® 생세포 기질, Promega cat. #N205)에 비하여 RLU 및 HPLC에 의해 측정된 퓨리마진의 열 안정성 및 기능적 무결성에 대한 풀루란 제형의 효과를 확인하였다.
물질 및 방법: 벌크 고체 퓨리마진을 에탄올 중에서 10 mM(용액 1)의 최종 농도로 희석하고; 건조 풀루란을 순수한 물 중에서 0%, 2.5%, 5%, 10%, 15% w/v(각각 용액 2a, 2b, 2c, 2d 및 2e)의 최종 농도로 용해하였다. 45 μL의 용액 2a-e를 별도의 1.5 mL 스냅-튜브 바이알에 피펫팅하였다. 이어서, 5 μL의 용액 1을 각각의 바이알에 첨가하고 피펫팅한 다음 격렬하게 혼합하여 각각 1 mM 퓨리마진의 최종 농도를 함유하는 용액 3a-e를 형성하였다.
혼합 후, 용액 3a-e를 함유하는 바이알을 드라이아이스에 넣어 1시간 동안 동결하였다. 이어서, 이러한 동결된 스톡을 밤새 동결 건조하여 퓨리마진을 함유하는 건조 풀루란 매트릭스를 형성하였다.
테스트를 위한 특이 분말 퓨리마진 샘플을 다음과 같이 제조하였다:
1) 0%의 풀루란을 갖는 분말 제형으로 제조된 1 mM(총 50 nmol) 퓨리마진 스톡
2) 2.5%의 풀루란을 갖는 분말 제형으로 제조된 1 mM(총 50 nmol) 퓨리마진 스톡
3) 5%의 풀루란을 갖는 분말 제형으로 제조된 1 mM(총 50 nmol) 퓨리마진 스톡
4) N113 용액(Promega cat. #N113)으로 제조된 1 mM(총 50 nmol) 퓨리마진 스톡
5) N205 용액(Promega cat. #N205)으로 제조된 1 mM(총 50 nmol) 퓨리마진 스톡(참고: N205 용액은 N113 용액 이후 약 15시간 후에 제조되었다)
6) 벌크 퓨리마진(50 nmol, 에탄올 중 스톡 용액에서 분취)
HPLC 테스트에 앞서, 샘플의 절반은 25℃에서 저장하였고 나머지 절반은 테스트 전에 장기간 60℃에서 저장하였다. HPLC 테스트를 위해, 제형화된 퓨리마진(19.08 μg)을 소형 스냅 캡 튜브에서 0.5 mL PBS 완충액, pH 6.8로 희석하였다. 튜브를 약 15초 동안 볼텍싱한 다음 어두운 곳에서 30분 동안 실온에서 평형을 유지하였다. 15 μL 샘플을 HPLC(삽입물이 없는 바이알), 0.1% TFA/ Aq, 아세토니트릴, Synergi Max-RP 50x4.6mm, 2.54u 상에 깔끔하게 주입하였다. 0 시간(도 23A)에서 또는 60℃에서 48시간 저장한 후(도 23B)에 5% w/v 풀루란을 포함하는 샘플에 대한 HPLC 트레이스는 단지 최소한의 분해만을 나타낸다. 0 시간(도 24A)에서 또는 60℃에서 48시간 저장한 후(도 24B)에 N113 샘플에 대한 HPLC 트레이스는 훨씬 더 많은 분해를 나타낸다.
다른 샘플(표시되지 않음)에 대해 HPLC 데이터를 얻었으며, 데이터를 처리하여 도 25에 열 안정성 트레이스를 나타내었다. 곡선 아래 영역을 측정하고 35일간에 걸쳐 플롯팅하였다. "벌크"는 제조된 고체 퓨리마진을 지칭한다. "0% 풀루란"은 에탄올의 스톡 용액 중에 용해되고, (풀루란없이) 물에 첨가되고, 동결 건조된 퓨리마진을 지칭한다. 도 25A 및 25B는 원시 피크 영역으로서 25℃ 및 60℃에서의 열 안정성을 보여주는 반면, 도 25C 및 25D는 피크 영역 백분율로서 25℃ 및 60℃에서의 열 안정성을 나타낸다. 고체 퓨리마진으로 이루어진 제형은 실온 또는 60℃에서 저장하였을 때 높은 수준의 일관된 화학적 무결성을 보여주었다. 이와 대조적으로, Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질(Promega cat. # N113) 및 Nano-Glo® 생세포 기질(Promega cat. # N205) 용액으로 제형화된 퓨리마진은 승온에서 저장하였을 때 측정된 시간에 따라 피크 높이와 면적의 상당한 손실을 보였다.
발광 측정을 위해, 분말 퓨리마진 샘플 #1-5는 PBS에서 재구성한 반면, 샘플 #6은 에탄올 중에서 재구성하였다(모든 경우 500 μL). 샘플을 실온에서 30분 동안 평형을 유지하였다. 이어서, 샘플을 1:5(100 μM에서 20 μM으로) 및 1:100 (20 μM에서 0.2 μM로)으로 추가로 희석하였다. 이 용액 50 μL를 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 백그라운드를 판독한 다음, NanoLuc®(Nluc) 효소를 첨가하였다. (첨가에 앞서, 스톡 시판 Nluc 샘플을 PBS에서 2 ng/mL의 농도로 희석한 다음, 각각의 웰에 50 μL를 첨가하였다.) 희석시, 최종 농도는 0.1 μM 퓨리마진 및 1 ng/mL Nluc 였다. 이어서, RLU를 결정하였다. (백그라운드는 Nluc를 첨가하지 않은 2X 기질 용액의 판독값이다.)
컴파일된 RLU 데이터는 도 26에 나타나 있다. 각 그래프 범례의 숫자는 다음 제형에 해당한다: 1 - 0% 풀루란(참고 - 이 샘플은 용해도 문제를 경험했으며 완전히 재구성되지 않았을 수 있다); 2 - 2.5% 풀루란 동결 건조 케이크 제형; 3 - 5% 풀루란 동결 건조 케이크 제형; 4 - Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질(Promega cat. # N113); 5 - Nano-Glo® 생세포 기질(N205); 6-벌크 퓨리마진(에탄올 중에서 재구성됨). 도 26A-C에는 샘플을, 전술된 바와 같이, 50 μM 기질(도 26A), 10 μM 기질(도 26B), 또는 0.1 μM 기질(도 26C)을 사용하여 재구성 및 테스트하기 전에 다양한 기간 동안 60℃에서 저장한 후의 데이터가 나타나 있다. 도 26D-F에는 샘플을, 전술된 바와 같이, 50 μM 기질(도 26D), 10 μM 기질(도 26E), 또는 0.1 μM 기질(도 26F)을 사용하여 재구성 및 테스트하기 전에 다양한 기간 동안 25℃에서 저장한 후의 데이터가 나타나 있다.
도 27은 효소 활성 백분율에 대한 데이터를 나타낸다. 각 그래프 범례의 숫자는 다음 제형에 해당한다: 1 - 0% 풀루란(참고 - 이 샘플은 용해도 문제를 경험했으며 완전히 재구성되지 않았을 수 있다); 2 - 2.5% 풀루란 동결 건조 케이크 제형; 3 - 5% 풀루란 동결 건조 케이크 제형; 4 - Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질(Promega cat. # N113); 5 - Nano-Glo® 생세포 기질(N205); 6-벌크 퓨리마진(에탄올 중에서 재구성됨). 도 27A-C는 샘플을, 전술된 바와 같이, 50 μM 기질(도 27A), 10 μM 기질(도 27B), 또는 0.1 μM 기질(도 27C)을 사용하여 재구성 및 테스트하기 전에 다양한 기간 동안 60℃에서 저장한 후 0 시간에서의 효소 활성을 보여주며, 도 27D-F는 샘플을, 전술된 바와 같이, 50 μM 기질(도 27D), 10 μM 기질(도 27E), 또는 0.1 μM 기질(도 27F)을 사용하여 재구성 및 테스트하기 전에 다양한 기간 동안 25℃에서 저장한 후 0 시간에서의 효소 활성을 나타낸다.
고체 퓨리마진 샘플은 승온에 노출된 후 루시페라아제 분석시에 RLU 출력에 의해 나타난 바와 같이 일관된 화학적 무결성을 보여주었다. 이와는 대조적으로, 시판되고 있는 N113 및 N205 용액으로 제형화된 퓨리마진은 승온에서 저장한 후 시간이 지남에 따라 발광 신호의 손실을 나타내었다. (참고 : 샘플 6은 에탄올 중에 용해되어 더 높은 농도에서 Nluc 효소 활성을 억제하였다.)
실시예 13
제형화된 퓨리마진 필름-코팅된 마이크로타이터 플레이트
제형화된 퓨리마진 필름을 마이크로타이터 플레이트 상에 직접 형성하였다. 2.5%(w/v) 풀루란 또는 5% (w/v) 풀루란 중의 200 mM 퓨리마진을 함유하는 필름을 마이크로타이터 플레이트의 웰내에서 직접 제조하였다. 이러한 포맷의 대표적인 이미지는 도 29에 나타나 있다(명확성 및 설명 목적을 위해 인위적으로 채색됨). 웰 코팅을 다음과 같이 제조하였다: 에탄올 중의 2 mM 퓨리마진 스톡을 제조하였다(용액 1). 별도로, 2.5% 및 5% w/v 풀루란의 용액을 물 중에서 제조하였다(각각 용액 2 및 용액 3). 45 μL의 용액 2 또는 용액 3을 표준 96-웰 플레이트의 개별 웰에 첨가하였다. 이어서, 5 μL의 용액 1을 용액 2 또는 용액 3을 함유하는 각각의 웰에 첨가하고 피펫팅하여 완전히 혼합하였다. 최종 용액 중의 에탄올 농도는 5% v/v 미만이어야 한다. 더 높은 농도의 에탄올은 풀루란이 용액에서 빠져 나가게 만드는 원인이 된다.
이어서, 플레이트를 3시간 동안 주변 조건 하에 어두운 곳에서 건조하였다. 웰 중의 필름을 100 μL PBS, pH 7.0으로 재수화한 다음, 2 ng/mL Nluc를 즉시 또는 모든 조건에 대해 용액 중 최종 농도가 10 μM 퓨리마진인 진탕기 상의 50 μL/웰의 PBS 중에서 30분의 예비 평형화 기간을 거친 후에 각각의 웰에 첨가하였다. RLU를 판독하고 새롭게 제조된 시판되고 있는 퓨리마진 기질(Nano-Glo® 생세포 기질, Promega cat. #N205)과 비교하였다. 데이터는 도 28에 나타나 있으며, (a) 예비 평형화가 없는 미가공 RLU로서의 데이터를 나타내고, (b) 예비 평형화가 없는 활성으로서의 데이터를 나타내며, (c) 예비 평형화된 미가공 RLU로서의 데이터를 나타낸다. 본 실시예는 퓨리마진이 경질 표면 상의 풀루란 기반 필름 내에서 건조되고 지정된 시간에 재구성될 수 있음을 강조한다. 육안 관찰에 따르면, 필름은 또한 벌크 고체 퓨리마진보다 더 빠르고 완벽하게 재구성되었다. 이러한 데이터는 또한 PBS 마이크로타이터 플레이트에서 퓨리마진-풀루란 기반 필름의 예비 평형화가 광 출력을 크게 감소시켰음을 나타낸다.
도 29는 전술한 것과 동일한 방법을 사용하지만 필름 코팅을 시각화할 수 있도록 식용 색소를 첨가하여 생성된 퓨리마진 필름 플레이트의 이미지를 나타낸다.
