JP7447101B2 - セレンテラジンならびにその類似体及び誘導体を安定化させるための組成物及び方法 - Google Patents

セレンテラジンならびにその類似体及び誘導体を安定化させるための組成物及び方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月３日に出願された米国仮特許出願第６２／７４０，６２２号、及び２０１９年２月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／８０５，５１７号に対する優先権及び利益を主張し、これらの各々は、参照によりその全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
セレンテラジンならびにその類似体及び誘導体を安定化させるための、かつセレンテラジンならびにその類似体及び誘導体の溶解性及び再構成効率を改善するための組成物及び方法が本明細書に提供される。
発光は、レポーター分子の活性の尺度として生物学的アッセイに使用される。レポーター分子は、次いで、発光測定を、転写（遺伝子発現）、翻訳（タンパク質発現）、タンパク質－タンパク質相互作用等の目的の生物学的プロセスに連結し、それにより生物学的プロセスに生じる変化の定量的測定を可能にする。レポーター分子は、典型的には、その発光性基質とともに提供されると光の産生（すなわち、発光）をもたらす、発光性酵素（例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ等）である。
セレンテラジン等の発光性基質、ならびにそれらの類似体及び誘導体は、保存（例えば、有機溶媒中での保存、より高い温度での保存、不正確なｐＨでの保存等）中に分解する可能性があり、それにより生物学的アッセイに添加する前または生物学的アッセイに使用する前に基質の損失をもたらす。そのような分解は、温度依存的な様式での経時的な溶液における発光性基質の不安定性の結果であり得る。この分解は、発光性基質の無駄、ならびに分解された発光性基質を用いる生物学的アッセイに由来する発光測定の感度及び再現性の低下をもたらす。また、この分解の生成物は、発光反応も阻害する。さらに、いくつかのセレンテラジンは、異なるアッセイ緩衝液においてもしくは直接試験試料において低い溶解性を有するか、または異なるアッセイ緩衝液において一貫性のない再構成を呈し得る。セレンテラジンは、適切な緩衝液に希釈する前に有機溶媒中に溶解することができるが、セレンテラジン化合物の有機溶液は、保存における不安定性（熱不安定性及び光不安定性の両方）に苦しむ場合がある。しかしながら、固体セレンテラジンならびにセレンテラジン類似体及び誘導体（例えば、フリマジン）は、それらの有機溶液よりもかなり安定しているが、それらは、特に非有機溶媒が必要とされる場合、極めて乏しい再構成速度及び効率を呈し、一貫せずに溶解し、アッセイ及び他の方法において直接用いることが困難である。これらの欠点は、セレンテラジンならびにその類似体及び誘導体が開発されてきた用途の数及び種類を大幅に制限している。
したがって、発光性基質を安定化させ、その溶解性を改善し、及び／またはその再構成効率を増加させるための新しい組成物及び／または方法に対する必要性が存在する。特に、物理的特性及び／または溶解性が改善された基質を有することは、長期保存（例えば、室温で１２か月以上）、アッセイ形式（複数可）適合性、頑健性、及び利用者の利便性に有益である。
セレンテラジンまたはその類似体もしくは誘導体などの発光性基質の溶解性及び／または再構成効率を安定化及び改善するための組成物及び方法が本明細書に提供される。異なる固体組成物、製剤、及び形式内の基質の化学的完全性及び／または再構成効率の特性評価を、ＨＰＬＣ、吸光度、及び質量分光法を使用して実施した。アッセイ関連条件下での基質のさらなる機能的特性評価を、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素の存在下で相対光単位（ＲＬＵ）を介して生物発光を監視することによって実施した。
セレンテラジン及びその類似体または誘導体から選択される化合物と、ポリマーとを含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、化合物は、セレンテラジン、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈ－ｈ、フリマジン、ＪＲＷ－０２３８、ＪＲＷ－１７４３、及びＪＲＷ－１７４４から選択される。いくつかの実施形態では、化合物は、フリマジンである。いくつかの実施形態では、化合物は、ＪＲＷ－０２３８である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＪＲＷ－１７４３である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＪＲＷ－１７４４である。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、天然バイオポリマーである。いくつかの実施形態では、天然バイオポリマーは、プルラン、トレハロース、マルトース、セルロース、デキストラン、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、天然バイオポリマーは、プルランである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、環状糖類ポリマーまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリンである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、合成ポリマーである。いくつかの実施形態では、合成ポリマーは、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、合成ポリマーは、少なくとも１つのポリ（プロピレンオキシド）ブロックと少なくとも１つのポリ（エチレンオキシド）ブロックとを含むブロックコポリマーである。いくつかの実施形態では、合成ポリマーは、ポロキサマーである。
いくつかの実施形態では、組成物は、緩衝液、界面活性剤、還元剤、塩、ラジカル捕捉剤、キレート剤、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、リン酸緩衝液、トリシン、及び２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸から選択される緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、及びポリソルベート８０から選択される界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、チオ尿素及び６－アザ－２－チオチミンから選択される還元剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、塩化ナトリウム及びリン酸ナトリウムから選択される塩をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、アスコルビン酸及びアスコルビン酸ナトリウムから選択されるラジカル捕捉剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、キレート剤をさらに含み、キレート剤は、クエン酸及びトランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－四酢酸から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、及び高度に精製された豚由来の皮膚コラーゲンのポリペプチド画分から選択されるタンパク質をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、凍結乾燥粉末またはケーキの形態である。いくつかの実施形態では、組成物は、可鍛性フィルムの形態である。いくつかの実施形態では、組成物は、溶液である。
セレンテラジン及びその類似体または誘導体から選択される化合物と、紙もしくは繊維マトリックス、プラスチック、ガラス、または金属から選択される表面とを含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、化合物は、セレンテラジン、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈ－ｈ、フリマジン、ＪＲＷ－０２３８、ＪＲＷ－１７４３、及びＪＲＷ－１７４４から選択される。いくつかの実施形態では、化合物は、フリマジンである。いくつかの実施形態では、化合物は、ＪＲＷ－０２３８である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＪＲＷ－１７４３である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＪＲＷ－１７４４である。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリマーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、天然バイオポリマーである。いくつかの実施形態では、天然バイオポリマーは、プルラン、トレハロース、マルトース、セルロース、デキストラン、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、天然バイオポリマーは、プルランである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、環状糖類ポリマーまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリンである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、合成ポリマーである。いくつかの実施形態では、合成ポリマーは、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、合成ポリマーは、少なくとも１つのポリ（プロピレンオキシド）ブロックと少なくとも１つのポリ（エチレンオキシド）ブロックとを含むブロックコポリマーである。いくつかの実施形態では、合成ポリマーは、ポロキサマーである。
いくつかの実施形態では、組成物は、緩衝液、界面活性剤、還元剤、塩、ラジカル捕捉剤、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、リン酸緩衝液、トリシン、及び２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸から選択される緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、及びポリソルベート８０から選択される界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、チオ尿素及び６－アザ－２－チオチミンから選択される還元剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、塩化ナトリウム及びリン酸ナトリウムから選択される塩をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、アスコルビン酸及びアスコルビン酸ナトリウムから選択されるラジカル捕捉剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、キレート剤をさらに含み、キレート剤は、クエン酸及びトランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－四酢酸から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、及び高度に精製された豚由来の皮膚コラーゲンのポリペプチド画分から選択されるタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、表面は、セルロース紙、ニトロセルロース紙、ナイロン紙、綿紙、ポリエステル紙、カルボキシメチルセルロースナトリウム、多孔質または高分子膜、高純度綿繊維、綿／レーヨン混合高純度綿、及びガラス微小繊維から選択される。
セレンテラジン及びその類似体または誘導体から選択される化合物を安定化させる方法が本明細書に提供され、この方法は、セレンテラジン化合物またはその類似体もしくは誘導体を有効量のポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触させて組成物を形成することを含む。いくつかの実施形態では、化合物は、熱分解、化学分解、光誘導分解、またはそれらの任意の組み合わせに対して安定化される。
セレンテラジン及びその類似体または誘導体から選択される化合物の溶解性を改善する方法が本明細書に提供され、この方法は、セレンテラジン化合物またはその類似体もしくは誘導体を有効量のポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触させて組成物を形成することを含む。いくつかの実施形態では、化合物の溶解性は、ポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触していない化合物と比較して、水溶液中で改善される。
セレンテラジン及びその類似体または誘導体から選択される化合物の再構成速度を改善する方法が本明細書に提供され、この方法は、セレンテラジン化合物またはその類似体もしくは誘導体を有効量のポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触させて組成物を形成することを含み、化合物の再構成速度が、ポリマーまたは紙もしくは繊維マトリックスと接触していない化合物と比較して改善される。
いくつかの実施形態では、化合物は、セレンテラジン、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈ－ｈ、フリマジン、ＪＲＷ－０２３８、ＪＲＷ－１７４３、及びＪＲＷ－１７４４から選択される。いくつかの実施形態では、化合物は、フリマジンである。いくつかの実施形態では、化合物は、ＪＲＷ－０２３８である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＪＲＷ－１７４３である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＪＲＷ－１７４４である。いくつかの実施形態では、ポリマーは、天然バイオポリマーである。いくつかの実施形態では、天然バイオポリマーは、プルラン、トレハロース、マルトース、セルロース、デキストラン、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、天然バイオポリマーは、プルランである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、環状糖類ポリマーまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリンである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、合成ポリマーである。いくつかの実施形態では、合成ポリマーは、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、合成ポリマーは、少なくとも１つのポリ（プロピレンオキシド）ブロックと少なくとも１つのポリ（エチレンオキシド）ブロックとを含むブロックコポリマーである。いくつかの実施形態では、合成ポリマーは、ポロキサマーである。
いくつかの実施形態では、組成物は、緩衝液、界面活性剤、還元剤、塩、ラジカル捕捉剤、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、リン酸緩衝液、トリシン、及び２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸から選択される緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、及びポリソルベート８０から選択される界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、チオ尿素及び６－アザ－２－チオチミンから選択される還元剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、塩化ナトリウム及びリン酸ナトリウムから選択される塩をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、アスコルビン酸及びアスコルビン酸ナトリウムから選択されるラジカル捕捉剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、キレート剤をさらに含み、キレート剤は、クエン酸である。いくつかの実施形態では、組成物は、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、及び高度に精製された豚由来の皮膚コラーゲンのポリペプチド画分から選択されるタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、紙または繊維マトリックスは、セルロース紙、ニトロセルロース紙、ナイロン紙、綿紙、ポリエステル紙、カルボキシメチルセルロースナトリウム、多孔質または高分子膜、高純度綿繊維、綿／レーヨン混合高純度綿、及びガラス微小繊維から選択される。
いくつかの実施形態では、接触ステップは、化合物を有機溶媒中に溶解して第１の溶液を形成することと、第１の溶液をポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと混合して混合物を形成することと、混合物を乾燥させることと、を含む。いくつかの実施形態では、混合ステップは、ポリマーを第２の溶液中に溶解させることと、第２の溶液を第１の溶液と混合することと、を含む。いくつかの実施形態では、混合ステップは、第１の溶液を、紙または繊維マトリックスに適用することを含む。いくつかの実施形態では、乾燥ステップは、凍結乾燥を含む。いくつかの実施形態では、乾燥ステップは、空気乾燥を含む。いくつかの実施形態では、乾燥は、不活性雰囲気中、周囲温度で行われる。いくつかの実施形態では、乾燥は、真空乾燥を含む。いくつかの実施形態では、乾燥は、約３０℃～約７０℃の温度で行われる。いくつかの実施形態では、溶液のうちの１つまたは全ては、脱酸素化される。
いくつかの実施形態では、方法は、化合物をポリマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ポリマーを、紙または繊維マトリックスと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ポリマーを、ポリマー及び紙または繊維マトリックスと接触させることを含む。
本明細書に開示される組成物のうちのいずれか１つを含むキットが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の容器に含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は、複数のチューブに含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は、複数の紙スポットの形態であり、各スポットは、約２ｍｍ～約５ｍｍの直径を有する。
実施例１に記載されるように、本開示による組成物を、（Ａ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．０）、及び（Ｂ）Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液中で発光出力について試験した場合の、シグナル動態を示す。図１（Ｃ）は、プルラン系凍結乾燥ケーキ及びプルランフィルム液滴製剤におけるフリマジン基質試料の画像を示す。 実施例１に記載されるように、本開示による組成物を、（Ａ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．０）、及び（Ｂ）Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液中で発光出力について試験した場合の、シグナル動態を示す。図１（Ｃ）は、プルラン系凍結乾燥ケーキ及びプルランフィルム液滴製剤におけるフリマジン基質試料の画像を示す。 実施例１に記載されるように、本開示による組成物を、（Ａ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．０）、及び（Ｂ）Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液中で発光出力について試験した場合の、シグナル動態を示す。図１（Ｃ）は、プルラン系凍結乾燥ケーキ及びプルランフィルム液滴製剤におけるフリマジン基質試料の画像を示す。 実施例１に記載されるように、本開示による組成物をＰＢＳ（ｐＨ７．０）中で発光出力について試験した場合の、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素を添加した後の様々な時点でのＲＬＵ値を示す。 実施例１に記載されるように、本開示による組成物をＰＢＳ（ｐＨ７．０）中で発光出力について試験した場合の、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素を添加した後の様々な時点でのＲＬＵ値を示す。 実施例１に記載されるように、本開示による組成物をＰＢＳ（ｐＨ７．０）中で発光出力について試験した場合の、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素を添加した後の様々な時点でのＲＬＵ値を示す。 実施例１に記載されるように、本開示による組成物をＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液中で発光出力について試験した場合の、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素を添加した後の様々な時点でのＲＬＵ値を示す。 実施例１に記載されるように、本開示による組成物をＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液中で発光出力について試験した場合の、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素を添加した後の様々な時点でのＲＬＵ値を示す。 実施例１に記載されるように、本開示による組成物をＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液中で発光出力について試験した場合の、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素を添加した後の様々な時点でのＲＬＵ値を示す。 実施例２に記載されるように、本開示による組成物を、ＰＢＳ（ｐＨ６．８）中で２１０～６００ｎｍの範囲にわたる吸光度について試験した場合の、水溶液中の吸光度値を示す。 実施例２に記載されるように、本開示による組成物を、ＰＢＳ（ｐＨ６．８）中で２１０～６００ｎｍの範囲にわたる吸光度について試験した場合の、水溶液中の吸光度値を示す。 実施例２に記載されるように、本開示による組成物を、ＰＢＳ（ｐＨ６．８）中で２１０～６００ｎｍの範囲にわたる吸光度について試験した場合の、水溶液中の吸光度値を示す。 実施例３に記載されるように、本開示による組成物の、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に再構成する能力を実証する画像を示す。 実施例４に記載されるように、ＰＢＳ（ｐＨ６．８）中のプルランの２１０～６００ｎｍの範囲にわたる吸光度値を示す。 実施例４に記載されるように、ＰＢＳ（ｐＨ６．