도 30A는 도 28에 제시된 데이터에 대해 설명된 동일한 포맷의 동역학적 판독 결과를 보여 주지만, 더 높은 로딩 농도의 퓨리마진(최종 100 μL 중 20 μM) 및 일부 경우에 퓨리마진 제형에는 완전한 용액으로 함께 필름화되는 NanoLuc® 효소가 포함되어 있음을 나타낸다. 도 30B는 도 30A에서 설명된 동일한 실험에 대한 퍼센트 활성을 나타낸다. 도 30C는 저장 기간 후 필름화된 마이크로타이터 플레이트의 안정성 연구 결과를 보여 주며, 10 일째에 약 35% 활성이 남아 있음을 나타낸다.
실시예 14
제형화된 퓨리마진의 순도, 안정성 및 부산물 형성에 대한 HPLC 및 질량 분광 분석
동결 건조된 풀루란 매트릭스에 제형화된 퓨리마진을 0%, 2.5%, 및 5% w/v 풀루란 중의 19.07 μg의 퓨리마진을 사용하여 실시예 12에 기술된 바와 같이 제조하였다. 벌크 퓨리마진, Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질(Promega Cat # N113), 및 Nano-Glo® 생세포 기질(Promega Cat # N205)을 포함하는 샘플을 25℃ 또는 60℃에서 35일 동안 저장하였다. 샘플을 PBS 완충액, 또는 벌크 퓨리마진 샘플 및 0% 풀루란 샘플의 경우에는 에탄올 중에서 재구성하고, 실온에서 30분 동안 평형화한 다음, 퓨리마진 분해 경로의 알려진 부산물에 대해 HPLC 상에서 분석하였다. 흡광도 데이터는 도 31에 나타나 있다: A - 벌크 퓨리마진; B - 0% 풀루란; C - 2.5% 풀루란; D - 5% 풀루란; E - Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질; 및 F - Nano-Glo® 생세포 기질. 모든 경우에, 고체 형태로 제형화된 퓨리마진은 시판되고 있는 용액 기반 저장 제형(Promega Cat #N113 및 Cat #N205)에 비해 분해 산물이 현저히 적음을 보여주었다.
도 32는 퓨리마진 피크에 대한 개별 부산물의 퍼센트 면적을 나타낸다: A - 벌크 퓨리마진; B - 0% 풀루란; C - 2.5% 풀루란; D - 5% 풀루란; E - Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질; 및 F - Nano-Glo® 생세포 기질. 고체 풀루란 제형에서, 퓨리마진은 특히 실온에서 저장하였을 때(각각의 조건에 대해 왼쪽 막대) 최소량의 부산물 형성을 갖는 주요 피크이다. 이와 대조적으로, 35일 후, 25℃(왼쪽 막대) 또는 60℃(오른쪽 막대)에서 저장하였을 때 시판 제형 중에 저장된 퓨리마진은 거의 전체적인 손실이 있었다.
실시예 15
실온에서 6개월 저장시의 제형화된 퓨리마진 조성물 기질 활성
19 μg의 퓨리마진을 동결 건조 케이크로 제형화하거나 필름 액적을 실시예 1, 조건 1 및 3에 기술된 바와 같이 15% w/v 풀루란 중에서 제조하였다. 샘플을 주변 광의 존재하에 6개월 동안 25℃에서 저장하였다. 두 제형 모두 용액에서 10 μM 퓨리마진의 최종 농도를 위해 100 μL PBS, pH 7.0 및 1 ng/mL NanoLuc(Nluc)로 재구성하였다. RLU를 판독하고 새롭게 제조된 시판되고 있는 퓨리마진 기질(Nano-Glo® 생세포 기질, Promega cat. #N205)과 비교하였다. 이 실험의 결과는 도 33에 나타나 있다(A - 미가공 RLU, B - 0시간에서의 활동 백분율). 주위 온도와 광의 존재하에 6개월간 저장한 후, 풀루란 매트릭스 중에 제형화된 고체 퓨리마진은 루시페라아제에 노출되었을 때 여전히 생존 가능하였다.
실시예 16
상이한 고체 지지체 매트릭스 상의 제형화된 퓨리마진 활성 및 안정성
네 가지 상이한 페이퍼 유형을 기질 보존 및 기질 무결성에 대한 효과를 포함한 상이한 특성에 대해 테스트하였다. 포함된 페이퍼 유형:
1. 두꺼운 유리 섬유: 유리 미세 섬유 934-AH (Ahlstrom, 입자 보유: 1.5 μM, 두께: 435 μm);
2. 얇은 유리 섬유: 유리 섬유 진단 패드(EMD Millipore), GFDX103000, Lot # 495362;
3. 셀룰로스: 셀룰로스 샘플 패드(EMD Millipore), CFSP20300M Lot# 11065; 및
4. Whatman® 903 단백질 세이버 카드
각각의 페이퍼 샘플을 7 x 7 mm 정사각형으로 절단하였다. 퓨리마진의 10 mM 스톡을 제조하고, 이 스톡 10 μL를 각각의 페이퍼 매트릭스에 첨가하였다. 샘플을 35℃에서 30분 동안 건조하였다. 카드는 25℃ 또는 60℃에서 72시간 동안 어두운 곳에 저장하였다. 이어서, 샘플을 유리 바이알에 넣고 1 mL의 에탄올을 첨가하였다. 바이알을 10초 동안 초음파 처리하고, 용매를 추출하고, 여과한 다음, 분석 용 HPLC로 분석하였다. 이러한 실험의 결과는 도 34에 나타나 있다. 도 34A는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스에서 추출한 후 퓨리마진 피크의 원시 면적을 나타낸다. 페이퍼에서 추출하고 용액에서 분석한 퓨리마진의 양은 또한 페이퍼 유형에 영향을 받는다(도 34B). 용액으로 다시 추출된 기질의 경우, 퓨리마진의 분해 속도는 퓨리마진을 벌크 퓨리마진에 비해 페이퍼 또는 섬유 매트릭스 상에서 건조할 때 약간 더 빠르다. 또한, 퓨리마진 기질은 다양한 고체 표면에서 효과적으로 건조 및 재구성될 수 있다(도 34C).
리포터 단백질인 LgTrip와 조합으로 페이퍼 상에서의 기질 안정성을 결정하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 페이퍼 표면을 제조하기 위해, 200 μL의 5 uM LgTrip(3546)(서열 번호 3; 예를 들어, 전문이 본원에서 참고로 포함된 미국 특허출원 제62/684,014호 참조), 5 mM ATT, 및 5 mM 아스코르브산을 함유하는 바이알을 제조하였다. 이 용액 약 5 μL를 각각의 스폿에 첨가한 다음, 스폿을 35℃에서 1시간 동안 건조하였다. 건조 후, 에탄올 중 퓨리마진의 1 mM 스톡을 제조하였다. 이 용액 약 5 μL를 각각의 스폿에 첨가한 다음, 추가로 30분 동안 35℃에서 건조하였다.
기질 및 LgTrip 입력을 사용하여 다양한 물질을 테스트하였다. 테스트시, 새로운 Nluc를 첨가하여 기질을 단리하였다. 도 35A는 새로운 NanoLuc가 건조된 LgTrip 및 기질에 첨가되었을 때 표면의 재구성으로 인한 세 가지 다른 고체상 물질(Whatman 903, Ahlstrom 237 및 Ahlstrom 6613H)에서의 생물 발광 신호를 나타낸다. Alhstrom6613H는 시간이 지남에 따라 신호 출력에 해로운 것으로 생각된다. 전반적으로, 분석 성분의 안정성은 내장된 고체 매트릭스 물질의 조성에 의해 영향을 받을 수 있다.
도 35B는 LgTrip과 기질을 모두 포함하고 25일 이상 동안 주변 조건 하에 저장된 Whatman 903 페이퍼로부터의 생물 발광 신호를 나타낸다. 스폿은 테스트 시점에 PBS 중 1 nM 디펩티드에 노출되었다. 전반적으로, 본 실험은 주위 온도에서 저장 시간을 연장한 후에도 물질에서 신호가 크게 손실되지 않음을 나타낸다.
실시예 17
상이한 고체 지지체 매트릭스 상의 제형화된 퓨리마진 활성 및 안정성에 대한 첨가제의 효과
다양한 첨가제를 퓨리마진과 함께 용액으로 조합하고 페이퍼 표면 상에서 건조하였다. 이러한 실험은 페이퍼 매트릭스 내에서 건조되는 동안 전반적인 기질 무결성을 개선하는데 목적이 있다. 에탄올 중에서 10 mM 아스코르브산 용액을 제조하였다. 이어서, 이 용액을 벌크 퓨리마진에 첨가하여 에탄올 중 1:1 아스코르브산 및 퓨리마진을 함유하는 용액을 제조하였다. 이 용액 10 μL를 선행 실시예에서 기술된 것과 동일한 페이퍼 매트릭스에 첨가하였다. 샘플을 35℃에서 30분 동안 건조하였다. 카드는 25℃ 또는 60℃에서 72시간 동안 어두운 곳에 저장하였다. 샘플을 유리 바이알에 넣고 1 mL의 에탄올을 첨가하였다. 바이알을 10초 동안 초음파 처리하고, 용매를 추출하고, 여과한 다음, 분석용 HPLC로 분석하였다.
이러한 실험의 결과는 도 36에 설명되어 있다. 퓨리마진 피크의 원시 면적은 도 36A에 표시되어 있으며, 이는 아스코르브산 첨가제를 함유하지 않은 샘플보다 퓨리마진에 대한 더 양호한 흡광도를 나타낸다. 이러한 효과는 또한 퓨리마진의 용액으로의 전체 회수율(도 36B)뿐만 아니라 퓨리마진 순도(도 36C)에서도 관찰되었다. 순도는 약 15 내지 20% 증가했으며, 이는 아스코르브산의 존재가 페이퍼에 저장되었을 때 퓨리마진 기질의 열적 또는 화학적 분해를 제한하는데 도움이 된다는 것을 시사한다.
실시예 18
다양한 고체 지지체 매트릭스의 화학적 전처리가 제형화된 퓨리마진 활성 및 안정성에 미치는 효과
페이퍼 매트릭(Ahlstrom 유리 미세 섬유 934-AH 및 Whatman® 903 단백질 세이버 카드)를 30% w/v 시트르산 용액에 30분 동안 침지시킨 다음 35℃에서 밤새 건조하였다. EtOH 중 퓨리마진의 10 mM의 스톡을 제조하고, 10μL의 스톡을 7x7mm 페이퍼 카드에 첨가한 다움, 35℃에서 30분 동안 건조하였다. 이어서, 카드를 RT 또는 60℃에서 72시간 동안 어두운 곳에 저장하였다. 판독시, 카드를 1 mL의 에탄올로 추출하고 15초 동안 초음파 처리하였다. 이어서, 추출된 용매를 여과하고 분석용 HPLC 상에 주입하였다.
이러한 실험의 결과는 도 37에 도시되어 있다. 퓨리마진 피크의 원시 면적은 도 37A에 도시되어 있다. 퓨리마진 기질을 적용하기 전에 30% 시트르산 용액으로 페이퍼 기질을 전처리 하면 시트르산 전처리를 하지 않은 페이퍼 기질에 비해 에탄올로 추출한 후 기질의 전체 순도에 최소한의 영향을 미쳤다(도 37C). 또한, 에탄올로 추출한 후 용액으로 회수되는 기질의 양도 제한적으로 개선되었다(도 37B).