８）中のプルランの２１０～６００ｎｍの範囲にわたる吸光度値を示す。 実施例５に記載されるように、再構成から（Ａ）０時間及び（Ｂ）５時間後のフリマジンを含有する０ｗ／ｖ％のプルラン系凍結乾燥ケーキ製剤についての代表的なＨＰＬＣトレースを示す。 実施例５に記載されるように、再構成から（Ａ）０時間及び（Ｂ）５時間後のフリマジンを含有する０ｗ／ｖ％のプルラン系凍結乾燥ケーキ製剤についての代表的なＨＰＬＣトレースを示す。 実施例５に記載されるように、再構成から（Ａ）０時間及び（Ｂ）５時間後のフリマジンを含有する２．５ｗ／ｖ％のプルラン系凍結乾燥ケーキ製剤についての代表的なＨＰＬＣトレースを示す。 実施例５に記載されるように、再構成から（Ａ）０時間及び（Ｂ）５時間後のフリマジンを含有する２．５ｗ／ｖ％のプルラン系凍結乾燥ケーキ製剤についての代表的なＨＰＬＣトレースを示す。 実施例５に記載されるように、再構成から（Ａ）０時間及び（Ｂ）５時間後のフリマジンを含有する１５ｗ／ｖ％のプルラン系凍結乾燥ケーキ製剤についての代表的なＨＰＬＣトレースを示す。 実施例５に記載されるように、再構成から（Ａ）０時間及び（Ｂ）５時間後のフリマジンを含有する１５ｗ／ｖ％のプルラン系凍結乾燥ケーキ製剤についての代表的なＨＰＬＣトレースを示す。 実施例５に記載されるように、再構成から（Ａ）０時間及び（Ｂ）５時間後のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質についての代表的なＨＰＬＣトレースを示す。 実施例５に記載されるように、再構成から（Ａ）０時間及び（Ｂ）５時間後のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質についての代表的なＨＰＬＣトレースを示す。 実施例５に記載されるように、（Ａ）経時的な２５４ｎｍでの吸光度、及び（Ｂ）経時的なピーク面積を示す、プルランを含むかまたは含まない製剤化フリマジン試料についてのＨＰＬＣトレースの分析を示す。 実施例５に記載されるように、（Ａ）経時的な２５４ｎｍでの吸光度、及び（Ｂ）経時的なピーク面積を示す、プルランを含むかまたは含まない製剤化フリマジン試料についてのＨＰＬＣトレースの分析を示す。 実施例５に記載されるように、経時的なアミノピラジン分解生成物の産生を示す、プルランを含むかまたは含まない製剤化フリマジン試料についてのＨＰＬＣトレースからのデータを示す。 （Ａ）実施例６に記載されるように、組成物を発光出力について試験した場合のＲＬＵ値の動態解析、（Ｂ）実施例６に記載されるように、組成物を発光出力について試験した場合の時間０におけるＲＬＵ値、及び（Ｃ）実施例６に記載されるように調製された、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットの画像を示す。 （Ａ）実施例６に記載されるように、組成物を発光出力について試験した場合のＲＬＵ値の動態解析、（Ｂ）実施例６に記載されるように、組成物を発光出力について試験した場合の時間０におけるＲＬＵ値、及び（Ｃ）実施例６に記載されるように調製された、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットの画像を示す。 （Ａ）実施例６に記載されるように、組成物を発光出力について試験した場合のＲＬＵ値の動態解析、（Ｂ）実施例６に記載されるように、組成物を発光出力について試験した場合の時間０におけるＲＬＵ値、及び（Ｃ）実施例６に記載されるように調製された、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットの画像を示す。 図１４Ａ－Ｂは、実施例７にさらに記載されるように、製剤化フリマジン試料をＷｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカード上に乾燥させ、（Ａ）４℃で２週間、または（Ｂ）４℃もしくは２５℃で３か月間維持した試料の画像を示す。 図１５Ａ－Ｄは、実施例８に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットに乾燥させた、製剤化フリマジン試料のアッセイ性能に対する添加剤の効果を実証するデータを示す。 実施例９に記載されるように調製された、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例９に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、（Ａ）４℃、（Ｂ）２５℃、及び（Ｃ）３７℃で１日保存した後に試験された紙スポットにおける、フリマジン試料のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例９に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、（Ａ）４℃、（Ｂ）２５℃、及び（Ｃ）３７℃で１日保存した後に試験された紙スポットにおける、フリマジン試料のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例９に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、（Ａ）４℃、（Ｂ）２５℃、及び（Ｃ）３７℃で１日保存した後に試験された紙スポットにおける、フリマジン試料のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例９に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、（Ａ）４℃、（Ｂ）２５℃、及び（Ｃ）３７℃で３日間保存した後に試験された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例９に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、（Ａ）４℃、（Ｂ）２５℃、及び（Ｃ）３７℃で３日間保存した後に試験された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例９に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、（Ａ）４℃、（Ｂ）２５℃、及び（Ｃ）３７℃で３日間保存した後に試験された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例１０に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、異なるタンパク質緩衝液で前処理され、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で活性について試験された紙スポットに配置された、製剤化フリマジン試料についてのデータを示し、（Ａ）６０℃及び（Ｂ）２５℃でスポットを保存した後のＲＬＵ出力、ならびに（Ｃ）６０℃及び（Ｄ）２５℃でスポットを保存した後の経時的な活性％を示すデータを示す。 実施例１０に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、異なるタンパク質緩衝液で前処理され、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で活性について試験された紙スポットに配置された、製剤化フリマジン試料についてのデータを示し、（Ａ）６０℃及び（Ｂ）２５℃でスポットを保存した後のＲＬＵ出力、ならびに（Ｃ）６０℃及び（Ｄ）２５℃でスポットを保存した後の経時的な活性％を示すデータを示す。 実施例１０に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、異なるタンパク質緩衝液で前処理され、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で活性について試験された紙スポットに配置された、製剤化フリマジン試料についてのデータを示し、（Ａ）６０℃及び（Ｂ）２５℃でスポットを保存した後のＲＬＵ出力、ならびに（Ｃ）６０℃及び（Ｄ）２５℃でスポットを保存した後の経時的な活性％を示すデータを示す。 実施例１０に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、異なるタンパク質緩衝液で前処理され、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で活性について試験された紙スポットに配置された、製剤化フリマジン試料についてのデータを示し、（Ａ）６０℃及び（Ｂ）２５℃でスポットを保存した後のＲＬＵ出力、ならびに（Ｃ）６０℃及び（Ｄ）２５℃でスポットを保存した後の経時的な活性％を示すデータを示す。 実施例１０に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、２５℃または６０℃で保存された数日間にわたって基質活性について試験された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料のＲＬＵ出力を実証する加速安定性データを示し、（Ａ）６０℃及び（Ｂ）２５℃でスポットを保存した後のＲＬＵ出力、ならびに（Ｃ）６０℃及び（Ｄ）２５℃でスポットを保存した後の経時的な活性％を示す。 実施例１０に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、２５℃または６０℃で保存された数日間にわたって基質活性について試験された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料のＲＬＵ出力を実証する加速安定性データを示し、（Ａ）６０℃及び（Ｂ）２５℃でスポットを保存した後のＲＬＵ出力、ならびに（Ｃ）６０℃及び（Ｄ）２５℃でスポットを保存した後の経時的な活性％を示す。 実施例１０に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、２５℃または６０℃で保存された数日間にわたって基質活性について試験された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料のＲＬＵ出力を実証する加速安定性データを示し、（Ａ）６０℃及び（Ｂ）２５℃でスポットを保存した後のＲＬＵ出力、ならびに（Ｃ）６０℃及び（Ｄ）２５℃でスポットを保存した後の経時的な活性％を示す。 実施例１０に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、２５℃または６０℃で保存された数日間にわたって基質活性について試験された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料のＲＬＵ出力を実証する加速安定性データを示し、（Ａ）６０℃及び（Ｂ）２５℃でスポットを保存した後のＲＬＵ出力、ならびに（Ｃ）６０℃及び（Ｄ）２５℃でスポットを保存した後の経時的な活性％を示す。 実施例１１に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、異なる乾燥方法を使用して調製された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例１１に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、異なる乾燥方法を使用して調製された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例１１に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、異なる乾燥方法を使用して調製された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例１１に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、異なる乾燥方法を使用して調製された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料の数日間にわたるＲＬＵ出力及び活性パーセントを実証するデータを示す。 実施例１１に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、異なる乾燥方法を使用して調製された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料の数日間にわたるＲＬＵ出力及び活性パーセントを実証するデータを示す。 実施例１１に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、異なる乾燥方法を使用して調製された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料の数日間にわたるＲＬＵ出力及び活性パーセントを実証するデータを示す。 実施例１１に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、異なる乾燥方法を使用して調製された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料の数日間にわたるＲＬＵ出力及び活性パーセントを実証するデータを示す。 実施例１２に記載されるように、６０℃でＡ－０時間、及びＢ－４８時間保存した後の、代表的なプルラン系凍結乾燥フリマジン試料についてのＨＰＬＣトレースを示す。 実施例１２に記載されるように、６０℃でＡ－０時間、及びＢ－４８時間保存した後の、代表的なプルラン系凍結乾燥フリマジン試料についてのＨＰＬＣトレースを示す。 実施例１２に記載されるように、（６０℃で、図２４Ａは０時間、及び図２４Ｂは４８時間）保存した後の、市販のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質試料のＨＰＬＣトレースを示す。 実施例１２に記載されるように、（６０℃で、図２４Ａは０時間、及び図２４Ｂは４８時間）保存した後の、市販のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質試料のＨＰＬＣトレースを示す。 実施例１２に記載されるように、２５℃での生面積として製剤化フリマジン試料の熱安定性を示すＨＰＬＣデータの分析を示す。 実施例１２に記載されるように、図２５Ｂは６０℃での生面積として、製剤化フリマジン試料の熱安定性を示すＨＰＬＣデータの分析を示す。 実施例１２に記載されるように、２５℃での面積パーセントとして、製剤化フリマジン試料の熱安定性を示すＨＰＬＣデータの分析を示す。 実施例１２に記載されるように、６０℃での面積パーセントとして、製剤化フリマジン試料の熱安定性を示すＨＰＬＣデータの分析を示す。 フリマジン試料保存後に精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で試験した、製剤化フリマジン試料のＲＬＵデータを示す。実施例１２に記載されるように、５０μＭの基質を使用して再構成及び試験される前に６０℃で様々な期間保存された試料に関するデータを示す。 フリマジン試料保存後に精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で試験した、製剤化フリマジン試料のＲＬＵデータを示す。実施例１２に記載されるように、１０μＭの基質を使用して再構成及び試験される前に６０℃で様々な期間保存された試料に関するデータを示す。 フリマジン試料保存後に精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で試験した、製剤化フリマジン試料のＲＬＵデータを示す。実施例１２に記載されるように、０．１μＭの基質を使用して再構成及び試験される前に６０℃で様々な期間保存された試料に関するデータを示す。 フリマジン試料保存後に精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で試験した、製剤化フリマジン試料のＲＬＵデータを示す。５０μＭの基質を使用して再構成及び試験される前に２５℃で様々な期間保存された試料に関するデータを示す。 フリマジン試料保存後に精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で試験した、製剤化フリマジン試料のＲＬＵデータを示す。１０μＭの基質を使用して再構成及び試験される前に２５℃で様々な期間保存された試料に関するデータを示す。 フリマジン試料保存後に精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で試験した、製剤化フリマジン試料のＲＬＵデータを示す。０．１μＭの基質（Ｆ）を使用して再構成及び試験される前に２５℃で様々な期間保存された試料に関するデータを示す。 製剤化フリマジン試料を、フリマジン試料保存後に精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で活性について試験した場合の、時間ゼロにおける基質活性パーセントを示す。実施例１２に記載されるように、５０μＭの基質を使用して再構成及び試験される前に６０℃で様々な期間保存された試料に関するデータを示す。 製剤化フリマジン試料を、フリマジン試料保存後に精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で活性について試験した場合の、時間ゼロにおける基質活性パーセントを示す。実施例１２に記載されるように、１０μＭの基質を使用して再構成及び試験される前に６０℃で様々な期間保存された試料に関するデータを示す。 製剤化フリマジン試料を、フリマジン試料保存後に精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で活性について試験した場合の、時間ゼロにおける基質活性パーセントを示す。実施例１２に記載されるように、０．１μＭの基質を使用して再構成及び試験される前に６０℃で様々な期間保存された試料に関するデータを示す。 製剤化フリマジン試料を、フリマジン試料保存後に精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で活性について試験した場合の、時間ゼロにおける基質活性パーセントを示す。５０μＭの基質を使用して再構成及び試験される前に２５℃で様々な期間保存された試料に関するデータを示す。 製剤化フリマジン試料を、フリマジン試料保存後に精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で活性について試験した場合の、時間ゼロにおける基質活性パーセントを示す。１０μＭの基質を使用して再構成及び試験される前に２５℃で様々な期間保存された試料に関するデータを示す。 製剤化フリマジン試料を、フリマジン試料保存後に精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素で活性について試験した場合の、時間ゼロにおける基質活性パーセントを示す。０．１μＭの基質を使用して再構成及び試験される前に２５℃で様々な期間保存された試料に関するデータを示す。 実施例１３に記載されるように、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素を用いて試験した場合の、フリマジン基質を含有する製剤化プルランフィルムコーティングされた９６ウェルマイクロタイタプレートのＲＬＵデータを示す。 実施例１３に記載されるように、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素を用いて試験した場合の、フリマジン基質を含有する製剤化プルランフィルムコーティングされた９６ウェルマイクロタイタプレートのＲＬＵデータを示す。 実施例１３に記載されるように、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素を用いて試験した場合の、フリマジン基質を含有する製剤化プルランフィルムコーティングされた９６ウェルマイクロタイタプレートのＲＬＵデータを示す。 実施例１３に記載されるように、プルランフィルムマトリックス内の標準的な９６ウェルマイクロタイタプレートの底部をコーティングするフリマジンを含有するプルラン系フィルム形式の代表的な例を示す。 実施例１３に記載されるように、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素がフリマジン製剤と同時に配置されたウェルについて、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素との反応後、またはＰＢＳによる単純な再構成後に、標準的な９６ウェルマイクロタイタプレートの底部に付着したフリマジンを単独で含有するかまたはＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素も含有するプルラン系フィルムの代表的な例のデータを示し、図３０Ａは生ＲＬＵを示し、図３０Ｂは活性％を示し、図３０Ｃは１０日間にわたる活性％を示す。 実施例１３に記載されるように、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素がフリマジン製剤と同時に配置されたウェルについて、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素との反応後、またはＰＢＳによる単純な再構成後に、標準的な９６ウェルマイクロタイタプレートの底部に付着したフリマジンを単独で含有するかまたはＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素も含有するプルラン系フィルムの代表的な例のデータを示し、図３０Ａは生ＲＬＵを示し、図３０Ｂは活性％を示し、図３０Ｃは１０日間にわたる活性％を示す。 実施例１３に記載されるように、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素がフリマジン製剤と同時に配置されたウェルについて、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素との反応後、またはＰＢＳによる単純な再構成後に、標準的な９６ウェルマイクロタイタプレートの底部に付着したフリマジンを単独で含有するかまたはＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素も含有するプルラン系フィルムの代表的な例のデータを示し、図３０Ａは生ＲＬＵを示し、図３０Ｂは活性％を示し、図３０Ｃは１０日間にわたる活性％を示す。 実施例１４に記載されるように、市販のフリマジン生成物と比較して、各条件について２５℃（第１のバー）または６０℃（第２のバー）で保存した後にプルラン系凍結乾燥ケーキとして調製されたフリマジンの分解生成物の正規化された吸光度を示す。 実施例１４に記載されるように、市販のフリマジン生成物と比較して、各条件について２５℃（第１のバー）または６０℃（第２のバー）で保存した後にプルラン系凍結乾燥ケーキとして調製されたフリマジンの分解生成物の正規化された吸光度を示す。 実施例１４に記載されるように、市販のフリマジン生成物と比較して、各条件について２５℃（第１のバー）または６０℃（第２のバー）で保存した後にプルラン系凍結乾燥ケーキとして調製されたフリマジンの分解生成物の正規化された吸光度を示す。 実施例１４に記載されるように、市販のフリマジン生成物と比較して、各条件について２５℃（第１のバー）または６０℃（第２のバー）で保存した後にプルラン系凍結乾燥ケーキとして調製されたフリマジンの分解生成物の正規化された吸光度を示す。 実施例１４に記載されるように、市販のフリマジン生成物と比較して、各条件について２５℃（第１のバー）または６０℃（第２のバー）で保存した後にプルラン系凍結乾燥ケーキとして調製されたフリマジンの分解生成物の正規化された吸光度を示す。 実施例１４に記載されるように、市販のフリマジン生成物と比較して、各条件について２５℃（第１のバー）または６０℃（第２のバー）で保存した後にプルラン系凍結乾燥ケーキとして調製されたフリマジンの分解生成物の正規化された吸光度を示す。 実施例１４に記載されるように、市販のフリマジン生成物と比較して、各条件について２５℃（第１のバー）または６０℃（第２のバー）で保存した後にプルラン系凍結乾燥ケーキとして調製されたフリマジンの分解生成物の相対面積パーセントを示す。 実施例１４に記載されるように、市販のフリマジン生成物と比較して、各条件について２５℃（第１のバー）または６０℃（第２のバー）で保存した後にプルラン系凍結乾燥ケーキとして調製されたフリマジンの分解生成物の相対面積パーセントを示す。 実施例１４に記載されるように、市販のフリマジン生成物と比較して、各条件について２５℃（第１のバー）または６０℃（第２のバー）で保存した後にプルラン系凍結乾燥ケーキとして調製されたフリマジンの分解生成物の相対面積パーセントを示す。 実施例１４に記載されるように、市販のフリマジン生成物と比較して、各条件について２５℃（第１のバー）または６０℃（第２のバー）で保存した後にプルラン系凍結乾燥ケーキとして調製されたフリマジンの分解生成物の相対面積パーセントを示す。 実施例１４に記載されるように、市販のフリマジン生成物と比較して、各条件について２５℃（第１のバー）または６０℃（第２のバー）で保存した後にプルラン系凍結乾燥ケーキとして調製されたフリマジンの分解生成物の相対面積パーセントを示す。 実施例１４に記載されるように、市販のフリマジン生成物と比較して、各条件について２５℃（第１のバー）または６０℃（第２のバー）で保存した後にプルラン系凍結乾燥ケーキとして調製されたフリマジンの分解生成物の相対面積パーセントを示す。 図３３Ａ－Ｂは、実施例１５に記載されるように、室温で６か月間保存されたフリマジンを含有するプルラン系形式の代表的な例のデータを示す。 図３４Ａ－Ｃは、実施例１６に記載されるように、異なる種類の紙マトリックス上に乾燥させたフリマジン試料のＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 図３５Ａ－Ｂは、再構成後の３つの異なる固相材料上にレポータータンパク質であるＬｇＴｒｉｐで製剤化されたフリマジン試料からの生物発光シグナルの代表的な例を示す。 図３６Ａ－Ｃは、実施例１７に記載されるように、異なる種類の紙マトリックス上にアスコルビン酸との１：１混合物として保存されたフリマジン試料のＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 図３７Ａ－Ｃは、実施例１８に記載されるように、３０％のクエン酸で前処理された紙マトリックス上に保存されたフリマジン試料のＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 図３８Ａ－Ｃは、実施例１９に記載されるように、マトリックスを水で前処理し、減圧下で一晩乾燥させた後の紙マトリックス上に保存されたフリマジン試料のＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 実施例２０に記載されるように、異なる紙マトリックス上にクエン酸との１：１の混合物として保存されたフリマジンのＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 実施例２０に記載されるように、異なる紙マトリックス上にクエン酸との１：１の混合物として保存されたフリマジンのＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 実施例２０に記載されるように、異なる紙マトリックス上にクエン酸との１：１の混合物として保存されたフリマジンのＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 実施例２０に記載されるように、異なる紙マトリックス上にクエン酸との１：１の混合物として保存されたフリマジンのＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 実施例２１に記載されるように、タンパク質緩衝液の存在下または非存在下で、シトレートまたはアスコルベートのいずれかと１：１のモル比でフリマジンで処理された、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、異なる乾燥方法を使用して調製された、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料の最大ＲＬＵ（上部）及び活性％（下部）の代表的な例を示す。 実施例２１に記載されるように、タンパク質緩衝液の存在下または非存在下で、シトレートまたはアスコルベートのいずれかと１：１のモル比でフリマジンで処理された、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、異なる乾燥方法を使用して調製された、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料の最大ＲＬＵ（上部）及び活性％（下部）の代表的な例を示す。 実施例２１に記載されるように、タンパク質緩衝液の存在下または非存在下で、シトレートまたはアスコルベートのいずれかと１：１のモル比でフリマジンで処理された、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、異なる乾燥方法を使用して調製された、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料の最大ＲＬＵ（上部）及び活性％（下部）の代表的な例を示す。 実施例２２に記載されるように、異なる条件下で保存され、２５℃で保存された数日間にわたってサンプリングされた、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料の数日間にわたるＲＬＵ出力及び活性％を実証するデータを示す。 実施例２３に記載されるように、基質が固体マトリックス支持体から放出されるかどうかを決定するために、元のウェルからスポットを除去する前後の、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料のＲＬＵ出力及びシグナル回収％を実証するデータを示す。 実施例２３に記載されるように、基質が固体マトリックス支持体から放出されるかどうかを決定するために、元のウェルからスポットを除去する前後の、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料のＲＬＵ出力及びシグナル回収％を実証するデータを示す。 実施例２３に記載されるように、基質が固体マトリックス支持体から放出されるかどうかを決定するために、元のウェルからスポットを除去する前後の、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットにおける、製剤化フリマジン試料のＲＬＵ出力及びシグナル回収％を実証するデータを示す。 実施例２４に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットにおける、異なる糖類またはポリマー成分を含有する、ならびにアスコルベートを含むかまたは含まない、様々な製剤化フリマジン溶液の変動するｐＨでのＲＬＵ出力及び活性％を実証するデータを示す。 実施例２４に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットにおける、異なる糖類またはポリマー成分を含有する、ならびにアスコルベートを含むかまたは含まない、様々な製剤化フリマジン溶液の変動するｐＨでのＲＬＵ出力及び活性％を実証するデータを示す。 実施例２４に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットにおける、異なる糖類またはポリマー成分を含有する、ならびにアスコルベートを含むかまたは含まない、様々な製剤化フリマジン溶液の変動するｐＨでのＲＬＵ出力及び活性％を実証するデータを示す。 実施例２５に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットにおける、様々な製剤化フリマジン溶液成分の固定ｐＨ＝７．０でのＲＬＵ出力及び活性％を実証するデータを示す。 実施例２５に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットにおける、様々な製剤化フリマジン溶液成分の固定ｐＨ＝７．０でのＲＬＵ出力及び活性％を実証するデータを示す。 実施例２５に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成された紙スポットにおける、様々な製剤化フリマジン溶液成分の固定ｐＨ＝７．０でのＲＬＵ出力及び活性％を実証するデータを示す。 図４５Ａ－Ｂは、実施例２６に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、２５℃で保存された数日間にわたってサンプリングされた紙スポットにおける、様々な製剤化フリマジン溶液のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 図４６Ａ－Ｂは、実施例２７に記載されるように、パンチ穴あけ用Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから作成され、２５℃で保存された数日間にわたってサンプリングされた紙スポットにおける、Ｐｒｉｏｎｅｘ、アスコルベート、及び／またはＡＴＴを含有する様々な製剤化フリマジン溶液のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例２８に記載されるように、９６ウェルマイクロタイタプレートに直接凍結乾燥されているフリマジン製剤のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例２８に記載されるように、９６ウェルマイクロタイタプレートに直接凍結乾燥されているフリマジン製剤のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例２９に記載されるように、フリマジン製剤が多層装置の１つの層に配置される例示的な層状アッセイ形式の組み立ての予測図を示す。 実施例３０に記載されるように、３７℃でアスコルビン酸ナトリウムを含有するＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３）製剤のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例３１に記載されるように、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを含有し、凍結乾燥されたＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３）製剤のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 図５１Ａ－Ｂは、実施例３２に記載されるように、特定の個々の及び組み合わせた緩衝添加剤を含有するＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３）製剤のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例３３に記載されるように、他の緩衝添加剤とともにプルランとヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンの混合ポリマーを含有するＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３）製剤のＲＬＵ出力を実証するデータを示す。 実施例３４に記載されるように、製剤化基質の代表的な例の画像を示す。 実施例３４に記載されるように、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７で製剤化されたＪＲＷ－０２３８の試料のＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 実施例３４に記載されるように、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７で製剤化されたＪＲＷ－０２３８の試料のＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 実施例３４に記載されるように、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７で製剤化されたＪＲＷ－０２３８の試料のＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 実施例３５に記載されるように、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７で製剤化されたフリマジンの試料のＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 実施例３５に記載されるように、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７で製剤化されたフリマジンの試料のＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 実施例３５に記載されるように、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７で製剤化されたフリマジンの試料のＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 実施例３６に記載されるように、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７で製剤化されたＪＲＷ－０２３８の溶液試料の代表的な画像を示す。 実施例３６に記載されるように、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７で製剤化されたＪＲＷ－０２３８の試料のＨＰＬＣ分析の代表的な例を示す。 図５８Ａ－Ｂは、実施例３７に記載されるように、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７で製剤化されたＪＲＷ－０２３８の試料の代表的な画像を示す。 図５９Ａ－Ｂは、実施例３８に記載されるように、製剤化ＪＲＷ－０２３８の試料の代表的な画像を示す。 図６０Ａ－Ｂは、実施例３８に記載されるように、再構成した製剤化ＪＲＷ－０２３８を腹腔内注射されたマウス由来のトレース及び画像を示す。 図６１Ａ－Ｂは、実施例３８に記載されるように、再構成した製剤化ＪＲＷ－０２３８を皮下注射されたマウス由来のトレース及び画像を示す。 図６２Ａ－Ｂは、実施例３９に記載されるように、スケールアップ後及び製造後の琥珀色のガラスバイアル内の製剤化フリマジン凍結乾燥ケーキの画像、ならびに新たに調製したＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）生細胞基質に対する「０」日目の時点でのこの基質の活性を示す。 実施例３９に記載されるように、本開示による組成物を２５℃または６０℃でインキュベートし、０．０１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．０）中で発光出力について試験した場合の、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素を添加した後の様々な時点でのＲＬＵ値を示す。 図６４Ａ－Ｃは、様々な合成／製剤化ステップ中のＪＲＷ－１７４３の画像：（Ａ）左側のバイアルは溶融Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７を含有し、右側のバイアルはＥｔＯＨ中に溶解したＪＲＷ－１７４３を含有する；（Ｂ）ＥｔＯＨを除去した後のＪＲＷ－１７４３、基質／ポリマー混合物を２．６ｍＬの純水中で８．５ｍＭの最終濃度に再構成した；（Ｃ）凍結乾燥後の製剤化ＪＲＷ－１７４３の代表的な例：乾燥Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７マトリックス中のＪＲＷ－１７４３（左）、及び純水中で再構成した後の同じ材料（中央及び右）を示す。 Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７で製剤化し、ナノ純水中で再構成した後の、ＪＲＷ－１７４３の代表的な吸光度トレースを示す。溶液中の基質の濃度は、吸光度によって決定された。ＪＲＭ－１７４３の平均濃度は、水中で８．５ｍＭであることが実験的に決定された。算出された乾燥製剤化基質の理論濃度は、８．７ｍＭであった。
定義
本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料を、本明細書に記載される実施形態の実践または試験に使用することができるが、いくつかの好ましい方法、組成物、装置、及び材料が本明細書に記載される。しかしながら、本発明の材料及び方法を記載するにあたり、本発明は、本明細書に記載される特定の分子、組成物、方法論、またはプロトコールに限定されないことを理解すべきである。なぜなら、これらは定型的な実験及び最適化により変動し得るからである。また、本明細書において使用される用語は、特定のバージョンまたは実施形態のみを記載するためのものであり、本明細書に記載される実施形態の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
別段定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合、定義を含めた本明細書が優先する。したがって、本明細書に記載の実施形態の文脈においては、以下の定義が適用される。
本明細書で使用される場合、用語「Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ」及び「Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ」は互換的に使用され、野生型、バリアント、及びその変異体を含む深海エビのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ（例えば、配列番号１）から分泌されるルシフェラーゼを指す。例えば、好適なＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼバリアントは、米国特許第８，５５７，９７０号及び同第８，６６９，１０３号に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例示的なＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼとしては、例えば、配列番号２のルシフェラーゼ（本明細書において互換的に「ＮａｎｏＬｕｃ」、「Ｎｌｕｃ」、「Ｎｌｕｃルシフェラーゼ」、及び「Ｎｌｕｃ酵素」とも称される）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ポリマー」という用語は、鎖が直鎖または分岐鎖であり得る鎖中で共有結合した２つ以上の反復単位を含む有機化合物を指す。典型的には、ポリマーは、共有化学結合によって一緒に結合されて直鎖骨格を形成する１つ以上の反復単位で構成される。反復単位は、同じであり得るか、または異なり得る。したがって、－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－型の構造（Ａは反復単位である）は、ホモポリマーとしても知られるポリマーである。－Ａ－Ｂ－Ａ－Ｂ－型または－Ａ－Ａ－Ａ－Ｂ－Ａ－Ａ－Ａ－Ｂ－型の構造（Ａ及びＢは反復単位である）もポリマーであり、コポリマーと称される場合がある。本明細書で使用される場合、「ポリマー」という用語は、二糖類などの２つの反復単位のみの鎖を明示的に含み、また、オリゴ糖及び多糖類などのより多くの反復単位の鎖も含む。「ポリマー」という用語はまた、合成ポリマーなどの非糖類系ポリマー（及び２つ程度の少ない数のモノマー単位のオリゴマー）も含む。いくつかの実施形態では、ポリマー（例えば、多糖類）及びオリゴマー（例えば、オリゴ糖）は、定義された長さ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００以上、または、例えば、２～１０、５～２５、１０～５０、１００超の範囲など）に制限される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリマー」への言及は、１つ以上のポリマー及び当業者に既知のそれらの同等物などへの言及である。
本明細書で使用される場合、「含む（comprise）」という用語及びその言語学的変形は、追加の特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）等の存在を除外することなく、記載された特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）等の存在を示す。逆に、「からなる（consisting of）」という用語及びその言語学的変形は、記載された特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）等の存在を示し、通常関連する不純物を除いて、記載されていない特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）等を除外する。「から本質的になる（consisting essentially of）」という語句は、記載された特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）等、ならびに組成物、システム、または方法の基本的性質に実質的な影響を与えない任意の追加の特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）等を示す。本明細書の多くの実施形態は、「含む」というオープンエンドな言語を使用して記載される。そのような実施形態は、複数の「からなる」及び／または「から本質的になる」というクローズドエンドな実施形態を包含し、代替的に、そのような言語を使用して特許請求または記載され得る。
セレンテラジン及びその類似体または誘導体から選択される化合物と、ポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックス、またはプラスチックもしくはガラス等の他の表面とを含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、分解（例えば、熱分解、化学分解、光誘発分解等）に対して化合物を安定化させる。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスまたは他の表面を含有しない組成物と比較して、分解に対して化合物を安定化させる。いくつかの実施形態では、組成物は、（例えば、ポリマーまたは紙もしくは繊維マトリックスまたは他の表面を含有しない組成物と比較して、）化合物からの１つ以上の分解生成物の形成を低減または抑制する。いくつかの実施形態では、組成物は、セレンテラジンまたはその類似体もしくは誘導体の再構成効率を向上させる。いくつかの実施形態では、組成物は、（例えば、ポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスまたは他の表面を含有しない組成物と比較して、）動態溶解性を向上させる。
組成物は、セレンテラジン及びその類似体または誘導体から選択される化合物を含む。組成物に組み込まれると、化合物は、分解（例えば、熱分解、化学分解、光誘発分解等）に対して保護され得る。
いくつかの実施形態では、化合物は、以下の構造を有するセレンテラジンである。
Figure 0007447101000001