실시예 19
다양한 고체 지지체 매트릭스의 기계적 전처리가 제형화된 퓨리마진 활성 및 안정성에 미치는 효과
페이퍼 매트릭스(Ahlstrom 유리 미세 섬유 934-AH 및 Whatman® 903 단백질 세이버 카드)를 30분 동안 물에 침지시킨 다음 밤새 감압 건조하여 페이퍼 매트릭스 내에 존재하는 기공을 붕괴시키거나 수축시켰다. 에탄올 중 퓨리마진의 10 mM의 스톡을 제조하고, 10μL의 스톡 용액을 7x7mm 페이퍼 카드에 첨가한 다움, 35℃에서 30분 동안 건조하였다. 이어서, 카드를 RT 또는 60℃에서 72시간 동안 어두운 곳에 저장하였다. 판독시, 카드를 1 mL의 에탄올로 추출하고 15초 동안 초음파 처리하였다. 추출된 용액을 여과하고 분석을 위해 분석용 HPLC 상에 주입하였다.
본 실험의 결과는 도 38에 도시되어 있으며, 퓨리마진 피크의 원시 면적은 도 38A에 도시되어 있고, 퍼센트 회수율은 도 38B에 도시되어 있으며, 순도는 도 38C에 도시되어 있다. 이전에 가압 하에 건조된 페이퍼에 첨가되고 건조된 기질과 전처리되지 않은 페이퍼 사이에는 기질 순도 또는 용액으로의 회수율 측면에서 현저한 개선이 없다.
실시예 20
상이한 고체 지지체 매트릭스 상의 제형화된 퓨리마진 활성 및 안정성에 대한 첨가제의 효과
다양한 첨가제를 퓨리마진과 함께 용액으로 조합하고 페이퍼 표면 상에서 건조하였다. 이러한 일련의 실험은 고체 매트릭스 내에서 건조되는 동안 전반적인 기질 무결성을 개선하는데 도움을 주는데 그 목적이 있다. 에탄올 중에서 10 mM 시트르산 용액을 제조하였다. 이 용액을 벌크 퓨리마진에 첨가하여 에탄올 중 1:1 시트르산 및 퓨리마진을 함유하는 용액을 제조하였다. 이 용액 10 μL를 선행 실시예에서 기술된 것과 동일한 페이퍼 매트릭스에 첨가하였다. 샘플을 35℃에서 30분 동안 건조하였다. 카드는 25℃ 또는 60℃에서 72시간 동안 어두운 곳에 저장하였다. 샘플을 유리 바이알에 넣고 1 mL의 에탄올을 첨가하였다. 바이알을 10초 동안 초음파 처리하고, 용매를 여과한 다음, 분석용 HPLC로 분석하였다.
이러한 실험의 결과는 도 39에 설명되어 있다. 퓨리마진 피크의 원시 면적은 시트르산의 존재(A) 및 부재(B)하에 페이퍼 내에서 건조된 퓨리마진에 대해 도 39A 및 39B에 도시되어 있다. 254 nm에서의 순도는 시트르산의 존재(C) 및 부재(D)하에 페이퍼 내에서 건조된 퓨리마진에 대해 도 39C 및 39D에 도시되어 있다. 플롯은 시트르산과 혼합하여 건조했을 때 퓨리마진에 대해 더 나은 흡광도를 나타낸다. 이러한 흡광도의 증가는 순도의 약 10 내지 20% 증가에 해당하며, 이는 시트르산의 존재가 본 실험 과정에서 퓨리마진 기질의 열화학적 분해를 제한하는데 도움이 된다는 것을 시사한다.
실시예 21
시트르산 및 아스코르브산이 수크로스 단백질 로딩 완충액 존재 하에 제형화된 퓨리마진 활성 및 안정성에 미치는 효과
퓨리마진 활성 및 안정성에 대한 시트르산 및 아스코르베이트 산의 효과는 수크로스 단백질 완충액 (20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 10% w/v 수크로스)의 존재 또는 부재에서 테스트하였다. 전술한 바와 같이, Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 스폿을 제조하였다. 각각의 스폿을 수크로스 단백질 완충액 또는 물로 전처리하고, 35℃에서 1시간 동안 건조하였다. 퓨리마진의 200 μM 스톡을 에탄올 중에서 또는 200 μM 시트르산 또는 200 μM 아스코르베이트와 함께 에탄올 용액 중에서 제조하였다. 시트르산 또는 아스코르브산을 동일한 몰 농도로 함유하는 5 μL의 퓨리마진 또는 퓨리마진 용액을 각각의 스폿에 첨가하였다. 이어서, 스폿을 35℃에서 1시간 동안 다시 건조하였다. 이어서, 이들 스폿을 25℃에서 최대 12일 동안 어두운 곳에 저장하였다.
테스트시, 각각의 조건에 해당하는 스폿을 표준 96-웰 플레이트의 웰에 넣고, 각각의 웰에서 100 μL PBS 용액, pH 7.0 및 2 ng/mL Nluc로 재수화하여 용액 중 10 μM 퓨리마진의 최종 농도를 얻었다. RLU를 판독하고 새롭게 제조된 시판되고 있는 퓨리마진 기질(Nano-Glo® 생세포 기질, Promega cat. #N205)과 비교하였다. 이러한 실험의 결과는 도 40에 도시되어 있다.
수크로스 단백질 완충액으로 전처리된 페이퍼 스폿에서 12일간에 걸쳐 상당한 신호 손실이 나타났다(도 40A). 이러한 결과는 물 또는 아스코르브산 또는 시트르산의 존재 하에 물로 전처리된 조건에 비하여 기질의 활성 백분율의 거의 완전한 손실에 해당하며, 이는 12일간에 걸쳐 상당한 안정성과 신호 출력을 나타내었다(도 40B). 이러한 결과의 요약이 도 40C에 나타나 있다. 아스코르브산 및 시트르산은 페이퍼 표면 상에서 건조하고 저장할 때, 특히 물 단독으로 전처리하는 것에 비하여 기질 무결성을 유지하는데 도움이 될 수 있다. 그러나, 수크로스 단백질 완충액 내의 하나 이상의 성분은 장기 보관 및 재구성을 위한 기질 생존 능력에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
실시예 22
퓨리마진 활성 및 안정성에 대한 스폿 저장, 분리 또는 대량 저장
특정 저장 절차의 효과는 전술한 바와 같이 Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 제조된 페이퍼 스폿 상에서 테스트하였다. 각각의 스폿을 물로 전처리한 다음, 35℃에서 1시간 동안 건조하였다. 퓨리마진의 200 μM 스톡을 에탄올 중에서 제조한 다음, 5 μL의 이 용액을 각각의 스폿에 첨가하였다. 이어서, 스폿을 35℃에서 추가로 30 내지 60분 동안 건조하였다. 이어서, 이들 스폿을 분리하고, 25℃에서 최대 12일 동안 어두운 곳에서 캡이 달린 튜브에 개별적으로 또는 하나의 바이알(대량 보관)에 함께 저장하였다. 테스트시, 각각의 조건에 해당하는 스폿을 표준 96-웰 플레이트의 웰에 넣고, 각각의 웰에서 100 μL PBS 용액, pH 7.0 및 2 ng/mL Nluc로 재수화하여 용액 중 10 μM 퓨리마진의 최종 농도를 얻었다. 이러한 실험의 결과는 도 40에 설명되어 있다.
개별적으로 저장된 스폿은 대량으로 저장된 스폿보다 더 높은 최대 RLU를 나타내었다(도 41A). 이러한 결과는 관찰된 활성 백분율과 일치한다(도 41B). 이러한 결과는 저장 방법이 전체 기질 성능에 영향을 미칠 수도 있음을 시사한다. 개별 용기에 저장하면 테스트를 위해 하나의 스폿을 꺼낼 때마다 이러한 환경 요인에 노출되는 벌크로 저장된 스폿에 비하여 빛, 공기 및 습기와 같은 유해 요인에 대한 환경 노출을 제한하는데 도움이 될 수 있다.
실시예 23
반응 웰로부터 스폿을 제거한 후의 신호 발생
실시예 6에 기술된 바와 같이, Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 스폿을 제조하였다. 각각의 스폿을 수크로스 단백질 완충액(20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 10% w/v 수크로스) 또는 물로 전처리하고, 35℃에서 1시간 동안 건조하였다. 퓨리마진의 200 μM 스톡을 에탄올 중에서 또는 200 μM 시트레이트 또는 200 μM 아스코르베이트와 함께 에탄올 용액 중에서 제조하였다. 시트르레이트 또는 아스코르베이트를 동일한 몰 농도로 함유하는 5 μL의 퓨리마진 또는 퓨리마진 용액을 각각의 스폿에 첨가하였다. 이어서, 스폿을 35℃에서 추가로 1시간 동안 건조하였다. 이어서, 스폿을 25℃에서 최대 5일 동안 어두운 곳에 저장하였다.
테스트시, 스폿은 2 ng/mL Nluc 효소를 함유하는 PBS, pH 7.0으로 재구성하였으며 RLU는 동역학적으로 판독하였다. 45분 후, 스폿을 웰에서 물리적으로 제거하고 새로운 PBS 용액, pH 7.0 및 2 ng/mL Nluc를 함유하는 새로운 웰에 배치하고, 이전에 스폿을 함유하였던 웰 및 옮겨진 페이퍼 스폿을 함유하는 새로운 웰 상에서 동력학적 RLU 신호를 계속 판독하였다. 도 42A는 이전에 스폿을 포함했던 웰과 스폿이 이전된 새로운 웰(기질 제형화 후에 +로 표시됨)의 동력학적 RLU 값을 표시한다. 요약 RLU 결과는 45분에 원래 판독된 RLU로부터의 RLU 결과, 제거 직후 현재 비어있는 웰, 그리고 스폿을 새로운 효소를 포함하는 새로운 웰로 이동한 직후에 취한 RLU 값을 비교하여 도 42B에 나타나 있다. 기질이 페이퍼 매트릭스에서 방출되어 주변 용액내에서 평형을 이루고 있음을 나타내는 스폿이 제거된 웰로 판독된 원래 스폿에서 RLU 값에 변화가 없었다. 페이퍼 매트릭스 자체 내에서 기질 제형의 일부 유지를 나타내는 이동된 스폿을 포함하는 웰내에서 더 약한 신호가 복원된다. 웰에서 스폿이 웰 밖으로 이동하기 전에 존재했던 RLU 신호를 스폿이 제거되거나 새로운 웰에 배치된 후에 잔류하는 신호와 비교함으로써 각각의 조건에 대해 신호 복원 백분율을 계산하였다(도 42C). 스폿이 새로운 PBS 용액, pH 7.0 및 2 ng/mL Nluc를 포함하는 새로운 웰로 이동한 후, 신호 백분율의 약 절반이 새로운 웰에서 관찰되었다. 이는 잔여 기질이 페이퍼 자체에 남아있는 반면, 대부분의 기질은 원래 웰의 용액으로 방출되었음을 나타낸다.
실시예 24
퓨리마진 활성 및 안정성에 대한 BSA 및 사카라이드의 효과
BSA 및 사카라이드 성분이 고체 표면 상에서 건조되고 재구성된 후 퓨리마진 활성 및 안정성에 영향을 미치는지 확인하기 위해 10 가지 상이한 버전의 단백질 로딩 완충액을 제조하였다. 제조 및 테스트된 완충액은 다음과 같다:
1. 단백질 완충액 1: 20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 10% w/v 수크로스
2. 단백질 완충액 2: 20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 10% w/v 수크로스, 5 mM 아스코르베이트
3. 단백질 완충액 3: 20 mM Na3PO4, 0.25% v/v Tween20, 10% w/v 수크로스
4. 단백질 완충액 4: 20 mM Na3PO4, 0.25% v/v Tween20, 10% w/v 수크로스, 5 mM 아스코르베이트
5. 단백질 완충액 5: 20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20
6. 단백질 완충액 6: 20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 5 mM 아스코르베이트
7. 단백질 완충액 7: 20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 2.5% 풀루란
8. 단백질 완충액 8: 20 mM Na3PO4, 5% w/v BSA, 0.25% v/v Tween20, 2.5% 풀루란, 5 mM 아스코르베이트
9. 단백질 완충액 9: 20 mM Na3PO4, 0.25% v/v Tween20, 2.5% 풀루란
10. 단백질 완충액 10: 20 mM Na3PO4, 0.25% v/v Tween20, 2.5% 풀루란, 5 mM 아스코르베이트
각 완충액의 pH를 측정하였으며, 하기 표 2에 나열되어 있다.