 いくつかの実施形態では、化合物は、セレンテラジン類似体または誘導体である。例示的なセレンテラジン類似体としては、セレンテラジン－ｈ（２－デオキシセレンテラジンまたは２，８－ジベンジル－６－（４－ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン）、セレンテラジン－ｈ－ｈ（ジデオキシセレンテラジンまたは２，８－ジベンジル－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン）、フリマジン（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン）、ＪＲＷ－０２３８（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－（３－ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン）、ＪＲＷ－１７４４（６－（３－アミノ－２－フルオロフェニル）－８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）イミダゾ［１，２－α］ピラジン－３（７Ｈ）－オン、及びＪＲＷ－１７４３
（６－（３－アミノ－２－フルオロフェニル）－８－（２－フルオロベンジル）－２－（フラン－２－イルメチル）イミダゾ［１，２－α］ピラジン－３（７Ｈ）－オン）が挙げられ、これらは以下の構造を有する。
追加の例示的なセレンテラジン類似体としては、セレンテラジン－ｎ、セレンテラジン－ｆ、セレンテラジン－ｈｃｐ、セレンテラジン－ｃｐ、セレンテラジン－ｃ、セレンテラジン－ｅ、セレンテラジン－ｆｃｐ、セレンテラジン－Ｉ、セレンテラジン－ｉｃｐ、セレンテラジン－ｖ、２－メチルセレンテラジン等が挙げられる。いくつかの実施形態では、化合物は、ＷＯ２００３／０４０１００、米国特許公開第２００８／０２４８５１１号（例えば、段落［００８６］）、米国特許第８，６６９，１０３号、ＷＯ２０１２／０６１５２９、米国特許公開第２０１７／０２３３７８９号、米国特許第９，９２４，０７３号、米国特許公開第２０１８／００３００５９号、米国特許第１０，０００，５００号、米国特許公開第２０１８／０１５５３５０号、米国仮特許出願第６２／６６５，３４６号、米国特許出願第１６／３９９，４１０号、米国仮特許出願第６２／７２１，７０８号、米国特許出願第１６／５４８，２１４号、米国特許公開第２０１４／０２２７７５９号、米国特許第９，８４０，７３０号、米国特許第７，２６８，２２９号、米国特許第７，５３７，９１２号、米国特許第８，８０９，５２９号、米国特許第９，１３９，８３６号、米国特許第１０，０７７，２４４号、米国特許第９，４８７，５２０号、米国特許第９，９２４，０７３号、米国特許第９，９３８，５６４号、米国特許第９，９５１，３７３号、米国特許第１０，２８０，４４７号、米国特許第１０，３０８，９７５号、米国特許第１０，４２８，０７５号に記載されているセレンテラジン類似体であり得、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、セレンテラジン類似体は、例えば、米国特許公開第２００８／０２４８５１１号、米国特許公開第２０１２／０７０７８４９号、米国特許公開第２０１４／００９９６５４号、米国特許第９，９２７，４３０号、米国特許第１０，３１６，０７０号に記載されているものなどの前基質を含み、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、化合物は、フリマジンである。いくつかの実施形態では、化合物は、ＪＲＷ－０２３８である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＪＲＷ－１７４３である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＪＲＷ－１７４４である。
セレンテラジンならびにその類似体及び誘導体は、本明細書に記載の生物発光アッセイ及び方法などの多くのアッセイに使用される緩衝液系へのそれらの再構成に関連する課題に苦しむ場合がある。例えば、フリマジンなどのセレンテラジンまたはその類似体もしくは誘導体は、（例えば、固体材料の不均質な微結晶性に起因して）非有機緩衝液中にゆっくりと及び／または一貫せずに溶解し得る。緩衝液で希釈する前の有機溶媒中での溶解は、より速く、より一貫した結果をもたらし得るが、セレンテラジン化合物は、保存中に熱不安定性及び光不安定性の両方を含む有機溶液の不安定性に苦しむ場合がある。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，６７６，９９７号を参照されたい。いくつかの実施形態では、セレンテラジンまたはその類似体もしくは誘導体を本明細書に記載の組成物に組み込むことにより、そのような不安定性の問題なしに、より信頼性が高く一貫した溶解をもたらす。
いくつかの実施形態では、組成物は、ポリマーをさらに含む。本明細書にさらに記載されるように、ある特定の実施形態では、ポリマーの存在は、分解に対して化合物を安定化させ、かつポリマーの存在は、水中または水溶液中での化合物の溶解性を改善する。いくつかの実施形態では、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体もしくは誘導体を（例えば、有機溶媒中のセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体と比較して）安定化させること、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体もしくは誘導体の水溶性を改善すること、及び／または非有機緩衝液中のセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体の再構成効率を（例えば、ポリマーの不在下でのセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体もしくは誘導体と比較して）改善することによる。本明細書の組成物及びシステムは、未製剤化及び／または有機相セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体があまり好適でない（例えば、温度安定性または光安定性ではない）、ケアポイント、事前包装化、及び／または固相システム、方法、ならびにアッセイにおけるセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体もしくは誘導体の使用を可能にする。
ポリマーは、天然バイオポリマーまたは合成ポリマーであり得る。いくつかの実施形態では、ポリマーは、天然バイオポリマーである。好適な天然バイオポリマーは、二糖類（例えば、トレハロース、マルトース、及びスクロース）、多糖類（例えば、プルラン、デキストラン、及びセルロース）、及び非硫酸化グリコサミノグリカン（例えば、ヒアルロン酸）を含む、炭水化物である。天然バイオポリマーの混合物もまた使用され得る。ポリマーは、天然ポリマー、例えば官能化セルロース（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）の誘導体であり得る。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、プルランであり、これは、マルトトリオース反復単位を含む多糖類である。マルトトリオースは、α－１，４グリコシド結合を介して連結される３つのグルコース単位を含む三糖類である。プルランポリマー内のマルトトリオース単位は、α－１，６グリコシド結合を介して互いに連結される。プルランは、真菌Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｕｍプルランによってデンプンから天然に産生され、一般に、約４．５×１０4～約６×１０5Ｄａの質量範囲を有し、様々な供給業者から市販されている（ＣＡＳ番号９０５７－０２－７）。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、デキストランであり、これは、グルコース反復単位を含む複合分岐鎖多糖類である。直鎖結合は、一般に、α－１，６グリコシド結合によって形成されるが、分岐は、典型的には、α－１，３結合から始まる。天然デキストランは、約９ｋＤａ～約２０００ｋＤａの範囲の分子量を有することができる。デキストランは、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓを含むある特定の細菌によって、スクロースから合成することができる。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓによって産生された市販のデキストラン（ＣＡＳ番号９００４－５４－０）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈを含む様々な供給業者から購入することができ、約１ｋＤａ～約６７０ｋＤａの範囲の様々な分子量範囲を有し得る。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、シクロデキストリンなどの環状糖類ポリマーである。典型的なシクロデキストリンは、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、及びγ－シクロデキストリンであり、これらはそれぞれ、６つ、７つ、及び８つのグルコピラノース単位を有する。グルコピラノース単位は、官能化することができる。例示的なシクロデキストリンは、ヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリンである。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、非硫酸化グリコサミノグリカンである。グリコサミノグリカンは、反復二糖類単位を有する直鎖多糖類であり、各反復単位は、１つのアミノ糖（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）と、ウロン糖（グルクロン酸またはイズロン酸）またはガラクトースのいずれかとを含む。例示的な非硫酸化グリコサミノグリカンは、反復二糖類が交互のβ－（１→４）及びβ－（１→３）グリコシド結合を介して連結されるＮ－アセチルグルコサミン及びグルクロン酸を含む、ヒアルロン酸である。ヒアルロン酸のポリマーは、サイズが５～２００００ｋＤａの範囲であり得る。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、セルロースであり、これは、直鎖反復β－１，４連結Ｄ－グルコース単位の多糖類である。天然繊維は、最大１０，０００個のグルコース単位で存在することができ、分子量は１０００Ｄａ超である。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、合成ポリマーである。合成ポリマーは、ホモポリマー、コポリマー、ブロックコポリマー（例えば、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー等）であり得る。好適なポリマーの非限定的な例としては、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートが挙げられるが、これらに限定されない。特定のポリマーの非限定的な例としては、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレンビニルアセテートポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン－コ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－ＰＥＯ－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－ＰＰＯ－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルカルシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリアルキレン（例えば、ポリエチレン及びポリプロピレン）、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ））及びそれらのコポリマー（例えば、ポロキサマー）、ポリアルキレンテレフタレート（例えば、ポリ（エチレンテレフタレート）等）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル（例えば、ポリ（酢酸ビニル）等）、ポリハロゲン化ビニル（例えば、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）等）、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化セルロース（例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等）、アクリル酸のポリマー（「ポリアクリル酸」）（例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリジオキサノン及びそのコポリマー（例えば、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート）、ポリオキシメチレン、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（バレル酸）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、トリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（１－ビニルピロリドン－コ－ビニルアセテート）（ＰＶＰ－ＶＡ）、ポリ（４－ビニルピリジン）、ポリ（４－ビニルピリジン－コ－ブチルメタクリレート）、ポリ（４－ビニルピリジン－コ－スチレン）、ポリ［４－ビニルピリジニウムポリ（フッ化水素）、メチルアクリレート（ｐ（ＭＡＡ－コ－ＭＭＡ））コポリマー、ポリ（１－ビニルピロリドン－コ－２－ジメチルアミノエチルメタクリレート）、ポリ（１－ビニルピロリドン－コ－スチレン）、ポリ（４－ビニルピリジニウム－ｐ－トルエンスルホネート）、ヒドロキシプロピルアセテートサクシネート（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシメチルプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）、ポリ（エチレン－アルト－プロピレン）（ＰＥＰ）、２－メチルアクリルアミドグルコピラノース（ＭＡＧ）、ジメチルアジプイミデート（ＤＭＡ）、ポリビニルカプロラクタム－ポリビニルアセテート、ならびにそれらのいずれかの混合物及びコポリマーが挙げられる。
いくつかの実施形態では、合成ポリマーは、ポリアルキレングリコールである。いくつかの実施形態では、合成ポリマーは、ポリアルキレングリコールコポリマーである。いくつかの実施形態では、合成ポリマーは、ポロキサマーなどの少なくとも１つのポリ（プロピレンオキシド）ブロックと少なくとも１つのポリ（エチレンオキシド）ブロックとを含むブロックコポリマーである。ポロキサマーは、２つのポリ（エチレンオキシド）ブロックに隣接する中央ポリ（プロピレンオキシド）ブロックを有する非イオン性のトリブロックコポリマーである。ポロキサマーは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）及びＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）を含む、ある特定の商品名によっても知られている。例示的なポロキサマーとしては、ポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８）及びポロキサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、化合物（すなわち、セレンテラジンまたはその類似体もしくは誘導体）及びポリマーは、約０．００１：１～約０．５０：１、または約０．００２５：１～約０．４０：１の重量比で組成物中に存在し得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、紙もしくは繊維マトリックスまたは他の材料をさらに含み、組成物は、紙もしくは繊維マトリックスまたは他の材料の中に、またはその上に配置される。いくつかの実施形態では、この材料は、セレンテラジン（またはその類似体もしくは誘導体）を実地試験などの多種多様な環境において使用することを可能にすることができる。いくつかの実施形態では、紙または繊維マトリックスは、１００％純綿リンタなどの高品質綿リンタから製造され得る。いくつかの実施形態では、紙または繊維マトリックスは、無灰であり得る。いくつかの実施形態では、紙または繊維マトリックスは、最大０．０６重量％の灰を含み得る。いくつかの実施形態では、紙または繊維マトリックスは、約０．１μｍ～約１ｍｍの厚さを有し得る。いくつかの実施形態では、紙または繊維マトリックスは、約０．０２μｍ～約１２μｍの孔径範囲を有し得る。紙または繊維マトリックスは、結合親和性、多孔性、官能化（例えば、高酸性官能基または高塩基性を有する）等を含む様々な特徴を有し得る。
例示的な紙または繊維マトリックスとしては、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）銘柄紙（例えば、Ｗ－９０３紙、ＦＴＡ紙、ＦＴＡ溶出紙、ＦＴＡ ＤＭＰＫ紙等）、Ａｈｌｓｔｒｏｍ紙（例えば、Ａ－２２６紙等）、Ｍ－ＴＦＮ紙、ＦＴＡ紙、ＦＰ７０５紙、Ｂｏｄｅ ＤＮＡ収集紙、ニトロセルロース紙、ナイロン紙、セルロース紙及び試料パッド（例えば、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＣＦＳＰ２０３００Ｍ）、Ｄａｃｒｏｎ紙、綿紙、ポリエステル紙（例えば、Ａｈｌｓｔｒｏｍポリエステル繊維グレード６６１３、Ａｈｌｓｔｒｏｍ処理ポリエステル繊維グレード６６１３Ｈ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、Ｎｏｖｉｐｌｅｘ（商標）血漿調製カード、Ａｈｌｓｔｒｏｍ ＣｙｔｏＳｅｐ（登録商標）、Ｃｏｂａｓ（登録商標）血漿分離カード、多孔質膜及び高分子膜、高純度綿繊維（例えば、Ａｈｌｓｔｒｏｍグレード２３７）、綿／レーヨン混合高純度綿（例えば、Ａｈｌｓｔｒｏｍグレード１２１８）、ガラス微小繊維（例えば、Ａｈｌｓｔｒｏｍ ９３４－ＡＨ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＧＦＤＸ１０３０００）、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
紙または繊維マトリックスの代わりに使用することができる他の潜在的な材料としては、有機もしくは無機材料（例えば、金属またはセラミック材料）、均質もしくは不均質な固体、液体、または溶解性錠剤化材料から作製される合成及び／またはポリマー膜が挙げられる。例示的な追加の材料としては、例えば、酢酸セルロース、セルロースエステル、セルロースエーテル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デンプン等が挙げられる。紙または繊維マトリックスの代わりに使用することができる追加の材料としては、プラスチックまたはガラスが挙げられる。いくつかの実施形態では、材料は、キュベット、スライド、プレート、またはプラスチックもしくはガラスで作製された任意の他の好適な表面であり得る。いくつかの実施形態では、材料は、金属表面であり得、金属は、単一の金属または金属合金、例えば、鋼、銅、真鍮、青銅、または銀である。
いくつかの実施形態では、組成物は、（ｉ）セレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体もしくは類似体、（ｉｉ）好適なポリマー、及び（ｉｉｉ）紙もしくは繊維マトリックス、またはガラス、プラスチック、もしくは金属などの他の表面を含む。
化合物及びポリマーならびに／または紙もしくは繊維マトリックスまたは他の表面に加えて、組成物は、緩衝液、界面活性剤、還元剤、塩、ラジカル捕捉剤、キレート剤、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせなどの追加の成分を含み得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、もしくはクエン酸緩衝液、または他の一般的な緩衝液、例えば、ビシン、トリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）等を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、リン酸緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、トリシンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸を含む。組成物はまた、緩衝液の任意の組み合わせも含むことができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、洗剤または界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、洗剤または界面活性剤は、約０．０１ｍｏｌ％～５ｍｏｌ％（例えば、０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％、１％、２％、５％、またはそれらの間の任意の範囲（例えば、０．１～０．５％））で存在する。例示的な界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び双性イオン性界面活性剤が挙げられる。非イオン性洗剤の例としては、Ｂｒｉｊ ３５、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘシリーズ（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１１４等などのオクチルフェニルエトキシレート）などのＴｒｉｔｏｎ（商標）界面活性剤、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレン（９）ドデシルエーテル、ジギトニン、オクチルフェニルポリエチレングリコール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ６３０）、ｎ－オクチル－ベータ－Ｄ－グルコピラノシド（ｂｅｔａＯＧ）、ｎ－ドデシル－ベータ－Ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリソルベート２０またはポリエチレングリコール（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０（ポリソルベート４０またはポリエチレングリコール（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリソルベート８０またはポリエチレングリコール（２０）ソルビタンモノオレエート）、ポリドカノール、ｎ－ドデシルベータ－Ｄ－マルトシド（ＤＤＭ）、ノニデットＰ４０－置換基、ＮＰ－４０ノニルフェニルポリエチレングリコール、Ｃ１２Ｅ８（オクタエチレングリコールｎ－ドデシル－モノエーテル）、ヘキサエチレングリコールモノ－ｎ－テトラデシルエーテル（Ｃ１４Ｅ０６）、オクチル－ベータ－チオグルコピラノシド（オクチルチオグルコシド、ＯＴＧ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８（ポロキサマー１８８）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７（ポロキサマー４０７）、サポニン、エマルゲン、ポリエチレングリコールトリメチルノニルエーテル、及びポリオキシエチレン１０ラウリルエーテル（Ｃ１２Ｅ１０）が挙げられる。イオン性洗剤（アニオン性またはカチオン性）の例としては、デオキシコレート、コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ－ラウロイルサルコシン、及びセチルトリメチルアンモニアンブロマイド（ＣＴＡＢ）が挙げられる。双性イオン性試薬の例としては、Ｃｈａｐｓ、双性イオン３－１４、及び３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネートが挙げられる。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０である。組成物はまた、界面活性剤の任意の組み合わせも含むことができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、システアミン、（２Ｓ）－２－アミノ－１，４－ジメルカプトブタン（ＤＴＢＡ）、チオ尿素、６－アザ－２－チオチミン（ＡＴＴ）等の還元剤を含み得る。いくつかの実施形態では、還元剤は、チオ尿素である。いくつかの実施形態では、還元剤は、ＡＴＴである。組成物はまた、還元剤の任意の組み合わせも含むこともできる。
いくつかの実施形態では、組成物は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム等の塩を含み得る。いくつかの実施形態では、塩は、塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態では、塩は、リン酸ナトリウムである。組成物はまた、塩の任意の組み合わせも含むことができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム等のラジカル捕捉剤を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、トランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－四酢酸などの金属キレート剤を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、アスコルビン酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、アスコルビン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、クエン酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、トランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－四酢酸を含む。組成物は、ラジカル捕捉剤及び／またはキレート剤の任意の組み合わせを含むことができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、完全な緩衝液組成物、例えば、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１２）、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質（ＬＣＳ）希釈緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０６）等を含み得る。完全な緩衝液組成物は、緩衝液自体、ならびに塩、金属キレート剤、還元剤、及び非イオン性界面活性剤のうちの１つ以上を含む、本明細書に開示される成分の組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、タンパク質を含み得る。例えば、組成物は、担体タンパク質を含み、下流アッセイで添加され得る発光酵素の表面吸着を防止することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、高度に精製された豚由来の皮膚コラーゲンのポリペプチド画分（例えばＰｒｉｏｎｅｘ）であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ゼラチンであり得る。組成物はまた、タンパク質の任意の組み合わせも含むことができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、溶媒を含み得る。いくつかの組成物は、任意の溶媒が除去され得るように完全に乾燥されるが、他の組成物は、溶媒またはいくつかの量の残留溶媒を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール等、またはそれらの任意の組み合わせなどの、有機溶媒を含み得る。例えば、組成物は、エタノールとプロピレングリコールの組み合わせを含み得る。
上記のように、組成物は、上記の成分の任意の組み合わせを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、タンパク質、緩衝液、及び還元剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、タンパク質、緩衝液、及び金属キレート剤を含むことができる。
組成物は、凍結乾燥粉末またはケーキの形態であり得る。そのような組成物は、以下にさらに記載される組成物の成分の混合物を凍結乾燥することによって調製することができる。粉末生成物は、ボトル、バイアル、スナップチューブ、マイクロタイタプレートなどの容器内に、紙もしくは繊維マトリックスまたは他の固体材料支持体上で、ラブオンチップ等に提供され得る。粉末生成物は、複数のスナップチューブに含まれ得、各チューブは、所定量の組成物を含有し、適切な量の溶液中に溶解され、目的のアッセイに直接使用され得る。
組成物はまた、「ドロップ」キャストまたはフィルムなどの硬質だが可鍛性である材料の形態であり得る。そのような組成物は、組成物の成分を含有する溶液を表面に適用し、組成物を乾燥させることによって、例えば、空気乾燥、周囲温度で乾燥させること、高温で（例えば、約３０℃～約７０℃、または約３０℃～約４０℃、例えば、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、または約７０℃の温度で）乾燥させること、不活性雰囲気下で乾燥させること、または真空下で乾燥させることによって調製することができる。ドロップキャストまたはフィルムは、ボトル、バイアル、スナップチューブ、マイクロタイタプレート、マイクロタイタプレートなどの容器内に、紙もしくは繊維マトリックスまたは他の固体材料支持体上で、ラブオンチップ等に提供され得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、溶液（例えば水溶液）の形態である。組成物が溶液である場合、組成物は、約５．５～約８．０、例えば、約６．５～約７．５のｐＨを有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、約５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０のｐＨを有する。
組成物はまた、緩衝液または生体試料などの試料中に落とすことができる溶解性錠剤またはカプセルを含む錠剤またはカプセルなどの他の形態で提供され得る。組成物はまた、９６ウェルプレートのウェルなどの表面上に予め形成されたフィルムとして含まれ得、それにより、組成物を適切な量の溶液中に直接溶解させ、目的のアッセイに直接使用することができる。
組成物が紙または繊維マトリックス上に提供される場合、紙または繊維マトリックスは、スポットを再構成し、目的のアッセイに直接使用することができるようにパンチすることができるスポットを有するカードの形態であり得る。代替的に、紙または繊維マトリックスは、目的のアッセイに使用するために再構成することができる、事前にパンチされたスポット（例えば、直径約１～５ｍｍ）の形態で提供され得る。組成物を含む紙または繊維マトリックスは、例えば、空気乾燥、周囲温度で乾燥させること、高温で（例えば、約３０℃～約７０℃、または約３０℃～約４０℃、例えば、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、または約７０℃の温度で）乾燥させること、不活性雰囲気下で乾燥させること、または真空下で乾燥させることによって乾燥することができる。
本開示の組成物は、ルシフェラーゼ基質、例えば、セレンテラジンならびにその類似体及び誘導体が使用されている任意の方法で使用され得る。例えば、それらは、試料中の１つ以上の分子、例えば、酵素、酵素反応のための補因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性化剤、もしくは・ＯＨラジカル、または１つ以上の条件、例えば、酸化還元条件を検出するために、セレンテラジン、またはその類似体もしくは誘導体を用いる生物発光法に使用され得る。試料は、動物（例えば、脊椎動物）、植物、真菌、生理学的流体（例えば、血液、血漿、尿、粘液分泌物）、細胞、細胞溶解物、細胞上清、または細胞の精製画分（例えば、細胞下画分）を含み得る。そのような分子の存在、量、スペクトル分布、発光動態、または特定の活性が検出または定量化され得る。分子は、多相溶液（例えば、エマルションまたは懸濁液）を含む溶液中で、または固体支持体（例えば、粒子、毛細血管、またアッセイ容器）上で、検出または定量化され得る。
ある特定の実施形態では、組成物は、目的の分子を定量化するために使用され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、特定の生化学活性、例えば、アポトーシスまたは薬物代謝のプローブとして使用することができる。
ある特定の実施形態では、組成物は、生細胞または動物における、例えば、インビボでの発光を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは（レポーターとしてまたはそれ以外として）細胞内で発現することができ、細胞は、組成物で処理される。セレンテラジン、またはその類似体もしくは誘導体は、培養物中の細胞を透過し、ルシフェラーゼと反応し、発光を生成する。いくつかの実施形態では、組成物は、より堅牢な生細胞ルシフェラーゼ系レポーターアッセイに使用することができる。さらに他の実施形態では、ルシフェラーゼ及び本開示の組成物を含有する試料（細胞、組織、動物等を含む）は、様々な顕微鏡及び撮像技術、例えば、インビボ撮像を使用してアッセイされ得る。さらに他の実施形態では、分泌性ルシフェラーゼは、生細胞レポーター系の一部として細胞内で発現される。
また、セレンテラジンまたはその類似体もしくは誘導体から選択される化合物を安定化させる方法も本明細書に提供され、この方法は、化合物を有効量のポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触させて組成物を形成することを含む。化合物は、熱分解、化学分解、光誘導分解、またはそれらの任意の組み合わせに対して安定化され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書の組成物は、（例えば、ポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触していないセレンテラジン化合物またはその類似体もしくは誘導体と比較して、）分解に対して化合物（すなわち、セレンテラジンまたはその類似体もしくは誘導体）を約－８０℃～約８０℃、約－７５℃～約８０℃、約－７０℃～約８０℃、約－６５℃～約８０℃、約－６０℃～約８０℃、約－５５℃～約８０℃、約－５０℃～約８０℃、約－４５℃～約８０℃、約－４０℃～約８０℃、約－３５℃～約８０℃、約－３０℃～約８０℃、約－２５℃～約８０℃、約－２０℃～約８０℃、約－１５℃～約８０℃、約－１０℃～約８０℃、約－５℃～約８０℃、約０℃～約８０℃、約－８０℃～約７５℃、約－８０℃～約７０℃、約－８０℃～約６５℃、約－８０℃～約６０℃、約－８０℃～約５５℃、約－８０℃～約５０℃、約－８０℃～約４５℃、約－８０℃～約４０℃、約－８０℃～約３５℃、約－８０℃～約３０℃、約－８０℃～約２５℃、約－２０℃～約６０℃、約－２０℃～約５５℃、約－２０℃～約５０℃、約－２０℃～約４５℃、約－２０℃～約４０℃、約－２０℃～約３５℃、約－２０℃～約３０℃、または約－２０℃～約２５℃の温度で安定化させる。
いくつかの実施形態では、本明細書の組成物は、（例えば、ポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触していないセレンテラジン化合物またはその類似体もしくは誘導体と比較して、）分解に対して化合物（すなわち、セレンテラジンまたはその類似体もしくは誘導体）を約－８０℃、－７９℃、－７８℃、－７７℃、－７６℃、－７５℃、－７４℃、－７３℃、－７２℃、－７１℃、－７０℃、－６９℃、－６８℃、－６７℃、－６６℃、－６５℃、－６４℃、－６３℃、－６２℃、－６１℃、－６０℃、－５９℃、－５８℃、－５７℃、－５６℃、－５５℃、－５４℃、－５３℃、－５２℃、－５１℃、－５０℃、－４９℃、－４８℃、－４７℃、－４６℃、－４５℃、－４４℃、－４３℃、－４２℃、－４１℃、－４０℃、－３９℃、－３８℃、－３７℃、－３６℃、－３５℃、－３４℃、－３２℃、－３１℃、－３０℃、－２９℃、－２８℃、－２７℃、－２６℃、－２５℃、－２４℃、－２３℃、－２２℃、－２１℃、－２０℃、－１９℃、－１８℃、－１７℃、－１６℃、－１５℃、－１４℃、－１３℃、－１２℃、－１１℃、－１０℃、－９℃、－８℃、－７℃、－６℃、－５℃、－４℃、－３℃、－２℃、－１℃、０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７５℃、または８０℃で安定化させる。組成物は、分解に対して化合物を約－８０℃、約－２０℃、約４℃、約２０℃、約２５℃、または約３７℃で安定化させ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書の組成物は、光の存在下で、（例えば、ポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触していないセレンテラジン化合物またはその類似体もしくは誘導体と比較して、）分解に対して化合物（すなわち、セレンテラジンまたはその類似体もしくは誘導体）を安定化させる。組成物は、ポリマーまたは紙もしくは繊維マトリックスを含有しない組成物と比較して、光の存在下で化合物の半減期を増加させ得る。組成物は、ポリマーまたは紙もしくは繊維マトリックスを含有しない組成物と比較して、光の存在下で化合物の半減期を約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４．０倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、または５．０倍以上増加させ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書の組成物は、（例えば、ポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触していないセレンテラジン化合物またはその類似体もしくは誘導体と比較して、）分解に対して化合物（すなわち、セレンテラジンまたはその類似体もしくは誘導体）を少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３５日間、４０日間、４５日間、５０日間、５５日間、６０日間、６５日間、７０日間、７５日間、８０日間、８５日間、９０日間、１００日間、１１０日間、１２０日間、１３０日間、１４０日間、１５０日間、１６０日間、１７０日間、１８０日間、１９０日間、２００日間、２１０日間、２２０日間、２３０日間、２４０日間、２５０日間、２６０日間、２７０日間、２８０日間、２９０日間、３００日間、３１０日間、３２０日間、３３０日間、３４０日間、３５０日間、３６０日間、１年間、２年間、３年間、４年間、または５年間安定化させる。
いくつかの実施形態では、組成物は、ポリマーまたは紙もしくは繊維マトリックスを含まない組成物と比較して、（例えば、ポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触していないセレンテラジン化合物またはその類似体もしくは誘導体と比較して、）分解に対して化合物（すなわち、セレンテラジンまたはその類似体もしくは誘導体）の半減期を少なくとも約１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、または２５倍増加させる。
また、セレンテラジン及びその類似体または誘導体から選択される化合物の溶解性を改善する方法も本明細書に提供され、この方法は、化合物を有効量のポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触させることを含み、セレンテラジン化合物及びその類似体または誘導体の溶解性が、ポリマーと接触していない化合物と比較して改善される。化合物の溶解性は、ポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触していない対応する化合物と比較して、水溶液中で改善され得る。化合物の溶解性は、凍結乾燥粉末、ドロップキャストフィルムもしくは「液滴」の再構成後にポリマーの存在下にある場合、または化合物がその上もしくは中に配置されている紙もしくは繊維マトリックスもしくは他の固体支持体材料の再水和から改善され得る。
組成物は、例えば、純水中での、または緩衝液、塩、タンパク質、還元剤、ラジカル捕捉剤、界面活性剤等、もしくはそのような成分の任意の組み合わせをさらに含むものなどの水溶液中での化合物（すなわち、セレンテラジンまたはその類似体もしくは誘導体）の溶解性を増加させ得る。組成物は、例えば、ｐＨが約６．５～約７．５（例えば、ｐＨが約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、もしくは７．５、またはそれらの間の任意の範囲）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝水溶液中での、またはＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液などの別の好適な緩衝液中での化合物の溶解性を増加させ得る。組成物は、例えば、対象由来の生体試料、培養培地（例えば、組織培養培地）等の生物学的または環境的流体中での化合物の溶解性を増加させ得る。
例えば、組成物は、ポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスを含有しない組成物と比較して、光の存在下で化合物の溶解性を約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４．０倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、または５．０倍以上増加させ得る。
また、セレンテラジン及びその類似体または誘導体から選択される化合物の再構成速度を改善する方法も本明細書に提供され、この方法は、化合物を有効量のポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触させることを含み、化合物の再構成速度が、ポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触していない化合物と比較して改善される。
組成物は、例えば、純水中での、または緩衝液、塩、タンパク質、還元剤、界面活性剤等、もしくはそのような成分の任意の組み合わせをさらに含むものなどの水溶液中での化合物の再構成速度を増加させ得る。組成物は、例えば、ｐＨが約６．５～約７．５（例えば、ｐＨが約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、もしくは７．５、またはそれらの間の任意の範囲）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝水溶液中での、またはＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液などの別の好適な緩衝液中での化合物の再構成速度を増加させ得る。組成物は、例えば、対象由来の生体試料、培養培地（例えば、組織培養培地）等の生物学的または環境的流体中での化合物の溶解性を増加させ得る。
例えば、組成物は、ポリマーを含有しない組成物と比較して、光の存在下で化合物（例えば、セレンテラジン化合物またはその類似体もしくは誘導体）の再構成速度を約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４．０倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、または５．０倍以上増加させ得る。
組成物は、本明細書に開示される特性の任意の組み合わせを有することができる。例えば、組成物は、本明細書に記載されるような溶解度の増加、本明細書に記載されるような再構成速度の改善、本明細書に記載されるような安定性の増加、及び／または本明細書に開示されるような半減期の増加を有し得る。組成物は、開示される特性のうちの１つまたは開示される特性の任意の組み合わせを有し得、他の改善された特性をさらに有し得る。
本明細書に記載される方法の実施形態では、接触ステップは、化合物（すなわち、セレンテラジンまたはその類似体もしくは誘導体）を第１の溶媒中に溶解して第１の溶液を形成するステップと、第１の溶液をポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと混合して混合物を形成するステップと、混合物を乾燥させるステップとを含み得る。いくつかの実施形態では、接触ステップは、化合物を第１の溶媒中に溶解して第１の溶液を形成するステップと、ポリマーを第２の溶媒中に溶解して第２の溶液を形成するステップと、第１の溶液と第２の溶液を混合して混合物を形成するステップと、混合物を乾燥させるステップとを含む。いくつかの実施形態では、接触ステップは、化合物を溶媒中に溶解して第１の溶液を形成するステップと、第１の溶液を紙または繊維マトリックスに適用するステップと、紙または繊維マトリックスを乾燥させるステップとを含む。いくつかの実施形態では、接触ステップは、化合物を第１の溶媒中に溶解して第１の溶液を形成するステップと、ポリマーを第２の溶媒中に溶解して第２の溶液を形成するステップと、第１の溶液と第２の溶液を組み合わせて第３の溶液を形成するステップと、第３の溶液を紙または繊維マトリックスに適用するステップと、紙または繊維マトリックスを乾燥させるステップとを含む。
いくつかの実施形態では、乾燥ステップは、凍結乾燥を含む。いくつかの実施形態では、乾燥ステップは、空気乾燥を含む。いくつかの実施形態では、乾燥ステップは、不活性雰囲気下（例えば、窒素またはアルゴン下）、周囲温度での乾燥を含む。不活性雰囲気下いくつかの実施形態では、乾燥ステップは、高温（例えば、３０℃）での乾燥を含む。いくつかの実施形態では、乾燥ステップは、真空乾燥を含む。いくつかの実施形態では、方法に使用される溶液のうちの１つまたは全ては、脱酸素化され得る。脱酸素化は、真空下で溶液を脱気することによって、または不活性ガス（例えば、窒素またはアルゴン）を溶液によって気泡形成させることなどによって達成することができる。
組成物は、それらをルシフェラーゼの基質として使用して発光を生成し、再構成後に組成物からの発光を分析することによって試験され得る。「発光」とは、適切な条件下での、例えば、セレンテラジン類似体などの好適な基質の存在下でのルシフェラーゼの光出力を指す。光出力は、セレンテラジン基質の添加時に開始され得る、発光反応の開始時に、光出力の即時またはほぼ即時測定（「Ｔ＝０」発光または「フラッシュ」と呼ばれる場合がある）として測定され得る。