완충액 pH
1 9.93
2 9.04
3 11.11
4 10.53
5 11.69
6 9.00
7 9.89
8 9.00
9 11.45
10 10.45
실시예 6에 기술된 바와 같이, Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 스폿을 제조하였다. 각 스폿을 완충액 1-10으로 처리한 다음 35℃에서 1 시간 동안 건조하였다. 퓨리마진의 200 μM 스톡을 에탄올 중에서 제조한 다음, 5 μL의 이 용액을 각각의 스폿에 첨가하였다. 이어서, 스폿을 35℃에서 추가로 1시간 동안 건조하였다. 테스트시, 각각의 조건에 해당하는 스폿을 표준 96-웰 플레이트의 웰에 넣고, 각각의 웰에서 100 μL PBS 용액, pH 7.0 및 2 ng/mL Nluc로 재수화하여 용액 중 10 μM 퓨리마진의 최종 농도를 얻었다. RLU를 판독하고 새롭게 제조된 시판되고 있는 퓨리마진 기질(Nano-Glo® 생세포 기질, Promega cat. #N205)과 비교하였다.
이러한 결과는 도 43에 설명되어 있다. BSA를 제거하면 신호가 약간 감소했으며, 이는 아스코르베이트의 존재하에 반환되었다(완충액 3 및 완충액 4, 도 43A). 그러나 수크로스 성분이 제거되었을 때 신호의 상당한 감소가 관찰되었다(완충액 5 및 완충액 6). 이 신호는 아스코르베이트가 있거나 수크로스 성분이 2.5% w/v 풀루란(완충액 7 및 완충액 8)으로 대체된 경우 반환되지 않았다. BSA도 수크로스도 로딩 완충액에 존재하지 않을 때 가장 낮은 신호가 관찰되었다.
동역학적 결과는 도 43B에 나타나 있다. 수크로스, BSA 또는 둘 다 없는 조건에서는 실험 과정에서 신호가 급격히 감소했으며 다른 조건에서는 관찰되지 않았다. 아스코르베이트의 존재는 이러한 조건(완충액 3 대 완충액 4, 완충액 5 대 완충액 6 또는 완충액 9 대 완충액 10)에서 신호 감쇠 속도를 제한하였다. 이러한 차이는 퍼센트 활성의 뚜렷한 변화에 해당한다(도 43C). 완충액 3, 5 및 9는 용액 동력학적 RLU 판독에서 더 나빠졌다. 이러한 완충액은 또한 가장 높은 pH 값(표 2)을 보였으며 이는 pH가 Whatman® 903 페이퍼에서 기질 성능에 역할을 할 수 있음을 나타내었다.
실시예 25
퓨리마진 활성 및 안정성에 대한 개별 완충액 성분의 효과
특정 완충액 성분이 고체 페이퍼 표면에 저장하는 동안 퓨리마진 활성 및 안정성에 영향을 미치는지 확인하기 위해 8 가지 다른 단백질 로딩 완충액을 제조하였다. 제조 및 테스트된 완충액은 다음과 같다:
1. 완충액 1 : 물
2. 완충액 2 : 물 + 5mM 아스코르베이트
3. 완충액 3 : BSA
4. 완충액 4 : BSA + 5mM 아스코르베이트
5. 완충액 5 : Na3PO4 + 트윈 20
6. 완충액 6 : Na3PO4 + Tween 20 + 5mM 아스코르베이트
7. 완충액 7 : BSA + Na3PO4 + Tween 20
8. 완충액 8 : BSA + Na3PO4 + Tween 20 + 5mM 아스코르베이트
모든 완충액의 pH는 페이퍼 스폿에 첨가되기 전에 7로 고정되었다.
실시예 6에 기술된 바와 같이, Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 스폿을 제조하였다. 각각의 스폿을 완충액 1-8로 전처리한 다음, 35℃에서 1시간 동안 건조하였다. 퓨리마진의 200 μM 스톡을 에탄올 중에서 제조한 다음, 5 μL의 이 용액을 각각의 스폿에 첨가하였다. 이어서, 스폿을 35℃에서 추가로 1시간 동안 건조하였다. 테스트시, 각각의 조건에 해당하는 스폿을 표준 96-웰 플레이트의 별개의 웰에 넣고, 각각의 웰에서 100 μL PBS 용액, pH 7.0 및 2 ng/mL Nluc로 재수화하여 용액 중 10 μM 퓨리마진의 최종 농도를 얻었다. RLU를 판독하고 새롭게 제조된 시판되고 있는 퓨리마진 기질(Nano-Glo® 생세포 기질, Promega cat. #N205)과 비교하였다.
이러한 결과는 도 44에 나타나 있다. 아스코르베이트, BSA 또는 이 둘의 조합을 포함하는 완충액으로 전처리된 스폿은 암실에서 25℃에서 저장하면서 8일 동안 우수한 안정성을 나타내었다(도 44A). BSA 또는 아스코르베이트가 없고 염도가 높은 Tween 20이 포함된 조건은 원시 신호의 상당한 손실을 보여주었다. 또한 처음 며칠 동안 퍼센트 활성이 눈에 띄게 감소하였다(도 44B). 이러한 결과는 Tween 20 및/또는 고 염의 존재가 전체 RLU 출력의 감소로 볼 수 있듯이 건조 및 고체 표면에 저장되는 동안 기질 무결성에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 아스코르브산의 존재는 이러한 효과를 막는데 도움이 된다. 0 일째의 대표적인 동적 트레이스는 도 44C에 표시된다. 신호 손실률은 단백질 완충액(완충액 1 또는 완충액 2)의 성분이 결여된 조건에서 더 크다.
실시예 26
퓨리마진 활성 및 안정성에 대한 Prionex의 효과
BSA를 Prionex로 대체하는 것이 고체 표면에 저장하는 동안 퓨리마진 활성 및 안정성에 영향을 미치는지 확인하기 위해 6 가지 다른 단백질 로딩 완충액을 제조하였다. 테스트된 완충액은 다음과 같다:
1. 완충액 1: 물
2. 완충액 2: 물 + 5 mM 아스코르베이트
3. 완충액 3: 1% v/v Prionex
4. 완충액 4: 1% v/v Prionex + 5 mM 아스코르베이트
5. 완충액 5: 0.5% v/v Prionex
6. 완충액 6: 0.5% v/v Prionex + 5 mM 아스코르베이트
각 완충액의 pH는 pH 7로 유지하였다.
실시예 6에 기술된 바와 같이, Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 스폿을 제조하였다. 각각의 완충액을 완충액 1-6으로 전처리한 다음, 35℃에서 1시간 동안 건조하였다. 퓨리마진의 200 μM 스톡을 에탄올 중에서 제조한 다음, 5 μL의 이 용액을 각각의 스폿에 첨가하였다. 이어서, 스폿을 35℃에서 추가로 30분 동안 건조하였다. 이어서, 스폿을 25℃에서 최대 20일 동안 어두운 곳에 저장하였다. 테스트시, 각각의 조건에 해당하는 스폿을 표준 96-웰 플레이트의 별개의 웰에 넣고, 각각의 웰에서 100 μL PBS 용액, pH 7.0 및 2 ng/mL Nluc로 재수화하여 용액 중 10 μM 퓨리마진의 최종 농도를 얻었다. RLU를 판독하고 새롭게 제조된 시판되고 있는 퓨리마진 기질(Nano-Glo® 생세포 기질, Promega cat. #N205)과 비교하였다. 이러한 결과는 도 44에 설명되어 있다.
모든 경우에 실험 과정에서 높은 수준의 RLU 출력이 관찰되었다. 단지 물로 전처리된 조건만 3 주에 걸쳐 약간의 신호 손실을 나타내었다(도 45A). 테스트 첫날의 동력학적 데이터는 도 45B에 나타나 있다. Prionex의 존재는 재구성된 신호를 안정화하는데 도움이되며 Prionex가 없는 조건에 비해 신호 감쇠를 제한한다.
실시예 27
제형화된 퓨리마진 활성 및 안정성에 대한 ATT의 효과
ATT의 존재가 페이퍼 표면에 저장하는 동안 퓨리마진 활성 및 안정성에 영향을 미치는지 확인하기 위해 6 가지 다른 단백질 로딩 완충액을 제조하였다. 제조 및 테스트된 로딩 완충액은 다음과 같다:
1. 물 + 5mM 아스코르베이트
2. 물 + 5mM 아스코르베이트 + 5mM ATT
3. 1 % Prionex + 5mM 아스코르베이트
4. 1 % Prionex + 5mM 아스코르베이트 + 5mM ATT
5. 0.5 % Prionex + 5mM 아스코르베이트
6. 0.5 % Prionex + 5mM 아스코르베이트 + 5mM ATT
각 완충액의 pH는 pH 7로 조정하였다.
실시예 6에 기술된 바와 같이, Whatman® 903 단백질 세이버 카드로부터 스폿을 제조하였다. 각각의 완충액을 완충액 1-6으로 전처리한 다음, 35℃에서 1시간 동안 건조하였다. 퓨리마진의 200 μM 스톡을 에탄올 중에서 제조한 다음, 5 μL의 이 용액을 각각의 스폿에 첨가하였다. 이어서, 스폿을 35℃에서 추가로 1시간 동안 건조하였다. 이어서, 스폿을 25℃에서 최대 23일 동안 어두운 곳에 저장하였다. 테스트시, 각각의 조건에 해당하는 스폿을 표준 96-웰 플레이트의 별개의 웰에 넣고, 각각의 웰에서 100 μL PBS 용액, pH 7.0 및 2 ng/mL Nluc로 재수화하여 용액 중 10 μM 퓨리마진의 최종 농도를 얻었다. RLU를 판독하고 새롭게 제조된 시판되고 있는 퓨리마진 기질(Nano-Glo® 생세포 기질, Promega cat. #N205)과 비교하였다. 이러한 결과는 도 45에 설명되어 있다.
모든 경우에서 높은 RLU 출력이 관찰되었다(도 46A). 22 일 저장 후 스폿의 동적 트레이스도 또한 실험 과정에서 높고 안정적인 신호를 나타낸다(도 46B). 현재의 모든 조건은 주변 온도에서 고체 표면의 기질 활성 및 저장 안정성에 유리하다.
실시예 28
마이크로타이터 플레이트로 직접 동결 건조된 제형화된 퓨리마진
퓨리마진을 제조하여 마이크로타이터 플레이트 웰 내에서 직접 동결 건조하였다. 5% (w/v) 풀루란에 200μM 또는 2mM 퓨리마진의 동결 건조 분말 제제를 포함하는 웰을 제조하여 표준 96 웰 마이크로타이터 플레이트(Costar cat # 3912)의 웰 내에서 직접 제조하였다. 이러한 포맷의 대표적인 이미지는 도 47A에 나타나 있다. 플레이트를 다음과 같이 제조하였다: 에탄올 중의 2 mM 및 200 μM 퓨리마진 스톡을 제조하였다(용액 1). 별도로, 5% w/v 풀루란의 용액을 물 중에서 제조하였다(용액 2). 45 μL의 용액 2를 개별 웰에 첨가하였다. 이어서, 5 μL의 용액 1을 용액 2를 함유하는 각각의 웰에 첨가하고 피펫팅하여 완전히 혼합하였다. 5 μL의 순수한 에탄올을 음성 대조군으로 용액 2에 첨가하였다. 플레이트를 드라이아이스에 놓고 1 시간 동안 동결시킨 다음 밤새 동결 건조하였다.
퓨리마진 케이크를 함유하는 플레이트를 각각 10 μM 또는 100 μM 퓨리마진의 최종 농도를 위해 각 웰에서 100 μL PBS, pH 7.0 및 2 ng/mL Nluc로 재수화시켰다. RLU를 판독하고 5% w/v 풀루란의 존재하에 새로 제조된 시판되고 있는 퓨리마진 기질(Nano-Glo® 생세포 기질, Promega cat. #N205) 또는 새로운 Nano-Glo® 생세포 기질과 비교하였다. 동적 데이터는 도 47B에 나타나 있다. 본 실시예는 동결 건조된 분말 제형 형식이 마이크로타이터 플레이트와 같은 고체 표면에서 직접 제조될 수 있고 PBS와 같은 수성 완충액을 사용하여 재구성될 수 있음을 나타낸다.
실시예 29
기질 첨가를 위한 레이어링 포맷
도 48은 개별 페이퍼 카드에 별도의 표면 구성 요소를 포함하거나 기판 또는 감지 구성 요소를 각각 포함하는 동일한 표면의 별도로 처리된 구성 요소를 포함하는 두 부분으로 구성된 레이어링 시스템의 예를 나타낸다. 사용시 표면의 양면이 서로 접혀져서 각 표면이 서로 밀착되어 유지된다. 이어서, 관심있는 분석물을 포함하는 샘플 용액이 접혀진 표면 물질에 첨가된다. 용액의 존재는 다양한 성분이 고체 매트릭스 내에서 재수화되고 혼합되도록하여 생물 발광 복합체의 보완적 유도 형성을 초래할 것이다. 이러한 프로세스는 기질과 조합되어 감지 및 분석할 수 있는 광을 생성할 것이다.
실시예 30
기질 제형에 대한 나트륨 아스코르베이트의 효과
Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질(Promega Cat. # N113) 1 부피를 0 내지 300mM 범위의 농도에서 나트륨 아스코르베이트를 함유하는 50 부피의 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 완충액(Promega Cat. # N112)와 조합하였다. 용액을 여러 시점에서 분석하기 전에 37℃에서 배양하였다. 제조업체의 지침에 따라 사용된 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질(실험 과정 동안 -20℃에 저장되고 각 시점에 대해 재구성됨)이 양성 대조군으로 사용되었다. NanoLuc® 효소를 발현하는 세포 배양물을 각 시점에 대한 샘플로 사용하였다. 재구성된 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 완충액 1 부피를 샘플 1 부피와 혼합하였다. 3분 후 Bio-Tek Synergy® H1 96 웰 플레이트 판독기로 발광 강도를 측정하였다. 각 샘플에 대해 발광 강도를 백그라운드에서 빼고 -20℃ 제어 신호로 정규화하였다.
도 49에 나타나 있는 바와 같이, Nano-Glo® 루시페라아제 분석 완충액에 나트륨 아스코르베이트를 첨가하면 재구성 후 시약 활성의 손실이 감소한다. 기질이 300 mM 나트륨 아스코르베이트를 포함하는 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 완충액에서 재구성되고 37℃에서 유지되는 경우 23 시간 동안 발광 강도는 나트륨 아스코르베이트가 없을 때의 38%에 비해 대조군은 66%이다. 37℃에서 41 시간 후, 발광 강도는 9%에 비해 31%이다. 안정화 효과는 나트륨 아스코르베이트의 양이 감소함에 따라 감소한다. 3mM 나트륨 아스코르베이트를 포함하는 완충액 조건의 결과는 실험 오류로 인한 것일 가능성이 가장 높다.
실시예 31
기질 제형에 대한 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린의 효과
200mM MES pH 6.0, 200mM 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린(HP-β-CD) 및 600mM 나트륨 아스코르베이트를 함유하는 완충액에서 스톡을 1:25를 희석하여 4x 퓨리마진 용액을 제조하였다. 용액을 Virtis Advantage Pro® 동결 건조기를 사용하여 48시간 동안 동결 건조하였다. 이어서, 이러한 동결 건조된 제제는 실험 기간 동안 승온(37℃)에서 저장하였다. 24 시간 및 48 시간 후, 펠렛을 용액 내 성분의 최종 농도가 2x 퓨리마진(스톡에서 1:50 희석), 100mM MES pH 6.0, 100mM HP-β-CD 및 300 mM 나트륨 아스코르베이트가 되도록 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 완충액에서 재구성하였다. 비교를 위해 Nano-Glo® 기질을 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 완충액에서 제조하고 실험 기간 동안 37℃에서 배양하였다. 제조업체의 지침에 따라 사용된 Nano-Glo® 기질(실험 과정 동안 -20℃에 저장되고 각 시점에 대해 재구성됨)이 양성 대조군으로 사용되었다. 각각의 경우에, 재구성된 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질 1 부피를 샘플 1 부피와 혼합하였다. 3분 후 Bio-Tek Synergy H1 96 웰 플레이트 판독기로 발광 강도를 측정하였다. NanoLuc를 발현하는 세포 배양물을 샘플로 사용하였다. 각 샘플에 대해 발광 강도를 백그라운드에서 빼고 -20℃ 제어 신호로 정규화하였다.
도 50에 나타나 있는 바와 같이, 동결 건조 전에 HP-β-CD 및 나트륨 아스코르베이트를 완충액에 첨가하면 펠렛이 Nano-Glo® 완충액에 직접 용해되고 (용매 추가없이) 37 °에서 48 시간 동안 안정적으로 유지될 수 있다. 37℃에서 배양된 Nano-Glo® Luciferase Assay Buffer에서 작업 농도 Nano-Glo® 기질의 동결 건조되지 않은 용액은 동일한 시간 후에 활성이 90% 감소한 것으로 나타났다. 또한 펠릿을 표준 키트 준비와 비교할 때 일부 신호 향상이 관찰되었다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
실시예 32
기질 제형에 대한 개별 및 결합된 완충 첨가제의 효과
퓨리마진을 다음과 같은 최종 조성을 갖는 완충액으로 1:50으로 희석하였다:
-Nano-Glo® 완충액
-Nano-Glo® 완충액 + 300mM 나트륨 아스코르베이트
-Nano-Glo® 완충액 + 100mM 하이드록시프로필-β-시클로 덱스트린 (HP-β-CD)
-Nano-Glo® 완충액 + 300mM 나트륨 아스코르베이트 + 100mM HP-β-CD
NanoLuc를 발현하는 세포 배양액 1 부피를 각 완충액 1 부피에 첨가하고 혼합하였다. 3분 후, 표준 플레이트 판독기로 발광 강도를 측정하였다. 동일한 절차에 따라, 세포 배양 배지 1 부피를 각 완충액과 혼합하여 백그라운드 강도를 측정하였다.
이러한 실험 결과는 HP-β-CD가 신호 향상의 주요 원인임을 시사한다. 도 51A에 나타나 있는 바와 같이, HP-β-CD는 Nano-Glo® 완충액만 사용하는 용액에 비해 신호를 15 내지 20% 향상시킨다. 리포터 효소가 없을 때의 백그라운드 신호 (도 51B)는 신호의 증가가 배경 신호의 증가로 인한 것이 아님을 나타낸다.
실시예 33
기질 안정성에 대한 혼합 중합체 기질 제형의 효과
Nano-Glo® 기질(1:50 희석)의 제제를 MES, 200mM HP-β-CD, 600mM 나트륨 아스코르베이트 및 10 % w / v 풀루란을 함유하는 pH 6.0 용액에서 동결 건조하였다. 동결 건조 후, 바이알을 손으로 뚜껑을 닫았다 (진공 상태가 아님). 일부 바이알은 37℃ 인큐베이터에 보관하고 다른 바이알은 실온에서 실험실 벤치에 두었다. 각 측정 전에 바이알을 원래 부피의 두 배로 재수화하여 각 성분의 최종 농도가 100mM HP-β-CD, 300mM 아스코르베이트 나트륨 및 5% 풀루란이 되도록 하였다. 제조업체의 지침에 따라 사용된 Nano-Glo® 기질(실험 과정 동안 -20℃에 저장되고 각 시점에 대해 재구성됨)이 양성 대조군으로 사용되었다. 각각의 경우에, 재구성된 Nano-Glo® 루시페라아제 분석 기질 1 부피를 샘플 1 부피와 혼합하였다. 3분 후 Bio-Tek Synergy H1 96 웰 플레이트 판독기로 발광 강도를 측정하였다. NanoLuc를 발현하는 세포 배양물을 샘플로 사용하였다. 각 샘플에 대해 발광 강도를 백그라운드에서 빼고 -20℃ 제어 신호로 정규화하였다.
도 52에 나타나 있는 바와 같이, 동결 건조된 제제에 풀루란이 존재하면 기질이 실온 및 37℃에서 저장할 때 15일 동안 활성을 유지할 수 있다. 풀루란의 첨가는 산소와 수분에 대한 장벽을 제공하는 것으로 생각되며, 앞서 설명한 첨가제와 결합하면 몇 주에서 몇 달에 걸쳐 퓨리마진의 활성을 유지할 수 있는 잠재적인 안정화 매트릭스를 제공한다. 불활성 가스와 조합될 때 이러한 저장 방법은 이러한 기질에 대해 믿을 수 없을 정도로 긴 안정성을 달성할 수 있는 가능성을 보여줍니다.
실시예 34
Pluronic® F-127로 제형화된 JRW-0238
2.5 mg의 Pluronic® F-127 (Sigma Aldrich)을 5 mL 스냅-탑 Eppendorf 튜브에 모았다. 중합체는 용융되어 투명한 용액이 될때까지 수조에서 70℃로 가열하였다. 코엘렌테라진 유사체, JRW-0238의 174 mM 스톡 용액을 EtOH에서 제조하였다. 5 μL의 이러한 스톡을 용융된 중합체에 첨가하고 피펫팅하여 혼합하였다. 두 개의 개별 조건을 준비하였다. 조건 1-기질을 첨가한 후, 기질/중합체 용액을 30 분 동안 고진공 하에서 건조하였다. 조건 2-기질을 첨가한 후 기질/중합체 용액을 45μL의 물로 추가 희석하고, 동결시키고, 밤새 동결 건조하였다. 최종 건조 제형화된 기질의 대표적인 예는 도 53.에 도시되어 있다.
조건 1 및 2 모두의 샘플을 물에서 재구성하고 100 μM로 희석하고 HPLC 분석을 통해 화학적 무결성에 대해 분석하였다(도 54). 새로 제조된 기질(EtOH 중 100 μM JRW-0238, 도 54A)에 비하여, 제형화된 기질 조건 중 어느 것도 심각한 화학적 분해를 나타내지 않았다(도 54B 및 도 54C). 피크 정보는 표 3에 요약되어 있다.
샘플 도면 체류 시간(분) 면적 백분율
EtOH 중 JRW-0238 54A 4.3576.977 98.429
1.571
조건 1 54B 4.3626.985 98.374
1.626
조건 2 54C 4.3664.992
5.321
6.969		 97.638
0.372
0.728
1.262
두 조건에서 재구성된 샘플은 어두운 곳에서 주위 온도에 두었다. 24 시간 후, 조건 1에서 제조된 샘플에서 소량의 침전이 관찰되었다. 조건 2에서 제조된 용액은 실험 과정 동안 투명하게 유지되었다. 이러한 일련의 실험은 코엘렌테라진 유사체의 고체 제형이 합성 중합체로 제조될 수 있고 유기 용매 또는 안정제 없이도 수성 매질에서 전체 동적 용해도를 개선할 수 있음을 나타낸다. 그러나 제조 방법은 열역학적 용해도에 영향을 미칠 수 있다. 동결 건조된 조건(조건 2)은 주위 온도에서 24 시간 후에도 여전히 용액 상태였다. 이것은 물에서 재구성 된 후 24 시간 이내에 용액에서 침전이 시작되는 조건 1의 샘플과 대조적이다.