様々な実施形態では、発光反応は、溶液中で行われる。溶液は、例えば、原核または真核発現系中の細胞由来の溶解物を含有し得る。溶液は、精製されたタンパク質、ペプチド、または発光酵素成分でタグ付けされた小分子を含有し得る。他の実施形態では、発現は無細胞系において生じるか、またはルシフェラーゼタンパク質が細胞外培地中に分泌され、後者の場合、溶解物を生成する必要がない。いくつかの実施形態では、反応は、適切な材料、例えば、本開示の組成物、緩衝液等を、発光タンパク質を含有する反応チャンバ（例えば、９６ウェルプレートなどのマルチウェルプレートのウェル、試験管またはバイアル、キュベット等）内に添加することによって開始される。反応チャンバは、例えば、ルミノメータ、光電子増倍管、またはカメラ（例えば、スマートフォンカメラ、ＣＣＤカメラ、または画像を記録することができる任意の他の手持ち式装置）を使用して光出力を測定することができる、読み取り装置に配置され得る。光出力または発光はまた、経時的に、例えば、同じ反応チャンバ内で数秒、数分、数時間等の一定の期間測定され得る。光出力または発光は、経時的な平均、シグナルの減衰の半減期、一定の期間にわたるシグナルの合計、またはピーク出力として報告され得る。発光は、相対光単位（ＲＬＵ）で測定され得る。ある特定の実施形態では、組成物は、それらをＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの基質として使用することによって試験され得る。
さらに他の実施形態では、ルシフェラーゼ及び／または組成物は、宿主に導入され、発光の測定は、宿主またはその一部において行われ、宿主またはその一部としては、生物全体、またはその細胞、組織、外植片、もしくは抽出物を挙げることができる。
他の実施形態では、発光反応は、固体支持体上で行われる。固体支持体は、例えば、ビーズ、樹脂、磁性粒子、膜、またはバイアル、マイクロタイタプレート、カセット、キュベット、もしくはスワブ等の表面であり得る。次いで、この反応は、特定の固体支持体形式からの光出力を測定することができる読み取り装置に配置され得る。
他の実施形態では、発光反応は、動物全体撮像のためにインビボで行われる。動物に基質を注射するためのビヒクルは、無毒で、哺乳動物生物学と高度に適合性があり、利用可能な選択肢を著しく制限するものでなければならない。プルラン及び本明細書に記載の多くの他のポリマーは、無毒で、食品添加物として承認すらされており、これにより、それらは注射用溶液の成分として特に適したものとなっている。加えて、フリマジンなどのセレンテラジン類似体の、ＰＢＳのような単純な緩衝液への溶解性及び再構成の改善は、静脈内注射、腹腔内注射、頭蓋内投与等による動物への投与に理想的である。組成物成分は、注射の直前に組み合わせることができ、優れた再構成は、試料を迅速に均質にさせ、これは、溶解していない微結晶の存在が致命的であり得る動物の作業にとって重要である。基質製剤が動物に導入されると（例えば静脈内または腹腔内注射）、鎮静された動物は、撮像チャンバ内に配置され、生体発光のインビボ産生について分析される。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、キットの一部として提供される。組成物は、単一の容器内に含有され得る。いくつかの実施形態では、キットは、ユーザが本明細書に開示されるものなどのアッセイを実施することを可能にするための好適な試薬及び説明書とともに、１つ以上のルシフェラーゼ（ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはその両方の形態で）をさらに含み得る。キットはまた、１つ以上の本明細書に開示されるものなどの緩衝液を含み得る。キットは、組成物及び／または組成物を含有する単一容器を保存するための説明書を含み得る。本開示のキットに含まれる説明書は、包装材料に貼付され得るか、または添付文書として含まれ得る。説明書は、典型的には、書面または印刷物であるが、そのようなものに限定されない。そのような説明書を保存し、それらをエンドユーザに伝達することができる任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「説明書」という用語は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
本明細書の実施形態の開発中に行われる実験は、本明細書に記載される組成物及び方法の有用性を実証する。別段指示されない限り、プルランは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＣＡＳ番号９０５７－０２－７）から入手した。
実施例で使用される略語には、以下が含まれる。ＡＴＴは６－アザ－２－チオチミンであり、ＥｔＯＨはエタノールであり、Ｆｚはフリマジンであり、ＨＰＬＣは高性能液体クロマトグラフィーであり、ＮＧＢはＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１２）であり、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水であり、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸である。
実施例１
フリマジン－プルラン組成物
試料を、以下のように調製した。以下の条件の各々について、全ての基質及び添加剤を、水中の様々なｗ／ｖパーセントのプルランの溶液中で列挙した濃度で組み合わせた。各場合において、ポリマーを含有する最終溶液中のエタノールの総量（ｖ／ｖ）が１０ｖ／ｖ％を超えないように、エタノール中のストック溶液から基質を添加した。
条件１：溶液を、水中の０、２．５、５、または１０％（ｗ／ｖ）のプルランで調製した。エタノール中３０ｍＭのフリマジンストック溶液を調製した。フリマジンストック４μＬを、プルランを含有する溶液４６μＬに添加し、フリマジンの最終濃度は２ｍＭであった。エタノールの総濃度は、全ての症例において、最終溶液中で１０ｖ／ｖ％未満であった。試料を凍結し、次いで一晩凍結乾燥して、粉末生成物を形成した。
条件２：１０ｖ／ｖ％未満のエタノール／水中の１５％（ｗ／ｖ）のプルラン、２００ｍＭのトリシン、及び２ｍＭのフリマジンの溶液を、上記のように調製した。一連の６０μＬのアリコートをパラフィルム上にピペットで移し、暗所で、２５℃で少なくとも３時間乾燥させて、硬質で可鍛性の「ドロップ」を形成した。
条件３：１０ｖ／ｖ％未満のエタノール／水中の１５％（ｗ／ｖ）のプルラン及び２ｍＭのフリマジンの溶液を、上記のように調製した。一連の６０μＬのアリコートをパラフィルム上にピペットで移し、暗所で、２５℃で少なくとも３時間乾燥させた。
試料を、製剤化フリマジンを必要に応じてボルテックスしながらＮＧＢまたはＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に溶解させることによって試験した。各場合において、試料を、５ｍＬの緩衝液中で最終作動濃度１０μＭのフリマジンに希釈した。
実験による結果は、以下のとおりである。２．５％（ｗ／ｖ）のプルランを含む条件１に従う試料は、ＮＧＢ及びＰＢＳ（ｐＨ７．０）中の溶液中に１分未満で容易に溶解した。５％（ｗ／ｖ）及び１０％（ｗ／ｖ）のプルランを含む条件１に従う試料は、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に数分以内で完全に溶解した。条件２に従う試料は、さらなるボルテックスを必要とし、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に完全に溶解するのに約１０～１５分を要した。プルランを含まない状態１に従う試料は、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に完全に溶解するのに約１０分を要した（実験により決定）。
試料を４℃で５週間保存した後、試料を、２０μＭのストックについて１倍ＮＧＢで６ｍＬに、または２０μＭストックについて１倍ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で６ｍＬに希釈した。精製したＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（Ｎｌｕｃ）ルシフェラーゼ酵素を、最終濃度１倍で添加した（２倍のストック溶液を、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ４９９の１０００倍のストックから開始して、ＰＢＳまたはＮＧＢのいずれかで調製している）。対照試料は、１０μＭの最終Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）基質を含むアッセイ緩衝液中にＮｌｕｃを含んだ。アッセイを、固体で白色の非結合表面（ＮＢＳ）プレート上で、１００μＬの総アッセイ体積で、総発光を収集するルミノメータ（具体的には、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）ディスカバーマルチモードマイクロプレートリーダ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号ＧＭ３０００）上の動態読み取りを使用して実施した。ＰＢＳ中で再構成した試料の動態トレースを図１Ａに示し、ＮＧＢ中で再構成した試料の動態トレースを図１Ｂに示す。図１Ｃは、凍結乾燥ケーキ及びフィルム液滴製剤の画像を示す。特定の時点における図１Ａからのデータを、図２Ａ～Ｃの棒グラフに提示し、特定の時点における図１Ｂからのデータを、図３Ａ～Ｃの棒グラフに提示する。
図１～３に例示する結果は、有機溶媒または特別な緩衝液条件を必要としない、中性緩衝液中のフリマジン組成物の溶解性の増加を実証する。フリマジン組成物からの発光は、市販のフリマジン製剤と比較して強い。
実施例２
再構成したフリマジン組成物の吸光度
固体フリマジンバルクを、エタノール中で最終濃度１０ｍＭに希釈した（溶液１）。乾燥プルランを純水中に溶解し、最終濃度を０ｗ／ｖ％、２．５ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％、１０ｗ／ｖ％、１５ｗ／ｖ％（それぞれ、溶液２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、及び２ｅ）にした。４５μＬの溶液２ａ～ｅを、別個の１．５ｍＬスナップチューブバイアルにピペットで移した。次いで、５μＬの溶液１を各バイアルに添加し、激しくピペット操作して混合し、各々が５０μＬの溶液中に最終濃度１ｍＭ（１９．０８μｇ）のフリマジンを含有する溶液３ａ～ｅを形成した。混合後、溶液３ａ～ｅを含有するバイアルを、ドライアイスの中に置いて、１時間凍結させた。次いで、これらの凍結ストックを、フリマジンを含有する乾燥プルランマトリックスを形成するために一晩凍結乾燥した。
プルランマトリックス（０ｗ／ｖ％～１５ｗ／ｖ％）中のフリマジン（１９．０８μｇ）の粉末製剤を、０．５ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．８）中に希釈し、室温で３０分間平衡化し、吸光度を２５４ｎｍで読み取った。ＰＢＳ緩衝液中での再構成後にプルランの量が増加した製剤化乾燥フリマジン（５０ｎｍｏｌ）の吸光度スペクトルを、図４Ａに示す。プルランを含む製剤化フリマジンは、水溶液中のフリマジン吸光度の増加をもたらした。フリマジンの濃度を、２５４ｎｍで測定した吸光度を有するメタノール中のフリマジンの絶滅係数（２１０００Ｍ-1ｃｍ-1）を使用して、ビールの法則によって決定した。フリマジンバルクは、０．００８２ｍＭの算出濃度に対応する、０．０５７１の吸光度を有した。２．５ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％のプルランを含むフリマジン製剤は、０．２２０４及び０．２４６７の吸光度をもたらし、それぞれ、０．０３２ｍＭ及び０．０３５ｍＭの算出濃度を得た。１０～１５ｗ／ｖ％のプルランを含む製剤化フリマジンは、０．３９６４及び０．３８３６の吸光度をもたらし、ＰＢＳ中、それぞれ、０．０５５ｍＭ及び０．０５２ｍＭの算出濃度を得た。図４Ａに表示される吸光度データの概要は、図４Ｃに見出すことができ、プルランを含有しない試料と比較して、フリマジンをプルランで製剤化する場合の溶液中のフリマジン（Ｆｚ）濃度の増加を示す。
別個に、上記の試料と同様に調製したプルランマトリックス（０ｗ／ｖ％～１５ｗ／ｖ％）中のフリマジン（９５．４μｇ）の乾燥製剤を、０．５ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．８）中に希釈し、室温で３０分間平衡化し、吸光度を２５４ｎｍで読み取った。ＰＢＳ緩衝液中での再構成後にプルランの量が増加した製剤化フリマジン（９５ｕｇ）の吸光度を、図４Ｂに示す。プルランマトリックスの濃度が増加した固体製剤化フリマジンは、プルランを含まないフリマジンのみを含有する条件と比較して、ＰＢＳ緩衝液中の吸光度、ひいてはフリマジン濃度の増加をもたらした。
実施例３
保存された試料の再構成
固体フリマジンをエタノール中に溶解し、溶解した溶液をプルラン（０または１５ｗ／ｖ％）の水溶液に添加し、１０ｖ／ｖ％未満のエタノールを含有する５０μＬの溶液中、総濃度１ｍＭのフリマジンを得た。試料は、凍結乾燥したか、または周囲温度下で乾燥させた。図５は、これらの組成物の、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に再構成する能力を実証する画像を示す。１５ｗ／ｖ％のプルランを含む、周囲温度下で乾燥させた「液滴」製剤は、短時間のピペット操作の後に溶液中に溶解した。１５ｗ／ｖ％のプルランを含む凍結乾燥試料は、ＰＢＳを添加した直後に溶解した。プルランを含まない試料は、１５分間のボルテックス後であってもＰＢＳ中に完全に溶解せず、ＰＢＳにおける溶解性が低いことを実証した。
実施例４
プルラン試料の吸光度
ＰＢＳ（ｐＨ６．８）中の無溶媒２．５ｗ／ｖ％のプルラン及び無溶媒１０ｗ／ｖ％のプルランの試料を、それらの吸光度について試験した。２１０～６００ｎｍの範囲にわたる吸光度スペクトルを、図６Ａ（２．５％）及び６Ｂ（１０％）に例示する。これらのスペクトルは、プルランがフリマジンと同じ波長範囲で吸収せず、フリマジンを含有する試料において人工的に吸光度シグナルを増強しないことを実証する。
実施例５
フリマジン試料のＨＰＬＣ分析
固体フリマジンバルクを、エタノール中で最終濃度１０ｍＭに希釈した（溶液１）。乾燥プルランを純水中に溶解し、最終濃度を０ｗ／ｖ％、２．５ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％、１０ｗ／ｖ％、または１５ｗ／ｖ％（それぞれ、溶液２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、及び２ｅ）にした。４５μＬの溶液２ａ～２ｅを、別個の１．５ｍＬスナップチューブバイアルにピペットで移した。次いで、５μＬの溶液１を各バイアルに添加し、激しくピペット操作して混合し、各々が最終濃度１ｍＭのフリマジンを含有する溶液３ａ～ｅを形成した。混合後、溶液３ａ～ｅを含有するバイアルを、ドライアイスの中に置いて、１時間凍結させた。次いで、これらの凍結ストックを一晩凍結乾燥して、フリマジンを含有する乾燥プルランマトリックスを形成した。
全てのＨＰＬＣトレースの一般的な方法：上記のフリマジン試料（フリマジン１９．０８μｇを含有）を、０．５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ６．８）で、小型スナップキャップチューブ中３８．１６μｇ／ｍＬに希釈した。この溶液１５μＬを無溶媒で、ＨＰＬＣ（挿入物を含むバイアル）上に５時間かけて注入し、経時的な安定性及び溶解性を評価した。機器：Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｍａｘ－ＲＰ ５０×４．６ｍｍ、２．５４ｕ。溶媒：０．１％のＴＦＡ／水、アセトニトリル。市販のフリマジン（５ｍＭ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３）を、ＰＢＳ中で３８．１６μｇ／ｍＬに希釈し、比較用にも実行した。
０．５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ６．８）で希釈した直後、及び希釈して５時間後の試料のＨＰＬＣトレースを得、それぞれ、図７（０％のプルラン－（Ａ）０時間、（Ｂ）５時間）、図８（２．５％のプルラン－（Ａ）０時間、（Ｂ）５時間）、図９（１５％のプルラン－（Ａ）０時間、（Ｂ）５時間）、及び図１０（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質－（Ａ）０時間、（Ｂ）５時間）に示す。（５％のプルラン及び１０％のプルラン製剤、ならびに市販のフリマジン試料についてのトレースも同様に得た。データは図示せず。）保持時間５．１０～５．１３分でのピーク（各スペクトルにおける主要ピーク）は、フリマジンを表す。保持時間５．３６～５．３７分でのピーク（アスタリスクでマークされる）は、フリマジンの既知の分解生成物であるアミノピラジン（分光学的に確認される）を表す。特定のピーク及び面積パーセントを、表１に要約する。
Figure 0007447101000003
図１１及び１２は、図７～１０に示されるＨＰＬＣトレースからの編集及び処理されたデータの分析を、追加の時点で同じ方法を介して得られたトレースとともに示す。
図１１Ａは、各トレースが時間０に正規化された２５４ｎｍでの吸光度によって測定した場合の各試料の純度の分析を示す。プルランを含む乾燥製剤として調製した全ての条件は、水溶液中で高レベルの純度を示し、吸光度の有意な損失はなかった。プルランを欠いた条件（０％条件、ならびに市販のフリマジン溶液、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３）は、化学分解に起因する約６時間にわたる吸光度のかなりの損失を示した。
図１１Ｂは、増加量（０ｗ／ｖ％～１５ｗ／ｖ％）のプルランを含むＰＢＳ中の製剤化フリマジン試料（５０ｎｍｏｌ）のピーク面積の分析を示す。（これらの分析は、図１１Ａで分析した同じトレースについてである）。図１１ａのグラフ中の市販のフリマジン及び０％条件の純度の損失は、ピーク面積の減少にも対応し、シグナルの損失が経時的な溶解度の変化に起因するものではなく、むしろ、実験の過程にわたるＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質及び０％のプルラン条件における生成物分解に起因することを示す。したがって、プルランの存在は、フリマジンの水溶性を改善するのに役立つだけでなく、溶液中のその分解を防止するのにも役立つ。
図１２は、上記のような試料中のフリマジンのアミノピラジン副生成物の形成を示す。このデータは、プルランの存在が、溶液中のアミノピラジンの形成を防止するのに役立ったことを示唆する。プルランを含有するフリマジンの製剤は、ＰＢＳ中での再構成後５．５時間にわたって最小限のアミノピラジン形成を示した。対照的に、プルランを欠くフリマジンバルク（０％条件）、ならびに市販のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質製剤の両方は、実験の過程にわたってアミノピラジンの約１２％の増加を示した。このデータは、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質及び０％のプルラン試料におけるフリマジン分解に起因する、図１１Ｂに示す純度の変化と一致する。
実施例６
紙マトリックス上のフリマジン組成物
紙スポットを、標準的な３．２ｍｍ手持ち式パンチ器（Ｄａｒｉｃｅ（登録商標）銘柄）を使用して、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから直径３．２ｍｍの円形「スポット」を押し出すことによって生成した。２００μＭ及び２μＭのフリマジンストック溶液をエタノール中で調製した。これらの溶液５μＬを各紙スポットに適用し、真空下で６０分間乾燥させた。次いで、これらのスポットを、暗所で、試験するまで４℃で保存した。
試験の時点で、各スポットを標準的な９６ウェルプレートの個々のウェルに入れ、２ｎｇ／ｍＬの最終濃度で精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（Ｎｌｕｃ）酵素を含有する１００μＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で再構成した。フリマジンの最終作動濃度は、それぞれ、１０μＭ及び０．１μＭであった。新たに調製した市販のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質を、比較のために１０μＭ及び０．１μＭで調製した。
結果を、図１３に例示する。図１３Ａは、紙スポット試料及び新たに調製した市販のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質試料の経時的なＲＬＵの変化を示す。図１３Ｂは、各試料の時間０における初期ＲＬＵを示す。図１３Ｃは、チューブ内のパンチされたスポットの画像を示す。これらの結果は、製剤化されたフリマジンを固体マトリックス／紙に乾燥させ、後に非有機水性緩衝液条件で再構成することができることを実証する。
実施例７
紙マトリックス上のフリマジン組成物
この実験は、国際特許公開第ＷＯ２０１４／１５１７３６号に開示される構造相補アッセイに基づくものである。アッセイ成分を含有するＷｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードを、２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、１０ｗ／ｖ％のスクロースを含有する４９５μＬのスクロースタンパク質緩衝液中に、５μＬのヤギ抗マウスＩｇＧ３－ＳｍＢｉＴ（０．４ｍｇ／ｍＬ）を最初に希釈することによって調製した。次いで、このストック溶液５μＬを、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３カード上の位置２及び４に添加し、３５℃で１時間乾燥させた。４９５μＬの同じスクロースタンパク質緩衝液中に、５μＬのヤギ抗マウスＩｇＧ３－ＬｇＢｉＴ（０．４ｍｇ／ｍＬ）を希釈し、この溶液５μＬを、位置２及び４としてＷｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質カードに直接添加した。次いで、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３カードを、３５℃で１時間、再び乾燥させた。
５ｍＭのフリマジンストックをエタノール中で調製し、このストック５μＬを、条件１、２、及び４のカード位置に添加した。次いで、カードを、高真空下に１５分間置いた。
カードを４℃または２５℃で維持し、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素コンジュゲートＩｇＧを添加することによって、活性についていくつかの時点で試験した。ＰＢＳ中の新たなＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）標識抗体１０ｐｇを、位置１に添加して、基質活性を試験した。画像を記録し、図１４Ａ（左－標準的なカメラで撮影した画像、中央－ＬＡＳ３００撮像器を使用して撮影した画像、右－ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）カメラで撮影した画像）に例示する。スポット１、２、及び４は全て、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素を添加すると、この時点で生物発光を生成し、基質が活性を維持していることを示す。
追加の試料のセットを同様に調製し、４℃または２５℃で３か月間保存した。画像を記録し、図１４Ｂ（左－標準的なカメラで撮影した画像、中央－スポット１、２、及び３への基質活性を決定するために、ＰＢＳ中の１０ｐｇのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）標識抗体を添加した後に４℃で保存したカードの画像（スポット４には、陰性対照としてＰＢＳのみを添加）、右－ＰＢＳ中の１０ｐｇのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）標識抗体を添加した後に２５℃で保存したカードの画像）に例示した。スポット２のみが光を生成したが、スポット１は光を生成しなかった。この実施例は、スクロースタンパク質負荷緩衝液の成分（２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、１０ｗ／ｖ％のスクロース）のうちの全てまたはいくつかが、この時点及び温度での基質活性に必要であり、フリマジンを固形紙マトリックス上で一緒に乾燥させ、４℃または２５℃のいずれかで長期間保存した後に再構成することができることを示す。
実施例８
緩衝液及び添加剤を含む紙マトリックス上のフリマジン組成物
この実施例の目的は、全体的な再構成効率及びアッセイ性能に対する添加剤の効果を実証することであった。様々な熱応力をシミュレートし、これらの条件下で全体的な性能及び安定性を試験するために、試料を異なる温度で保存した。
Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバスポットカード（３．２ｍｍパンチ）、スクロースタンパク質緩衝液（２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、１０ｗ／ｖ％のスクロース（使用前夜に調製））、エタノール中２００μＭのフリマジン溶液、水中２０ｍＭ及び５０ｍＭの６－アザ－２－チオチミン（ＡＴＴ）のストック、ならびに水中２０ｍＭ及び１００ｍＭのチオ尿素のストック。
３．２ｍｍのＷｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードのスポットに、エタノール中の２００μＭのフリマジン５μＬを、以下の様々な追加の成分とともに添加した。
試料１：フリマジン
試料２：フリマジン＋スクロースタンパク質緩衝液
試料３：フリマジン＋ＡＴＴ（２０ｍＭ）
試料４：フリマジン＋ＡＴＴ（５０ｍＭ）
試料５：フリマジン＋ＡＴＴ（２０ｍＭ）＋スクロースタンパク質緩衝液
試料６：フリマジン＋ＡＴＴ（５０ｍＭ）＋スクロースタンパク質緩衝液
試料７：フリマジン＋チオ尿素（２０ｍＭ）
試料８：フリマジン＋チオ尿素（１００ｍＭ）
試料９：フリマジン＋チオ尿素（２０ｍＭ）＋スクロースタンパク質緩衝液
試料１０：フリマジン＋チオ尿素（１００ｍＭ）＋スクロースタンパク質緩衝液
タンパク質緩衝液を含有するスポットを、他の成分（フリマジン、ＡＴＴ、及び／またはチオ尿素）を添加する前に、３５℃で１時間乾燥させた。ＡＴＴを使用した場合、５μＬの適切な溶液をスポットに添加し、続いて真空下で３０分間乾燥させた（２０ｍＭの溶液を使用した場合は最終濃度１ｍＭのＡＴＴ、５０ｍＭの溶液を使用した場合は最終濃度２．５ｍＭのＡＴＴを得た）。チオ尿素を使用した場合、５μＬの適切な溶液をスポットに添加し、続いて真空下で３０分間乾燥させた（２０ｍＭの溶液を使用した場合は最終濃度１ｍＭ、１００ｍＭの溶液を使用した場合は最終濃度５ｍＭを得た）。スポットを作製し、試験前に４℃で５日間保存した。
ＲＬＵ実験条件－アッセイ緩衝液：ＰＢＳ（ｐＨ７．０）、プレート：ＮＢＳ固体白色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３６００）。様々な最終濃度（２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、または０．２μｇ／ｍＬ）のＮｌｕｃ酵素を使用した。
データを図１５Ａ～Ｄに提示し、図１５Ａ～Ｃは、様々な濃度（それぞれ、２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、及び０．２μｇ／ｍＬ）のＮｌｕｃ酵素での発光反応からの生ＲＬＵを示し、図１５Ｄは、１つの濃度（０．２μｇ／ｍＬ）のＮｌｕｃ酵素での活性％を示す。このデータは、ＡＴＴまたはチオ尿素などの添加剤の添加が、他の製剤と比較して、ＰＢＳ中で再構成されると全体的なＲＬＵ及びシグナル安定性を改善するのに役立ち得ることを示唆する。
実施例９
異なるポリマーを有する紙マトリックス上のフリマジン組成物
材料及び方法：Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバスポットカード（３．２ｍｍパンチ）、フリマジン。タンパク質緩衝液を、以下に記載の成分を用いて試験の前日に調製した。
タンパク質緩衝液１：精製水
タンパク質緩衝液２：２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、１０ｗ／ｖ％のスクロース
タンパク質緩衝液３：２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、２．５ｗ／ｖ％のプルラン
タンパク質緩衝液４：２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、２．５ｗ／ｖ％のトレハロース
５μＬのタンパク質緩衝液１～４のうちの１つを各スポットに適用し、スポットを３５℃で１時間乾燥させた。次いで、新たに調製したエタノール中２００μＭのフリマジン溶液５μＬを、各スポットに適用し、スポットを、真空下で、３０分間乾燥させた。スポットを、暗所で、４℃、２５℃、及び３５℃で保存した。
発光測定のために、試験の時点で、各スポットを標準的な９６ウェルプレートの個々のウェルに入れ、８ｎｇ／ｍＬの最終濃度で精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（Ｎｌｕｃ）酵素を含有する１００μＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で再構成した。動態読み取りを直ちに開始した。
調製直後に試験したスポットからの結果を図１６に示し、比較のために、新たに調製したＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）基質のトレースを示す。４℃、２５℃、及び３７℃で１日間保存した後に試験したスポットからの結果を、それぞれ、図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｃに示す。４℃、２５℃、及び３７℃で３日間保存した後に試験したスポットからの結果を、それぞれ、図１８Ａ、図１８Ｂ、及び図１８Ｃに示す。これらのデータは、シグナルが紙マトリックス上のフリマジン組成物に対してより安定性であるが、全体的なシグナルがより低いことを示す。フリマジンをスポットに添加する前に、添加剤を含むタンパク質緩衝液を添加することにより、十分な量のフリマジンが紙に完全に浸透するのを妨いだ可能性があるが、試料は、依然として有用で安定したシグナルを生成した。
実施例１０
紙マトリックス中の製剤化フリマジン基質に対する加速安定性研究
紙フリマジン試料を試験して、既知のフリマジン製剤（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）基質、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３、及びＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０５）と比較して、ＲＬＵによって測定したフリマジンの熱安定性及び機能的完全性に対する製剤の効果を決定した。
Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバスポットカード（３．２ｍｍパンチ）を、以下のように処理した。
条件１及び２について、紙スポットを、５μＬの水（条件１）またはタンパク質緩衝液（２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、１０ｗ／ｖ％のスクロース－条件２）のいずれかで前処理した。条件３を、スクロース成分を欠いた５μＬのタンパク質緩衝液（２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ２０）の前処理で調製した。次いで、全ての条件を、３５℃で６０分間乾燥させた。上記のように、２００μＭのフリマジンストック溶液をエタノール中で調製し、このストック５μＬを、条件１及び２に添加した。条件３について、２００μＭのフリマジンストックを、水中２．５％のプルランと１０ｖ／ｖ％未満のエタノールとの混合物中に調製した。次いで、この溶液５μＬを条件３に添加し、次いで、全てのスポットを、減圧下でさらに３０分間乾燥させた。次いで、スポットを、暗所で、２５℃または６０℃のいずれかで保存した。測定時に、各条件から１つのスポットを個々のウェルに入れ、Ｎｌｕｃを含有するＰＢＳで希釈した。フリマジンの最終理論濃度は１０μＭであり、Ｎｌｕｃの最終濃度は１ｎｇ／ｍＬである。
編集したＲＬＵデータを、再構成及び試験前に、（Ａ）６０℃及び（Ｂ）２５℃で様々な期間保存された試料のデータとともに、図１９に示す。図１９はまた、再構成及び試験前に、（Ｃ）６０℃及び（Ｄ）２５℃で様々な期間保存された試料の、時間０での酵素活性パーセントのデータも示す。
上記の実験を拡張して、高濃度（最終濃度１ｍＭ及び１００μＭ）及び低濃度（最終濃度１０μＭ）のフリマジンを含んだ（図２０）。各条件を、上記のように調製した。スポットを、水、タンパク質緩衝液、またはスクロースを欠いたタンパク質緩衝液で前処理した。最初の２つの条件において、エタノール中２ｍＭまたは２００μＭのフリマジン溶液のいずれか５μＬを各スポットに添加し、次いで、３５℃でさらに３０分間乾燥させた。第３の条件では、フリマジンの２０ｍＭのストックまたは２００μＭのストックのいずれかを、水中２．５％のプルランと１０ｖ／ｖ％未満のエタノールとの混合物中に調製した。次いで、この溶液５μＬを条件３に添加し、全てのスポットを、３５℃でさらに３０分間乾燥させた。次いで、スポットを、暗所で、２５℃または６０℃のいずれかで保存した。
図２０は、再構成及び試験前に、（Ａ）６０℃及び（Ｂ）２５℃で様々な期間保存された試料の、編集したＲＬＵデータを示す。図２０はまた、再構成及び試験前に、（Ｃ）６０℃及び（Ｄ）２５℃で様々な期間保存された試料の、時間０での酵素活性パーセントのデータも示す。
フリマジンの負荷濃度を増加させることにより、最大ＲＬＵならびに活性パーセントの両方に全体的な改善がある。しかしながら、前処理（水）を受けなかったスポットは、タンパク質緩衝液または同等の濃度でプルランを含むタンパク質緩衝液を含有する前処理の両方と比較して、依然として全体的により良好な性能を発揮した。
実施例１１
紙試料中のフリマジン製剤の乾燥方法の効果
３．２ｍｍのパンチされたＷｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードのスポットを、水またはタンパク質緩衝液（２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、１０ｗ／ｖ％のスクロース）のいずれかで処理し、３５℃で１時間乾燥させた。エタノール中１０ｍＭのフリマジンのストック溶液を調製し、この溶液２０μＬを、水中２．５％（ｗ／ｖ）のプルランまたは５％（ｗ／ｖ）のプルランのいずれかの溶液９８０μＬに添加した。十分に混合した後、この溶液５μＬを各スポットに添加した。スポットを、暗所で、真空下または周囲温度下で２時間乾燥させた。乾燥後、スポットを、暗所で、４℃で一晩保存した。
試験のために、スポットを、９６ウェルＮＢＳプレートの個々のウェルに添加した。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の１．０６８ｎＭのＮｌｕｃ溶液１００μＬを、各ウェルに添加した。プレートをルミノメータに配置し、最大６０分間読み取った。各スポットにつき、３反復行った。
結果を図２１に示し、図２１Ａは真空下で乾燥した試料のデータを示し、図２１Ｂは周囲空気下で乾燥した試料のデータを示す。基質性能は、スポットを真空下で乾燥したか、または周囲温度下で乾燥したかによって有意に影響を受けないと見られる。
図２１Ｃは、プルランの存在が全体的なＲＬＵ出力を減少させることを示す図２１Ａの概要データを示す。実験による観察は、プルランの存在が、紙マトリックスの表面を硬質かつ蝋様にしたことを示した。これにより、基質のタンパク質への到達性が妨げられ、より低い光出力をもたらした可能性がある。この観察はまた、異なる成分を紙マトリックスに添加する順序が、全体的な機能において役割を果たし得ることを示す。
基質添加後に周囲温度下または３５℃のいずれかで２回目に乾燥させた追加のスポットのセットを比較した。各スポットを、水、スクロースタンパク質緩衝液（２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、１０ｗ／ｖ％のスクロース）、またはプルランタンパク質緩衝液（２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、２．５％のプルラン）のいずれかで前処理し、３５℃で１時間乾燥させた。２００μＭのフリマジンストックをエタノール中で調製し、このフリマジンストック５μＬを各スポットに添加した。次いで、スポットを、暗所で、周囲温度下または３５℃で３０分間放置した。次いで、スポットを、暗所で、２５℃または６０℃で最大５日間保存した。試験時に、各条件に対応するスポットを、標準的な９６ウェルプレートのウェルに入れ、各ウェルにおいて１００μＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．０）及び２ｎｇ／ｍＬのＮｌｕｃで、溶液中の最終濃度１０μＭのフリマジンに再水和した。
結果を、図２２に示す。３５℃で２回目に乾燥させたスポットは、より高いＲＬＵ出力を示し、次いで、周囲温度で２回目に乾燥させたスポットが示した。これらの結果は、条件（タンパク質緩衝液前処理または水対照）間で一貫していたか、またはスポットが２５℃もしくは６０℃で最大５日間保存されたかどうかにかかかわらず一貫していた（最大ＲＬＵ値を図２２Ａ及び２２Ｂに示し、活性％を図２２Ｃ及び２２Ｄに示す）。これらの結果は、乾燥方法の違いが全体的な基質性能に対して効果を有し、スポットの３５℃での２回目の乾燥が基質性能にとって好ましいことを示唆する。
実施例１２
粉末プルラン製剤に対する加速基質試験
粉末フリマジン試料を試験して、既知のフリマジン製剤（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）基質、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３、及びＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０５）と比較して、ＲＬＵ及びＨＰＬＣの両方によって測定したフリマジンの熱安定性及び機能的完全性に対するプルラン製剤の効果を決定した。
材料及び方法：固体フリマジンバルクをエタノール中で最終濃度１０ｍＭに希釈し（溶液１）、乾燥プルランを純水中に溶解し、最終濃度を０ｗ／ｖ％、２．５ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％、１０ｗ／ｖ％、及び１５ｗ／ｖ％（それぞれ溶液２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、及び２ｅ）にした。４５μＬの溶液２ａ～ｅを、別個の１．５ｍＬスナップチューブバイアルにピペットで移した。次いで、５μＬの溶液１を各バイアルに添加し、激しくピペット操作して混合し、各々が最終濃度１ｍＭのフリマジンを含有する溶液３ａ～ｅを形成した。
混合後、溶液３ａ～ｅを含有するバイアルを、ドライアイスの中に置いて、１時間凍結させた。次いで、これらの凍結ストックを一晩凍結乾燥して、フリマジンを含有する乾燥プルランマトリックスを形成した。
試験のための特定の粉末フリマジン試料を、以下のように調製した。
１）０％のプルランを含む粉末製剤として調製した１ｍＭ（合計５０ｎｍｏｌ）のフリマジンストック
２）２．５％のプルランを含む粉末製剤として調製した１ｍＭ（合計５０ｎｍｏｌ）のフリマジンストック
３）５％のプルランを含む粉末製剤として調製した１ｍＭ（合計５０ｎｍｏｌ）のフリマジンストック
４）Ｎ１１３溶液（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３）として調製した１ｍＭ（合計５０ｎｍｏｌ）のフリマジンストック
５）Ｎ２０５溶液（ＰｒｏｍｅｇａカタログＮ２０５）として調製した１ｍＭ（合計５０ｎｍｏｌ）のフリマジンストック（注記：Ｎ２０５溶液は、Ｎ１１３溶液の約１５時間後に作製した）
６）フリマジンバルク（５０ｎｍｏｌ、エタノール中のストック溶液から取られた）
ＨＰＬＣ試験の前に、試料の半分を２５℃で保存し、半分を６０℃で、試験前に長期間保存した。ＨＰＬＣ試験のために、製剤化フリマジン（１９．０８μｇ）を、小型スナップキャップチューブ中の０．５ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．８）で希釈した。チューブを約１５秒間ボルテックスし、次いで、暗所で、室温で３０分間平衡化した。１５μＬの試料を無溶媒で、ＨＰＬＣ（挿入物を含まないバイアル）、０．１％のＴＦＡ／水、アセトニトリル、Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｍａｘ－ＲＰ ５０×４．６ｍｍ、２．５４ｕ上に注入した。６０℃で０時間（図２３Ａ）または４８時間（図２３Ｂ）保存した後の５ｗ／ｖ％のプルランを含む試料のＨＰＬＣトレースは、最小限の分解のみを示す。６０℃で０時間（図２４Ａ）または４８時間（図２４Ｂ）保存した後のＮ１１３試料のＨＰＬＣトレースは、有意により多くの分解を示す。
ＨＰＬＣデータを他の試料について得（図示せず）、データを処理して、熱安定性トレースを図２５に示した。曲線の下の面積を測定し、３５日間にわたってプロットした。「バルク」は、製造された固体フリマジンを指す。「０％のプルラン」は、エタノールのストック溶液中に溶解させ、水（プルランを含まない）に添加し、凍結乾燥させたフリマジンを指す。図２５Ａ及び２５Ｂは、生ピーク面積として２５℃及び６０℃での熱安定性を示し、一方、図２５Ｃ及び２５Ｄは、ピーク面積パーセントとして２５℃及び６０℃での熱安定性を示す。固体フリマジンからなる製剤は、室温または６０℃で保存した場合に、高レベルで一貫した化学的完全性を示した。対照的に、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３）及びＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０５）溶液は、高温で保存した場合に、測定された時間にわたってピーク高さ及び面積のかなりの損失を示した。
発光測定のために、粉末フリマジン試料番号１～５をＰＢＳ中で再構成し、試料番号６をエタノール中で再構成した（全て５００μＬ）。試料を、室温で３０分間平衡化した。次いで、試料を、１：５（１００μＭ～２０μＭ）に、次いで１：１００（２０μＭ～０．２μＭ）に、さらに希釈した。この溶液５０μＬを、９６ウェルプレートのウェルに添加し、バックグラウンドを読み取り、次いで、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（Ｎｌｕｃ）酵素を添加した。（添加前に、市販のＮｌｕｃ試料ストックをＰＢＳ中で２ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈し、５０μＬを各ウェルに添加した。）希釈後、最終濃度は、０．１μＭのフリマジン及び１ｎｇ／ｍＬのＮｌｕｃであった。次いで、ＲＬＵを決定した。（バックグラウンドは、Ｎｌｕｃを添加しない２倍基質溶液の読み取り値である。）
編集したＲＬＵデータを、図２６に示す。各グラフの凡例の数値は、以下の製剤に対応する。１－０％のプルラン（注記－この試料は、溶解性の問題を経験し、完全に再構成されていない可能性がある）、２－２．５％のプルラン凍結乾燥ケーキ製剤、３－５％のプルラン凍結乾燥ケーキ製剤、４－Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３）、５－Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質（Ｎ２０５）、６－（エタノール中で再構成した）フリマジンバルク。図２６Ａ～Ｃに示すのは、上記のように、試料を、５０μＭの基質（図２６Ａ）、１０μＭの基質（図２６Ｂ）、または０．１μＭの基質（図２６Ｃ）を使用して再構成及び試験する前に、６０℃で様々な期間保存した後のデータである。図２６Ｄ～Ｆに示すのは、上記のように、試料を、５０μＭの基質（図２６Ｄ）、１０μＭの基質（図２６Ｅ）、または０．１μＭの基質（図２６Ｆ）を使用して再構成及び試験する前に、２５℃で様々な期間保存した後のデータである。
図２７は、酵素活性パーセントについてのデータを示す。各グラフの凡例の数値は、以下の製剤に対応する。１－０％のプルラン（注記－この試料は、溶解性の問題を経験し、完全に再構成されていない可能性がある）、２－２．５％のプルラン凍結乾燥ケーキ製剤、３－５％のプルラン凍結乾燥ケーキ製剤、４－Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３）、５－Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質（Ｎ２０５）、６－（エタノール中で再構成した）フリマジンバルク。図２７Ａ～Ｃは、上記のように、試料を、５０μＭの基質（図２７Ａ）、１０μＭの基質（図２７Ｂ）、または０．１μＭの基質（図２７Ｃ）を使用して再構成及び試験する前に、６０℃で様々な期間保存した後の時間０における酵素活性を示し、図２７Ｄ～Ｆは、上記のように、試料を、５０μＭの基質（図２７Ｄ）、１０μＭの基質（図２７Ｅ）、または０．１μＭの基質（図２７Ｆ）を使用して再構成及び試験する前に、２５℃で様々な期間保存した後の時間０における酵素活性を示す。
固体フリマジン試料は、高温に曝露した後のルシフェラーゼアッセイにおけるＲＬＵ出力によって示すように、一貫した化学的完全性を示した。対照的に、市販のＮ１１３及びＮ２０５溶液中に製剤化されたフリマジンは、高温で保存された後の経時的な発光シグナルの損失を示した。（注記：試料６をエタノール中に溶解し、より高い濃度でＮｌｕｃ酵素活性を阻害した。）
実施例１３
製剤化フリマジンフィルムコーティングマイクロタイタプレート
製剤化フリマジンフィルムを、マイクロタイタプレート上に直接形成した。２．５％（ｗ／ｖ）のプルランまたは５％（ｗ／ｖ）のプルランのいずれかに２００ｍＭのフリマジンを含有するフィルムを、マイクロタイタプレートのウェル中に直接調製した。この形式の代表的な画像は、図２９に見られる（明確さと提示目的のために人工的に着色）。ウェルコーティングを、以下のように調製した。エタノール中２ｍＭのフリマジンストックを調製した（溶液１）。別個に、２．５ｗ／ｖ％及び５ｗ／ｖ％のプルランの溶液を水中で調製した（それぞれ、溶液２及び溶液３）。溶液２または溶液３のいずれか４５μＬを、標準的な９６ウェルプレートの個々のウェルに添加した。次いで、５μＬの溶液１を、溶液２または溶液３のいずれかを含有するウェルの各々に添加し、完全にピペット操作して混合した。最終溶液中のエタノール濃度は、５ｖ／ｖ％未満でなければならない。より高いエタノール濃度は、プルランの溶液からの沈殿を引き起こす。
次いで、プレートを、暗所で、周囲条件下で３時間乾燥させた。ウェル中のフィルムは、１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）及び２ｎｇ／ｍＬのＮｌｕｃを、直ちに、またはシェーカー上の５０μＬ／ウェルのＰＢＳ中で３０分間事前平衡化した後のいずれかで各ウェルに添加することによって、全ての条件について溶液中の最終濃度１０μＭのフリマジンに再水和した。ＲＬＵを読み取り、新たに調製した市販のフリマジン基質（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０５）と比較した。データを、図２８に示し、（ａ）は、事前平衡化を伴わない生ＲＬＵとしてのデータを示し、（ｂ）は、事前平衡化を伴わない活性としてのデータを示し、（ｃ）は、事前平衡化を伴う生ＲＬＵとしてのデータを示す。この実施例は、フリマジンを硬質表面上のプルラン系フィルムに乾燥させ、指定された時間で再構成することができることを強調する。視覚的観察に基づいて、フィルムはまた、固体フリマジンバルクよりも迅速かつ完全に再構成した。このデータはまた、ＰＢＳマイクロタイタプレート中のフリマジン－プルラン系フィルムの事前平衡化が、光出力の有意な低下をもたらしたことも示す。