실시예 35
Pluronic® F-127로 제형화된 퓨리마진℃
이 제형은 또한 코엘렌테라진 유사체인 퓨리마진을 위해 제조되었다. 2.5 mg의 Pluronic® F-127 (Sigma Aldrich)을 1.5 mL 스냅-탑 Eppendorf 튜브에 모았다. 중합체는 용융될때까지 수조에서 70℃로 가열하였다. 퓨리마진의 10 mM 스톡 용액을 EtOH에서 제조하였다. 이어서, 5 μL의 이러한 스톡을 용융된 중합체에 첨가하고 피펫팅하여 혼합하였다. 두 개의 개별 조건을 준비하였다. 조건 1-기질을 첨가한 후, 용액을 30 분 동안 진공 하에서 건조하였다. 조건 2-기질을 첨가한 후 기질/중합체 용액을 45μL의 물로 추가 희석하고, 동결시키고, 이어서 밤새 동결 건조하였다.
조건 1 및 2 모두의 샘플을 물에서 재구성하고 100 μM로 희석하고 HPLC 분석을 통해 기질 무결성에 대해 분석하였다(도 55). 새로 제조된 퓨리마진에 비하여(도 55A), 조건 1은 상당한 분해를 나타냈다(도 55B). 이는 이러한 샘플을 재구성하는데 필요한 광범위한 초음파 처리 때문일 수 있다. 이와 대조적으로, 조건 2로부터 재구성된 샘플은 현저한 분해를 나타내지 않았다(도 55C). 피크 정보는 표 4에 요약되어 있다.
샘플 도면 체류 시간(분) 면적 백분율
EtOH 중 퓨리마진 55A 5.0386.109
6.548
7.952		 96.858
0.705
1.407
1.030
조건 1 55B 5.0285.888
6.104
6.268
6.541
7.672
7.768
7.949		 64.807
1.717
8.287
1.881
4.522
0.635
1.828
16.323
조건 2 55C 5.0316.107
6.545
7.957
8.599		 92.677
0.922
1.741
1.346
3.583
이러한 일련의 실험은 퓨리마진을 포함한 코엘렌테라진 유사체의 고체 제형이 합성 중합체로 제조될 수 있고 유기 용매 또는 안정제 없이도 수성 매질에서 전체 동적 용해도를 개선할 수 있음을 나타낸다.
실시예 36
물 중의 제형화된 JRW-0238의 최대 농도
25 mg의 Pluronic® F-127 (Sigma Aldrich)을 1.5 mL 스냅-탑 Eppendorf 튜브에 모았다. 중합체는 용융될때까지 수조에서 70℃로 가열하였다. 3.4 mg의 JRW-0238을 50 μL의 EtOH에 용해시킨 다음 뜨거운 중합체에 첨가하고 파이 펫팅으로 혼합하였다. 추가 50 μL의 EtOH를 사용하여 기질을 세척하고 중합체 용액으로의 이동을 보조하였다. 용매를 가열없이 감압 하에 제거하였다.
4 개의 바이알을 유사한 방식으로 제조하였고, 모든 바이알은 7.3:1 w/w의 중합체 대 기질의 비율을 포함하였다. 아래에 설명된 바와 같이 초기 수성 스톡을 제조하기 위해 상이한 부피의 물이 사용되었다:
바이알 1: 중합체를 기질과 함께 주입한 후, 용액을 500μL 물에 흡수시켰다. 모든 물질을 초음파 처리 후 용액에 넣었다. 샘플을 냉동시키고 밤새 동결 건조하였다. 계산된 기질의 농도는 5% w/v 중합체와 함께 17.4mM 인 것으로 결정되었다.
바이알 2: 중합체를 기질과 함께 주입한 후, 용액을 400μL 물에 흡수시켰다. 모든 물질을 초음파 처리 후 용액에 넣었다. 샘플을 냉동시키고 밤새 동결 건조하였다. 계산된 기질의 농도는 6.25% w/v 중합체와 함께 21.4 mM 인 것으로 결정되었다.
바이알 3: 중합체를 기질과 함께 주입한 후, 용액을 250μL 물에 흡수시켰다. 모든 물질을 초음파 처리 후 용액에 넣었다. 샘플을 냉동시키고 밤새 동결 건조하였다. 계산된 기질의 농도는 10% w/v 중합체와 함께 34.4 mM 인 것으로 결정되었다.
바이알 4: 중합체를 기질과 함께 주입한 후, 용액을 100μL 물에 흡수시켰다. 모든 물질을 초음파 처리 후 용액에 넣었다. 샘플을 냉동시키고 밤새 동결 건조하였다. 계산된 기질의 농도는 25% w/v 중합체와 함께 85.4 mM 인 것으로 결정되었다.
동결 건조 후, 각 샘플은 각각 500 μL, 400 μL, 250 μL 또는 100 μL 물로 재구성되었다. 모든 물질을 각각의 조건에서 용액에 넣었다. 이러한 용액의 대표적인 이미지가 도 56에 나타나 있다. 주위 온도에서 24 시간 후, 재구성된 스톡을 원심 분리하였으며, 침전은 전혀 관찰되지 않았다. 24시간 동안 용액 중에 방치한 후 재구성된 기질의 화학적 무결성을 보여주는 대표적인 HPLC 트레이스가 도 57에 나타나 있다. 심각한 화학적 분해는 전혀 관찰되지 않았다. 피크 정보는 표 5에 요약되어 있다.
체류 시간(분) 면적 백분율
4.354
4.988
6.980
7.944		 96.398
0.810
1.858
0.935
이러한 실험은 고농도의 코엘렌테라진 유사체, JRW-0238을 고체 상태의 중합체로 제형화함으로써 주변 조건 하에서 화학적 무결성에 대한 손실없이 물 중에서 달성될 수 있음을 나타낸다.
실시예 37
관찰 가능한 기질 용해도의 손실이 없는 낮은 중합체/기질 비율
23.8, 20.4, 17, 13.6, 10.2, 및 6.8 mg의 Pluronic® F-127을 1.5 mL 스냅-탑 Eppendorf 튜브에 모았다. 중합체는 용융될때까지 수조에서 70℃로 가열하였다. 23.7 mg의 JRW-0238을 350 μL의 EtOH에 용해시킨 다음, 이 스톡 50 μL를 뜨거운 중합체를 함유하는 각각의 바이알에 첨가하고 피펫팅으로 잘 혼합하였다. 이어서, 바이알을 30분 동안 고진공 하에 두어 모든 유기 용매를 제거하였다. 각각의 바이알을 각각 7x, 6x, 5x, 4x, 3x 또는 2x w/w 중합체/기질을 사용하여 최종 농도가 17.4 mM JRW-0238이 되도록 500 μL의 물로 희석하였다. 각각의 튜브를 냉동시키고 밤새 동결 건조하였다.
테스트시 500μL의 물을 각 바이알에 첨가하고 모든 물질이 용해될 때까지 볼텍싱하였다. 초기 재구성 후, 기질에 대해 2x w/w 중합체를 포함하는 샘플을 제외하고 모든 샘플이 투명하였다(도 58A). 이 샘플만으로는 약간 흐릿한 것으로 관찰되었다. 실온에서 용액에서 1 시간 후, 재구성된 기질은 기질에 대해 2x w/w 중합체를 포함하는 샘플을 제외하고는 여전히 용액에 있는 것으로 관찰되었다(도 58B).
실시예 38
전체 동물 이미징에 사용하기 위한 고체 제형
마우스 모델에서 전체 동물 이미징을 위해, 고체 제형화된 JRW-0238의 스톡 샘플을 다음과 같이 제조하였다: 90mg의 Pluronic® F-127을 유리 스크류 캡 바이알에 모았다. 이어서, 중합체를 용융될 때까지 수조에서 70℃로 가열 하였다(투명한 용액이 됨). 12.5 mg의 JRW-0238을 250 μL의 EtOH에 용해시키고 뜨거운 중합체에 첨가한 다음 얇은 주걱으로 잘 혼합하였다.이어서, 용매를 감압하에 제거하였다. 이 농축된 샘플을 물 3.646ml로 희석하여 물 중 8.7mM 기질의 마스터 스톡을 제조하였다. 480 μL의이 수성 스톡을 1.5 mL 스크류 캡 바이알에 분취하고 냉동하고 밤새 동결 건조하였다. 이러한 제형의 대표적인 이미지가 도 59A에 도시되어 있다. 테스트시, 480 μL의 물을 바이알에 첨가하고 모든 물질이 용해 될 때까지 약 15초 동안 볼텍싱하였다(도 59B).
안타레스(Antares) 단백질 구조(미국 특허 제 9,908,918 호 참조), NanoLuc 및 청록색 흥분성 주황색-적색 형광 단백질 (CyOFP)의 융합을 발현하도록 조작된 트랜스제닉 마우스 피험자(평균 연령: 6 개월)를 이소플루란 및 복강내 주사(IP) 또는 피하 주사(SC)를 통해 재구성된 기질 용액 480 μL을 주입하였다. 이어서, Ami 이미징 시스템을 사용하여 주사 후 매분마다 각 마우스를 이미지화하였다. 도 60A는 JRW-0238을 I.P 주사한 5 마리 동물의 평균 RLU의 트레이스를 나타낸다. 도 60B는 광 출력이 최대로 측정되었을 때 각 마우스의 대표적인 이미지이다. 도 61A는 재구성된 JRW-0238을 S.C. 주사한 5 마리 동물의 평균 RLU의 트레이스를 나타낸다. 도 61B는 광 출력이 최대로 측정되었을 때 각 마우스 피험자의 대표적인 이미지를 나타낸다. 또한, 이러한 결과는 건조 제형으로 제조되고 사용시 물 중에서 재구성되고 I.P 또는 S.C. 주입 경로를 통해 살아있는 동물 피험자에게 주입된 코엘렌테라진 유사체로 생체 내 이미징이 달성 될 수 있음을 나타낸다.
전술한 상세한 설명 및 첨부된 실시예는 단지 예시일 뿐이며 첨부된 청구범위 및 그 균등물에 의해서만 정의되는 본 개시의 범위에 대한 제한으로 간주되어서는 안된다는 것으로 이해된다.
개시된 실시형태에 대한 다양한 변경 및 변형은 당업자에게 명백할 것이다. 본 개시내용의 화학 구조, 치환체, 유도체, 중간체, 합성물, 조성물, 제형 또는 사용 방법과 관련된 것들을 제한없이 포함하는 이러한 변경 및 변형은 그의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서 이루어질 수 있다.
실시예 39
중합체 퓨리마진 제형의 대규모 제조
건조 퓨리마진 제형은 더 큰 부피로 확장되었고 이러한 조성물이 제조 조건 하에서 제조될 수 있는 것으로 입증되었다. 케이크 중의 퓨리마진의 농도는 200 uM이다. 케이크는 10 mL의 스톡 부피로 재구성되어 2x 스톡(20 uM)의 퓨리마진을 제공할 수 있다. 이어서, 이것은 10uM의 최종 농도를 위해 샘플과 1:1로 희석될 수 있다.
벌크 용액을 제조하기 위해, 50mL의 milli-Q 정제수를 1.25g 풀루란, 35.7mg ATT 및 44mg 아스코르베이트에 첨가하고, 모든 고체가 용해될 때까지 혼합하였다. 최종 용액은 각각 5mM ATT 및 5mM 아스코르베이트와 함께 2.5% w/v 풀루란을 함유한다.
29.4 mL의 풀루란 용액은 50 mL 플라스틱 바이알로 측정하였다. EtOH 중 10mM 스톡으로 제조된 600μL의 퓨리마진을 첨가하고 잘 혼합하였다. 용액에서 소량의 얇은 바늘 모양의 침전물이 관찰되었다. 이 침전물은 용액에서 EtOH와 상호 작용하는 풀루란 중합체 때문일 가능성이 크다. 이것은 제조의 성공이나 최종 물질의 특성에 영향을 미치지 않았다.
10 mL 유리 앰버 바이알이 사용되었다. 1 mL의 퓨리마진-풀루란 스톡 용액을 10mL 앰버 유리 바이알에 분취하고 고무 마개를 바이알에 부분적으로 삽입하였다.
사용된 동결 건조기(Virtis Genesis 12EL 동결 건조기)는 4 ft2의 선반 표면과 총 3개의 선반을 가지고 있다. 냉동 시스템은 2 개의 2 단계 압축기로 구성된다. 진공/압력 제어는 진공 펌프의 흡입력 균형을 맞추고 지정된 설정점에서 압력을 유지하기 위해 동결 건조기 챔버로 질소를 배출하는 조절 밸브와 단일 진공 펌프를 통해 달성된다. 선반은 유압 피스톤을 통해 압축할 수 있다. 수동으로 분배된 제품의 (14 가지 서로 다른 제형의 조합을 포함하는) 178 x 10 바이알이 들어있는 작은 트레이 하나를 + 4.7℃의 온도에서 유지되는 동결 건조기의 단일 선반에 로드하였다. 이어서, 제품은 2시간 동안 -50℃의 선반 온도를 갖는 동결 단계를 거친 후 응축기 단계가 시작되었다. 실행 중 응축기 온도는 -5℃에서 -87℃ 사이였다. 다음으로 진공으로 내려 가고 75 및 200 mToor의 압력 설정점에서 실행되었다. 이 두 압력 설정점 모두에서 실행 내내 우수하게 제어되는 것으로 표시되었다. 동결 건조 레시피/사이클의 모든 단계는 프로그래밍 된대로 실행되었다. 제품 프로브 평균 온도를 기준으로 승화는 약 7.5 시간, 탈착은 약 16.1 시간 지속되었다. 실행이 끝나면 바이알을 질소로 다시 채우고 약 600 Torr 압력(대기압은 약 740 Torr이다)에서 삽입된 마개로 완전히 밀봉하였다.
동결 건조 후, 20x 퓨리마진이 포함된 lyo-cake가 들어있는 각 유리 바이알에 질소 가스를 투여하여 바이알 헤드 스페이스를 채우고 캡을 완전히 밀봉하고 바이알을 각각 25℃ 또는 60℃에서 보관하였다. 동결 건조 후 다양한 시점에서, 제형화 된 퓨리마진을 0.01% BSA를 함유하는 10ml의 PBS, pH 7.0으로 재구성하고 바이알을 수동으로 흔들고 실온에서 5분 동안 평형화하였다. 50ul의 제형화된 퓨리마진 스톡 용액을 0.01% BSA(최종 [Nluc] = 0.5ng/ml)를 함유하는 PBS, pH 7 중의 1 ng/ml 정제된 NanoLuc® 효소(Nluc)(Promega cat # E499) 50ul에 첨가하였다. 사용된 대조군은 각 시점 데이터 수집에 대해 -20℃에서 새로 샘플링된 NanoGlo® 생세포 기질(Promega Cat # N205)의 10uM 최종 용액이었다. 분석은 고체, 백색, 비 결합 표면(NBS) 플레이트에서 수행되었으며, 전체 발광을 수집하는 발광계(GloMax® Discover Multimode Microplate 판독기-Promega Cat. # GM3000)에서 동역학적 판독을 이용하여 분석하였다.
도 62A는 "0 일" 시점에서 동결 건조된 제형화된 퓨리마진 케이크를 나타내며, 이는 제형 및 동결 건조 프로토콜이 적절하다는 것을 나타내는 외관상의 어떠한 명백한 결함없이 바이알 바닥에 균일한 분포를 갖는 균일한 케이크를 함유하는 바이알을 나타낸다. 도 62B는 전술한 완충액으로 재구성한 후 제형화된 퓨리마진을 사용하여 미가공 RLU로 표현된 NanoLuc® 활성 결과를 나타낸다. 제형화된 퓨리마진은 대조 기질(NanoGlo® 생세포 기질 Promega Cat # N205)과 마찬가지로 수행되었다. 이것은 가속 안정성 연구를 시작하기 위한 기준선이다. 바이알 또는 대조 기질의 일부를 60℃ 또는 25℃에 배치하였다. 새로운 바이알을 다양한 시점에서 재구성하고 정제된 NanoLuc® 효소를 사용하여 활성을 분석하였다. 도 63은, 25℃(파란색 닫힌 원) 또는 60℃(빨간색 사각형)에서 보관된 제형화된 샘플로부터, 25℃(녹색 삼각형) 또는 60℃(주황색 아래쪽 삼각형)에서 보관된 NanoGlo® 생세포 기질로부터, 및 34일 동안 모니터링 된대로 -20℃(검은 색 다이아몬드)에서 유지된 새롭게 제조된 대조군 NanoGlo® 생세포 기질로부터의 원시 RLU를 나타낸다. 0일에 재구성된 바이알을 용액 중에서 유지하고, 실온에서 유지하고, 그리고 활성을 위해 18간에 걸쳐 샘플을 채취하였다(하늘색 열린 원). 데이터는 제형화된 퓨리마진이 테스트된 두 온도에서 테스트된 기간 동안 활성을 유지하고 유기 용매 중에 용해된 퓨리마진보다 개선되었음을 나타낸다. 모든 제형화된 퓨리마진은 고체 퓨리마진의 거동과는 완전히 대조적으로 완충액 첨가 후 5분 이내에 재구성되었다.
도 62 및 63의 결과는 퓨리마진 조성물이 유리 바이알 및 불활성 분위기를 포함하는 보다 엄격한 품질 관리 조건하에 더 큰 규모로 제조될 수 있음을 입증한다. 조성물은 주위 온도 또는 승온에서 장기간 보관할 수 있으며, 유기 용매 또는 특수 완충액 조건없이 중성 완충액에서 재구성할 수 있다. 수성 완충액에서 재구성한 후에도 조성물은 용액 및 주변 조건에서 최대 24 내지 48 시간 동안 저장되는 동안 상당한 성능을 잃지 않으며 최대 18일 동안 일부 활성을 유지한다.
실시예 40
제형화된 JRW-1744의 제조
Figure pct00005
JRW-1744
6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-α]피라진-3(7H)-온
JRW-1744의 제형화된 예는 실시예 34 및 38에서의 JRW-0238과 유사한 방식으로 제조하였다. 고체 제형화된 JRW-1744의 스톡 샘플은 다음과 같이 제조하였다: 77 mg의 Pluronic® F-127(~ 7.2x w/w)을 유리, 스크류 캡 바이알 상에 뭉쳐 놓았다. 이어서, 중합체를 용융될 때까지(투명한 용액이 될 때까지) 수조에서 80℃로 가열 하였다. 10.8 mg의 JRW-1744를 소량의 EtOH에 용해시킨 다음 뜨거운 중합체에 첨가하여 얇은 주걱으로 잘 섞었다. 추가의 EtOH(총 2mL 이하)를 사용하여 모든 기질을 중합체 용액으로 완전히 옮기고 용해시켰다. 이어서, 용매를 감압하에 제거 하였다. 이어서, 이 농축된 샘플을 1 시간 동안 고진공하에 두어 잔류 EtOH를 제거하여 주황색 고체를 수득하였다. 생성된 고체를 3.0 mL의 물에 희석하고 초음파 처리하여 물 중의 8.7 mM JRW-1744의 마스터 스톡을 제조하였다. 생성된 수성 스톡의 480 μL 분취량을 1.5 mL 스크류 캡 바이알로 옮기고 냉동하고 밤새 동결 건조하였다.
실시예 41
제형화된 JRW-1743의 제조
Figure pct00006
JRW-1743
6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-(2-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-α]피라진-3(7H)-온
JRW-1743의 제형화된 예는 실시예 34 및 38에서의 JRW-0238과 유사한 방식으로 제조하였다.
제형화된 JRW-1743의 스톡 샘플은 다음과 같이 제조하였다: 72 mg(7.2x w/w)의 Pluronic® F-127을 유리, 스크류 캡 바이알 상에 뭉쳐 놓았다. 이어서, 중합체를 완전히 용융될 때까지 수조에서 80℃로 가열 하였다(도 64A).
10.0 mg의 고체 JRW-1743을 소량의 EtOH에 용해시킨 다음 얇은 주걱으로 교반하면서 뜨거운 중합체로 옮겼다. 추가의 EtOH(총 2mL 이하)를 사용하여 기질이 중합체 용액으로 이동하는 것을 도와 주었다. 이어서, 용매를 감압하에 제거하여 중합체/기질 혼합물을 주홍색 겔로 농축하였다. 이어서, 이 농축된 샘플을 1 시간 동안 고진공하에 두어 잔류 EtOH를 제거하였다.
Pluronic® F-127에서 제형화된 JRW-1743의 마스터 스톡을 제조하기 위해, 2.6 mL의 물을 겔에 첨가하고, 생성된 용액을 완전히 균질해질 때까지 초음파 처리 하였다(도 64B). 이 부피에서 JRW-1743의 최종 농도는 8.7mM로 계산되었다. 이어서, 이 수성 스톡의 480 μL 분취량을 1.5 mL 스크류 캡 바이알로 옮기고 냉동하고 밤새 동결 건조하여 JRW-1743을 함유하는 동결 건조 케이크를 얻었다(도 64C).
제형화된 JRW-1743을 포함하는 하나의 바이알을 480 uL의 물에서 재구성 하였다 (도 64C 중앙 및 오른쪽). 물에서 기질 농도에 대한 흡광도 측정을 수행하였으며, 이 용액에서 JRW-1743의 작업 농도는 ~ 8.7mM의 이론적 농도에 비해 8.5mM 인 것으로 밝혀졌습니다 (도 65).
[서열목록]
Sequences
SEQ ID NO: 1 - Native Mature Oplophorus luciferase amino acid sequence
FTLADFVGDWQQTAGYNQDQVLEQGGLSSLFQALGVSVTPIQKVVLSGENGLKADIHVIIPYEGLSGFQMGLIEMIFKVVYPVDDHHFKIILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYPGIAVFDGKQITVTGTLWNGNKIYDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCENILA
SEQ ID NO: 2 - Nluc amino acid sequence
MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA
SEQ ID NO: 3 - LgTrip (3546)
MKHHHHHHVFTLDDFVGDWEQTAAYNLDQVLEQGGVSSLLQNLAVSVTPIMRIVRSGENALKIDIHVIIPYEGLSADQMAQIEEVFKVVYPVDDHHFKVILPYGTLVIDGVTPNKLNYFGRPYEGIAVFDGKKITTTGTLWNGNKIIDERLITPD
SEQUENCE LISTING <110> Promega Corporation <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR STABILIZING COELENTERAZINE AND ANALOGS AND DERIVATIVES THEREOF <130> PRMG-35852.601 <150> US 62/805,517 <151> 2019-02-14 <150> US 62/740,622 <151> 2018-10-03 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 169 <212> PRT <213> Oplophorus gracilirostris <400> 1 Phe Thr Leu Ala Asp Phe Val Gly Asp Trp Gln Gln Thr Ala Gly Tyr 1 5 10 15 Asn Gln Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Leu Ser Ser Leu Phe Gln 20 25 30 Ala Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Lys Val Val Leu Ser Gly 35 40 45 Glu Asn Gly Leu Lys Ala Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly 50 55 60 Leu Ser Gly Phe Gln Met Gly Leu Ile Glu Met Ile Phe Lys Val Val 65 70 75 80 Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Ile Ile Leu His Tyr Gly Thr 85 90 95 Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg 100 105 110 Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Gln Ile Thr Val Thr 115 120 125 Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Tyr Asp Glu Arg Leu Ile Asn 130 135 140 Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly 145 150 155 160 Trp Arg Leu Cys Glu Asn Ile Leu Ala 165 <210> 2 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Met Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu 20 25 30 Phe Gln Asn Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu 35 40 45 Ser Gly Glu Asn Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr 50 55 60 Glu Gly Leu Ser Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys 65 70 75 80 Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr 85 90 95 Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe 100 105 110 Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr 115 120 125 Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu 130 135 140 Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val 145 150 155 160 Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala 165 170 <210> 3 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Met Lys His His His His His His Val Phe Thr Leu Asp Asp Phe Val 1 5 10 15 Gly Asp Trp Glu Gln Thr Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu 20 25 30 Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr 35 40 45 Pro Ile Met Arg Ile Val Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp 50 55 60 Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala 65 70 75 80 Gln Ile Glu Glu Val Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His 85 90 95 Phe Lys Val Ile Leu Pro Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr 100 105 110 Pro Asn Lys Leu Asn Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val 115 120 125 Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Thr Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn 130 135 140 Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Thr Pro Asp 145 150 155

Claims (86)

  1. 하기를 포함하는 조성물:
    코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물; 및
    중합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 코엘렌테라진, 코엘렌테라진-h, 코엘렌테라진-h-h, 퓨리마진, JRW-0238, JRW-1743, 및 JRW-1744로부터 선택되는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 퓨리마진인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 자연-발생성 바이오 중합체인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 자연-발생성 바이오 중합체가 풀루란, 트레할로스, 말토스, 셀룰로스, 덱스트란, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 자연-발생성 바이오 중합체가 풀루란인 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 사이클릭 사카라이드 중합체 또는 이의 유도체인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 중합체가 하이드록시프로필 β-사이클로덱스트린인 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 합성 중합체인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 합성 중합체가 폴리스티렌, 폴리(메트)아크릴레이트, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 합성 중합체가 적어도 하나의 폴리(프로필렌 옥사이드) 블록 및 적어도 하나의 폴리(에틸렌 옥사이드) 블록을 포함하는 블록 공중합체인 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 합성 중합체가 폴록사머인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 완충제, 계면활성제, 환원제, 염, 라디칼 소거제, 킬레이트제, 단백질 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조성물이 인산염 완충제, 트리신, 및 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산으로부터 선택되는 완충제를 추가로 포함하는 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 조성물이 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 및 폴리소르베이트 80으로부터 선택되는 계면활성제를 추가로 포함하는 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 티오우레아 및 6-아자-2-티오티민으로부터 선택되는 환원제를 포함하는 조성물.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 염화나트륨 및 인산나트륨으로부터 선택되는 염을 추가로 포함하는 조성물.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 아스코르브산 및 아스코르브산 나트륨으로부터 선택되는 라디칼 소거제를 추가로 포함하는 조성물.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 킬레이트제를 추가로 포함하며, 상기 킬레이트제가 시트르산 및 트랜스-1,2-디아미노사이클로헥산-테트라아세트산으로부터 선택되는 조성물.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 소 혈청 알부민, 젤라틴, 및 돼지 기원의 고도로 정제된 진피 콜라겐의 폴리펩티드 분획으로부터 선택되는 단백질을 추가로 포함하는 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 동결 건조된 분말 또는 케이크의 형태인 조성물.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 가단성(malleable) 필름의 형태인 조성물.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 용액인 조성물.
  24. 하기를 포함하는 조성물:
    코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물; 및
    페이퍼 또는 섬유 매트릭스, 플라스틱, 유리, 또는 금속으로부터 선택되는 표면(surface).
  25. 제24항에 있어서, 상기 화합물이 코엘렌테라진, 코엘렌테라진-h, 코엘렌테라진-h-h, 퓨리마진, JRW-0238, JRW-1743, 및 JRW-1744로부터 선택되는 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 상기 화합물이 퓨리마진인 조성물.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 중합체를 추가로 포함하는 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 중합체가 자연-발생성 바이오 중합체인 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 자연-발생성 바이오 중합체가 풀루란, 트레할로스, 말토스, 셀룰로스, 덱스트란, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 자연-발생성 바이오 중합체가 풀루란인 조성물.
  31. 제27항에 있어서, 상기 중합체가 사이클릭 사카라이드 중합체 또는 이의 유도체인 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 중합체가 하이드록시프로필 β-사이클로덱스트린인 조성물.
  33. 제27항에 있어서, 상기 중합체가 합성 중합체인 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 합성 중합체가 폴리스티렌, 폴리(메트)아크릴레이트, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 조성물.
  35. 제33항에 있어서, 상기 합성 중합체가 적어도 하나의 폴리(프로필렌 옥사이드) 블록 및 적어도 하나의 폴리(에틸렌 옥사이드) 블록을 포함하는 블록 공중합체인 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 합성 중합체가 폴록사머인 조성물.
  37. 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 완충제, 계면활성제, 환원제, 염, 라디칼 소거제, 단백질 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 조성물이 인산염 완충제, 트리신, 및 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산으로부터 선택되는 완충제를 추가로 포함하는 조성물.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 조성물이 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 및 폴리소르베이트 80으로부터 선택되는 계면활성제를 추가로 포함하는 조성물.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 티오우레아 및 6-아자-2-티오티민으로부터 선택되는 환원제를 포함하는 조성물.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 염화나트륨 및 인산나트륨으로부터 선택되는 염을 추가로 포함하는 조성물.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 아스코르브산 및 아스코르브산 나트륨으로부터 선택되는 라디칼 소거제를 추가로 포함하는 조성물.
  43. 제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 킬레이트제를 추가로 포함하며, 상기 킬레이트제가 시트르산 및 트랜스-1,2-디아미노사이클로헥산-테트라아세트산으로부터 선택되는 조성물.
  44. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 소 혈청 알부민, 젤라틴, 및 돼지 기원의 고도로 정제된 진피 콜라겐의 폴리펩티드 분획으로부터 선택되는 단백질을 추가로 포함하는 조성물.
  45. 제24항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면이 셀룰로스 페이퍼, 니트로셀룰로스 페이퍼, 나일론 페이퍼, 코튼지, 폴리에스테르 페이퍼, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 다공성 또는 중합체성 멤브레인, 고순도 코튼 섬유, 코튼/레이온 혼방 고순도 코튼, 및 유리 마이크로 섬유로부터 선택되는 조성물.
  46. 코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물을 안정화시키는 방법으로서, 코엘렌테라진 화합물 또는 이의 유사체 또는 유도체를 유효량의 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉시켜 조성물을 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 화합물이 열적 분해, 화학적 분해, 광-유도 분해, 또는 이들의 임의의 조합에 대해 안정화된 것인 방법
  48. 코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물의 용해도를 개선하는 방법으로서, 상기 코엘렌테라진 화합물 또는 이의 유사체 또는 유도체를 유효량의 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉시켜 조성물을 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 화합물의 용해도가 상기 중합체 및/또는 상기 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉되지 않은 화합물에 비하여 수용액 중에서 개선되는 것인 방법
  50. 코엘렌테라진 및 이의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 화합물의 재구성 속도(reconstitution rate)를 개선하는 방법으로서, 상기 코엘렌테라진 화합물 또는 이의 유사체 또는 유도체를 유효량의 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉시켜 조성물을 형성하는 단계를 포함하며,
    상기 화합물에 대한 재구성 속도가 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉되지 않은 화합물에 비하여 개선되는 것인, 방법.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 코엘렌테라진, 코엘렌테라진-h, 코엘렌테라진-h-h, 퓨리마진, JRW-0238, JRW-1743, 및 JRW-1744로부터 선택되는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 화합물이 퓨리마진인 방법.
  53. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 자연-발생성 바이오 중합체인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 자연-발생성 바이오 중합체가 풀루란, 트레할로스, 말토스, 셀룰로스, 덱스트란, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 자연-발생성 바이오 중합체가 풀루란인 방법.
  56. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 사이클릭 사카라이드 중합체 또는 이의 유도체인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 중합체가 하이드록시프로필 β-사이클로덱스트린인 방법.
  58. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 합성 중합체인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 합성 중합체가 폴리스티렌, 폴리(메트)아크릴레이트, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 방법.
  60. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 중합체가 적어도 하나의 폴리(프로필렌 옥사이드) 블록 및 적어도 하나의 폴리(에틸렌 옥사이드) 블록을 포함하는 블록 공중합체인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 합성 중합체가 폴록사머인 방법.
  62. 제46항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 완충제, 계면활성제, 환원제, 염, 라디칼 소거제, 단백질 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 조성물이 인산염 완충제, 트리신, 및 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산으로부터 선택되는 완충제를 추가로 포함하는 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 조성물이 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 및 폴리소르베이트 80으로부터 선택되는 계면활성제를 추가로 포함하는 방법.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 티오우레아 및 6-아자-2-티오티민으로부터 선택되는 환원제를 포함하는 방법
  66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 염화나트륨 및 인산나트륨으로부터 선택되는 염을 추가로 포함하는 방법
  67. 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 아스코르브산 및 아스코르브산 나트륨으로부터 선택되는 라디칼 소거제를 추가로 포함하는 방법.
  68. 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 킬레이트제를 추가로 포함하며, 상기 킬레이트제가 시트르산 및 트랜스-1,2-디아미노사이클로헥산-테트라아세트산으로부터 선택되는 방법.
  69. 제62항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 소 혈청 알부민, 젤라틴, 및 돼지 기원의 고도로 정제된 진피 콜라겐의 폴리펩티드 분획으로부터 선택되는 단백질을 추가로 포함하는 방법.
  70. 제46항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페이퍼 또는 섬유 매트릭스가 셀룰로스 페이퍼, 니트로셀룰로스 페이퍼, 나일론 페이퍼, 코튼지, 폴리에스테르 페이퍼, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 다공성 또는 중합체성 멤브레인, 고순도 코튼 섬유, 코튼/레이온 혼방 고순도 코튼, 및 유리 마이크로 섬유로부터 선택되는 방법.
  71. 제46항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계는:
    화합물을 유기 용매 중에 용해시켜 제 1 용액을 형성하는 단계;
    상기 제 1 용액을 중합체 및/또는 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; 및
    상기 혼합물을 건조하는 단계.
  72. 제71항에 있어서, 상기 혼합 단계가 상기 중합체를 제 2 용액 중에 용해시키는 단계 및 상기 제 2 용액을 상기 제 1 용액과 혼합하는 단계를 포함하는 방법.
  73. 제71항에 있어서, 상기 혼합 단계가 상기 제 1 용액을 상기 페이퍼 또는 섬유 매트릭스에 적용하는 단계를 포함하는 방법.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조 단계가 동결 건조를 포함하는 방법.
  75. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조 단계가 공기 건조를 포함하는 방법.
  76. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조가 불활성 대기 중 주위 온도에서 수행되는 방법.
  77. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조가 진공 건조를 포함하는 방법.
  78. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조가 약 30℃ 내지 약 70℃의 온도에서 수행되는 방법.
  79. 제71항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액 중 하나 또는 전부가 탈산소화되는 방법.
  80. 제46항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 화합물을 상기 중합체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  81. 제46항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 중합체를 상기 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  82. 제46항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 중합체를 상기 중합체 및 페이퍼 또는 섬유 매트릭스와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  83. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.
  84. 제83항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 용기 내에 포함되는 키트.
  85. 제84항에 있어서, 상기 조성물이 복수의 튜브 내에 포함되는 키트.
  86. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 복수의 페이퍼 스폿(paper spot)의 형태이고, 각각의 스폿은 약 2 mm 내지 약 5 mm의 직경을 갖는 키트.

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