図２９は、上記と同じ方法を使用して、ただしフィルムコーティングを可視化することができるように食品着色料を添加して作製した、フリマジンフィルム化プレートの画像を示す。
図３０Ａは、図２８に提示したデータについて記載したものと同じ形式であるが、ただしフリマジンの負荷濃度がより高く（１００μＬ中の最終濃度２０μＭ）、場合によっては、フリマジン製剤が、完全溶液として一緒にフィルム化されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素を含有する、調製物の動態読み取りを示す。図３０Ｂは、図３０Ａに記載したものと同じ実験の活性パーセントを示す。図３０Ｃは、約３５％の活性が１０日目に残存している、保存期間後のフィルム化マイクロタイタプレートの安定性研究の結果を示す。
実施例１４
製剤化フリマジンの純度、安定性、及び副生成物形成についてのＨＰＬＣ及び質量分析
凍結乾燥プルランマトリックス中の製剤化フリマジンを、０ｗ／ｖ％、２．５ｗ／ｖ％、及び５ｗ／ｖ％のプルラン中のフリマジン１９．０７μｇで、実施例１２に記載したように調製した。フリマジンバルク、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３）、及びＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０５）を含む試料を、２５℃または６０℃のいずれかで３５日間保存した。試料をＰＢＳ緩衝液中で、またはフリマジンバルク試料及び０％のプルラン試料の場合はエタノール中で再構成し、室温で３０分間平衡化させ、次いで、フリマジン分解経路の既知の副生成物についてＨＰＬＣ上で分析した。吸光度データを、図３１に示す（Ａ－フリマジンバルク、Ｂ－０％のプルラン、Ｃ－２．５％のプルラン、Ｄ－５％のプルラン、Ｅ－Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質、及びＦ－Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質）。いずれの場合においても、固体形態の製剤化フリマジンは、市販の溶液系保存製剤（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３及びカタログ番号Ｎ２０５）と比較して、有意に少ない分解生成物を示した。
図３２は、フリマジンピークに対する個々の副生成物の面積パーセントを示す（Ａ－フリマジンバルク、Ｂ－０％のプルラン、Ｃ－２．５％のプルラン、Ｄ－５％のプルラン、Ｅ－Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質、及びＦ－Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質）。固体プルラン製剤では、フリマジンは、特に室温で保存した場合（各条件の左のバー）、最小量の副生成物形成を伴う主要ピークがある。対照的に、２５℃（左のバー）または６０℃（右のバー）のいずれかで保存した場合、３５日後に、市販の製剤中に保存した場合のフリマジンのほぼ完全な損失があった。
実施例１５
室温で６か月間保存した製剤化フリマジン組成物の基質活性
１９μｇのフリマジンを凍結乾燥ケーキとして製剤化したか、またはフィルム液滴を実施例１、条件１及び３に記載したように１５ｗ／ｖ％プルラン中で調製した。試料を、周囲光の存在下で、２５℃で６か月間保存した。両方の製剤を、１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）及び１ｎｇ／ｍＬのＮａｎｏＬｕｃ（Ｎｌｕｃ）で、溶液中の最終濃度１０μＭのフリマジンに再構成した。ＲＬＵを読み取り、新たに調製した市販のフリマジン基質（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０５）と比較した。この実験の結果を、図３３に示す（Ａ－生ＲＬＵ、Ｂ－時間０からの活性パーセント）。周囲温度及び周囲光で６か月保存した後、プルランマトリックス中の製剤化固体フリマジンは、ルシフェラーゼに曝露された場合に依然として生存可能であった。
実施例１６
異なる固体支持体マトリックス上の製剤化フリマジン活性及び安定性
４つの異なる種類の紙を、基質の保持及び基質の完全性に対する効果を含む異なる特性について試験した。紙の種類には、以下が含まれる。
１．ガラス繊維厚型：Ｇｌａｓｓ Ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ ９３４－ＡＨ（Ａｈｌｓｔｒｏｍ、粒子保持：１．５μＭ、厚さ：４３５μｍ）、
２．ガラス繊維薄型：ガラス繊維診断パッド（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＧＦＤＸ１０３０００、ロット番号４９５３６２、
３．セルロース：セルロース試料パッド（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＦＳＰ２０３００Ｍ ロット番号１１０６５、及び
４．Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカード
各紙試料を、７×７ｍｍの正方形に切断した。１０ｍＭのフリマジンストックを調製し、このストック１０μＬを各紙マトリックスに添加した。試料を、３５℃で３０分間乾燥させた。カードを、暗所で、２５℃または６０℃のいずれかで７２時間保存した。次いで、試料をガラスバイアルに入れ、１ｍＬのエタノールを添加した。バイアルを１０秒間超音波処理し、溶媒を抽出し、濾過し、分析ＨＰＬＣによって分析した。これらの実験の結果を、図３４に示す。図３４Ａは、紙または繊維マトリックスから抽出した後のフリマジンピークの生面積を示す。紙から抽出され、溶液から分析されるフリマジンの量は、紙の種類によっても影響を受ける（図３４Ｂ）。抽出して溶液中に戻した基質については、フリマジンバルクと比較して、フリマジンを紙または繊維マトリックス上に乾燥させた場合のフリマジンの分解速度がわずかに速い。加えて、フリマジン基質を効果的に乾燥させ、様々な固体表面から再構成することができる（図３４Ｃ）。
追加の実験を行って、レポータータンパク質であるＬｇＴｒｉｐと併用して紙上の基質安定性を決定した。紙表面を調製するために、２００μＬの５ｕＭのＬｇＴｒｉｐ（３５４６）（配列番号３、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第６２／６８４，０１４号を参照されたい）、５ｍＭのＡＴＴ、及び５ｍＭのアスコルビン酸を含有するバイアルを調製した。この溶液約５μＬを各スポットに添加し、次いで、スポットを３５℃で１時間乾燥させた。乾燥後、エタノール中１ｍＭのフリマジンストックを調製した。この溶液約５μＬを各スポットに添加し、３５℃でさらに３０分間乾燥させた。
異なる材料を、基質及びＬｇＴｒｉｐ入力で試験した。試験の時点で、新たなＮｌｕｃを添加して、基質を単離した。図３５Ａは、新たなＮａｎｏＬｕｃを乾燥ＬｇＴｒｉｐ及び基質に添加した場合の表面の再構成から得られる３つの異なる固相材料（Ｗｈａｔｍａｎ ９０３、Ａｈｌｓｔｒｏｍ ２３７、及びＡｈｌｓｔｒｏｍ ６６１３Ｈ）における生物発光シグナルを示す。Ａｈｌｓｔｒｏｍ ６６１３Ｈは、経時的なシグナル出力に有害であると見られる。全体的に、アッセイ成分の安定性は、それらが浸漬される固体マトリックス材料の組成物によって影響を受け得る。
図３５Ｂは、ＬｇＴｒｉｐならびに基質の両方を含有し、周囲条件下で２５日間にわたって保存したＷｈａｔｍａｎ ９０３紙からの生物発光シグナルを示す。スポットを、試験の時点でＰＢＳ中の１ｎＭのジペプチドに曝露した。全体的に、この実験は、周囲温度下での長期保存時間後に、材料からのシグナルの有意な損失がないことを示す。
実施例１７
異なる固体支持体マトリックス上の製剤化フリマジン活性及び安定性に対する添加剤の効果
異なる添加剤を溶液中でフリマジンと組み合わせ、紙表面上で乾燥させた。これらの実験は、紙マトリックス内で乾燥させながら、全体的な基質の完全性を改善することを目的とした。１０ｍＭのアスコルビン酸溶液を、エタノール中で調製した。次いで、この溶液をフリマジンバルクに添加して、エタノール中に１：１のアスコルビン酸及びフリマジンを含有する溶液を作製した。次いで、この溶液１０μＬを、以前の実施例に記載したものと同じ紙マトリックスに添加した。試料を、３５℃で３０分間乾燥させた。カードを、暗所で、２５℃または６０℃のいずれかで７２時間保存した。試料をガラスバイアルに入れ、１ｍＬのエタノールを添加した。バイアルを１０秒間超音波処理し、溶媒を抽出し、濾過し、分析ＨＰＬＣによって分析した。
これらの実験の結果を、図３６に記載する。フリマジンピークの生面積を図３６Ａにプロットし、アスコルビン酸添加剤を含有しなかった試料よりもフリマジンの吸光度が良好であることを示す。この効果は、フリマジンの溶液への全体的な回収パーセント（図３６Ｂ）、ならびにフリマジン純度（図３６Ｃ）においても観察された。純度は約１５～２０％増加し、アスコルビン酸の存在が、紙上に保存された場合のフリマジン基質の熱分解または化学分解を制限するのに役立つことを示唆した。
実施例１８
製剤化フリマジン活性及び安定性に対する異なる固体支持体マトリックスの化学的前処理の効果
紙マトリックス（Ａｈｌｓｔｒｏｍ Ｇｌａｓｓ Ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ ９３４－ＡＨ及びＷｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカード）を、３０ｗ／ｖ％のクエン酸の溶液中に３０分間浸し、次いで、３５℃で一晩乾燥させた。ＥｔＯＨ中の１０ｍＭのフリマジンストックを調製し、１０μＬのストックを７×７ｍｍの紙カードに添加し、３５℃で３０分間乾燥させた。次いで、カードを、暗所で、室温または６０℃で７２時間保存した。読み取りの時点で、カードを１ｍＬのエタノールで抽出し、１５秒間超音波処理した。次いで、抽出した溶媒を濾過し、分析ＨＰＬＣ上に注入した。
これらの実験の結果を、図３７に示す。フリマジンピークの生面積を、図３７Ａに示す。フリマジン基質を適用する前に３０％のクエン酸溶液で紙マトリックスを前処理することは、クエン酸で前処理しなかった紙マトリックスと比較して、エタノールへの抽出後の全体的な基質の純度に対して最小限の影響を与えた（図３７Ｃ）。また、エタノールで抽出した後に溶液中に回収された基質の量の改善も限定的であった（図３７Ｂ）。
実施例１９
製剤化フリマジン活性及び安定性に対する異なる固体支持体マトリックスの機械的前処理の効果
紙マトリックス（Ａｈｌｓｔｒｏｍ Ｇｌａｓｓ Ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ ９３４－ＡＨ及びＷｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカード）を水中に３０分間浸し、次いで、紙マトリックス内に存在する孔を崩壊または収縮させるために、減圧下で一晩乾燥させた。エタノール中１０ｍＭのフリマジンストックを調製し、１０μＬのストック溶液を７×７ｍｍの紙カードに添加し、３５℃で３０分間乾燥させた。次いで、カードを、暗所で、室温または６０℃で７２時間保存した。読み取りの時点で、カードを１ｍＬのエタノールで抽出し、１５秒間超音波処理した。抽出した溶液を濾過し、分析のために分析ＨＰＬＣ上に注入した。
この実験の結果を図３８に示し、フリマジンピークの生面積を図３８Ａに示し、回収パーセントを図３８Ｂに示し、純度を図３８Ｃに示す。以前に圧力下で乾燥させた紙と前処理していない紙とに添加し乾燥させた基質間で、基質の純度、または溶液への回収に関して、有意な改善はない。
実施例２０
異なる固体支持体マトリックス上の製剤化フリマジン活性及び安定性に対する添加剤の効果
異なる添加剤を溶液中でフリマジンと組み合わせ、紙表面上で乾燥させた。この一連の実験は、固体マトリックス内で乾燥させながら、全体的な基質の完全性を改善するのを助けることを目的とした。１０ｍＭのクエン酸溶液を、エタノール中で調製した。この溶液をフリマジンバルクに添加して、エタノール中に１：１のクエン酸及びフリマジンを含有する溶液を作製した。次いで、この溶液１０μＬを、以前の実施例に記載したものと同じ紙マトリックスに添加した。試料を、３５℃で３０分間乾燥させた。カードを、暗所で、２５℃または６０℃のいずれかで７２時間保存した。試料をガラスバイアルに入れ、１ｍＬのエタノールを添加した。バイアルを１０秒間超音波処理し、溶媒を濾過し、分析ＨＰＬＣによって分析した。
これらの実験の結果を、図３９に記載する。フリマジンピークの生面積を、クエン酸の存在下（Ａ）及び非存在下（Ｂ）で紙に乾燥させたフリマジンについて、図３９Ａ及び３９Ｂにプロットする。２５４ｎｍでの純度を、クエン酸の存在下（Ｃ）及び非存在下（Ｄ）で紙で乾燥させたフリマジンについて、図３９Ｃ及び３９Ｄにプロットする。プロットは、クエン酸との混合物中で乾燥させた場合、より良好なフリマジンの吸光度を示す。この吸光度の増加は、純度の約１０～２０％の増加に対応し、クエン酸の存在が、この実験の過程にわたってフリマジン基質の熱化学分解を制限するのに役立つことを示唆する。
実施例２１
スクロースタンパク質負荷緩衝液の存在下での製剤化フリマジン活性及び安定性に対するクエン酸及びアスコルビン酸の効果
フリマジン活性及び安定性に対するクエン酸及びアスコルビン酸の効果を、スクロースタンパク質緩衝液（２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、１０ｗ／ｖ％のスクロース）の存在下または非存在下で試験した。スポットを、上記のように、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから調製した。各スポットを、スクロースタンパク質緩衝液または水のいずれかで前処理し、３５℃で１時間乾燥させた。２００μＭのフリマジンストックを、エタノール中で、または２００μＭのクエン酸もしくは２００μＭのアスコルベートのいずれかを含むエタノール溶液中で調製した。フリマジン、または等しいモル濃度でクエン酸もしくはアスコルビン酸を含有するフリマジン溶液５μＬを、各スポットに添加した。次いで、スポットを、３５℃で１時間、再び乾燥させた。次いで、これらのスポットを、暗所で、２５℃で最大１２日間保存した。
試験時に、各条件に対応するスポットを、標準的な９６ウェルプレートのウェルに入れ、各ウェルにおいて１００μＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．０）及び２ｎｇ／ｍＬのＮｌｕｃで、溶液中の最終濃度１０μＭのフリマジンに再水和した。ＲＬＵを読み取り、新たに調製した市販のフリマジン基質（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０５）と比較した。これらの実験の結果を、図４０に示す。
スクロースタンパク質緩衝液で前処理した紙スポットでは、１２日間にわたってシグナルのかなりの損失を示した（図４０Ａ）。これらの結果は、１２日間にわたってかなりの安定性及びシグナル出力を示した、水で、またはアスコルビン酸もしくはクエン酸の存在下で水で前処理した条件と比較して、基質の活性パーセントのほぼ完全な損失に対応する（図４０Ｂ）。これらの結果の概要を、図４０Ｃに示す。アスコルビン酸及びクエン酸は、特に水のみの前処理と比較して、紙表面上に乾燥及び保存した場合に、基質の完全性を維持するのに役立ち得る。しかしながら、スクロースタンパク質緩衝液内の１つ以上の成分は、長期保存及び再構成のための基質の生存力に悪影響を与え得る。
実施例２２
フリマジン活性及び安定性に対する、単離したまたはバルクでのスポットの保存
特定の保存手順の効果を、上記のようにＷｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから調製した紙スポットにおいて試験した。各スポットを水で前処理し、次いで、３５℃で１時間乾燥させた。２００μＭのフリマジンストックをエタノール中で調製し、この溶液５μＬを各スポットに添加した。次いで、スポットを、３５℃でさらに３０～６０分間乾燥させた。次いで、スポットを分離し、キャップ付きチューブに個々に、または１つのバイアルに一緒に、暗所で、２５℃で最大１２日間保存（バルク保存）した。試験時に、各条件に対応するスポットを、標準的な９６ウェルプレートのウェルに入れ、各ウェルにおいて１００μＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．０）及び２ｎｇ／ｍＬのＮｌｕｃで、溶液中の最終濃度１０μＭのフリマジンに再水和した。これらの実験の結果を、図４０に記載する。
個々に保存されたスポットは、バルクで保存されたスポットよりも高い最大ＲＬＵを示した（図４１Ａ）。これらの結果は、観察された活性パーセントと一致する（図４１Ｂ）。これらの結果は、保存方法もまた、全体的な基質性能に対して効果を有し得ることを示唆する。個々の容器内での保存は、バルクで保存されたスポットと比較して、光、空気、及び水分などの有害要因への環境的曝露を制限するのに役立ち得る。バルクで保存されたスポットは、スポットを試験のために取り出す度に、これらの環境要因に曝露される。
実施例２３
反応ウェルからスポットを除去した後のシグナル生成
スポットを、実施例６に記載されるように、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから調製した。各スポットを、スクロースタンパク質緩衝液（２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、１０ｗ／ｖ％のスクロース）または水のいずれかで前処理し、３５℃で１時間乾燥させた。２００μＭのフリマジンストックを、エタノール中で、または２００μＭのシトレートもしくは２００μＭのアスコルベートのいずれかを含むエタノール溶液中で調製した。フリマジン、または等しいモル比のシトレートもしくはアスコルベートを含有するフリマジン溶液５μＬを、スポットに添加した。次いで、スポットを、３５℃でさらに１時間乾燥させた。次いで、スポットを、暗所で、２５℃で最大５日間保存した。
試験の時点で、スポットを、２ｎｇ／ｍＬのＮｌｕｃ酵素を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．０）で再構成し、ＲＬＵを動態学的に読み取った。４５分後、スポットをウェルから物理的に除去し、新たなＰＢＳ溶液（ｐＨ７．０）及び２ｎｇ／ｍＬのＮｌｕｃを含有する新しいウェルに入れ、動態ＲＬＵシグナルを、スポットを以前含有していたウェル、及び移した紙スポットを含有する新しいウェル上で読み取り続けた。図４２Ａは、スポットを以前含有していたウェル、及びスポットを移した新しいウェルの動態ＲＬＵ値を示す（基質製剤の後に＋によって示される）。ＲＬＵ結果の概要を、図４２Ｂに示し、４５分での元の読み取りＲＬＵからのＲＬＵ結果、除去直後の現在空のウェル、及び新たな酵素を含有する新しいウェルへスポットを移した直後に取ったＲＬＵ値を比較する。元のスポット読み取りから、スポットが除去されたウェルへのＲＬＵ値の変化はなく、これは、基質が紙マトリックスから放出され、周囲の溶液中に平衡化されることを示した。移したスポットを含有するウェルにおいて、より低いシグナルを回収し、これは、基質製剤が紙マトリックス自体内にいくらか保持されていることを示す。スポットをウェルから移す前に存在したＲＬＵシグナルと、スポットを除去したか、または新しいウェルに入れた後に残存しているシグナルとを比較することによって、各条件についてシグナル回収パーセントを算出した（図４２Ｃ）。スポットを新たなＰＢＳ溶液（ｐＨ７．０）及び２ｎｇ／ｍＬのＮｌｕｃを含有する新しいウェルに移した後、シグナルパーセントの約半分を新しいウェルで観察した。これは、残留基質が紙自体に残存した一方で、基質のほとんどが元のウェルの溶液中に放出されたことを示す。
実施例２４
フリマジン活性及び安定性に対するＢＳＡ及び糖類の効果
ＢＳＡ及び糖成分が、固体表面上で乾燥させて再構成した後のフリマジン活性及び安定性に対して効果を有したかどうかを決定するために、１０の異なるバージョンのタンパク質負荷緩衝液を調製した。調製及び試験した緩衝液は、以下のとおりである。
１．タンパク質緩衝液１：２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、１０ｗ／ｖ％のスクロース
２．タンパク質緩衝液２：２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、１０ｗ／ｖ％のスクロース、５ｍＭのアスコルベート
３．タンパク質緩衝液３：２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、１０ｗ／ｖ％のスクロース
４．タンパク質緩衝液４：２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、１０ｗ／ｖ％のスクロース、５ｍＭのアスコルベート
５．タンパク質緩衝液５：２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０
６．タンパク質緩衝液６：２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、５ｍＭのアスコルベート
７．タンパク質緩衝液７：２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、２．５％のプルラン
８．タンパク質緩衝液８：２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、５ｗ／ｖ％のＢＳＡ、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、２．５％のプルラン、５ｍＭのアスコルベート
９．タンパク質緩衝液９：２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、２．５％のプルラン
１０．タンパク質緩衝液１０：２０ｍＭのＮａ3ＰＯ4、０．２５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ ２０、２．５％のプルラン、５ｍＭのアスコルベート
各緩衝液のｐＨを決定し、表２に列挙した。
Figure 0007447101000004
スポットを、実施例６に記載されるように、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから調製した。各スポットを、緩衝液１～１０のいずれかで処理し、次いで、３５℃で１時間乾燥させた。２００μＭのフリマジンストックをエタノール中で調製し、この溶液５μＬを各スポットに添加した。次いで、スポットを、３５℃でさらに１時間乾燥させた。試験時に、各条件に対応するスポットを、標準的な９６ウェルプレートのウェルに入れ、各ウェルにおいて１００μＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．０）及び２ｎｇ／ｍＬのＮｌｕｃで、溶液中の最終濃度１０μＭのフリマジンに再水和した。ＲＬＵを読み取り、新たに調製した市販のフリマジン基質（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０５）と比較した。
これらの結果を、図４３に記載する。ＢＳＡを除去することによって、シグナルのわずかな減少があり、これをアスコルベートの存在下で戻した（緩衝液３及び緩衝液４、図４３Ａ）。しかしながら、スクロース成分を除去した場合に、シグナルの有意な減少を観察した（緩衝液５及び緩衝液６）。このシグナルは、アスコルベートの存在下で、またはスクロース成分を２．５ｗ／ｖ％のプルランで置き換えた場合には戻らなかった（緩衝液７及び緩衝液８）。ＢＳＡとスクロースの両方が負荷緩衝液中に存在しなかった場合に、最も低いシグナルを観察した。
動態結果を、図４３Ｂに示す。スクロース、ＢＳＡのいずれか、または両方を欠く条件では、実験の経過にわたってシグナルが急激に減少し、これは、他の条件では観察されなかった。アスコルベートの存在は、これらの条件におけるシグナル減衰速度を制限した（緩衝液３対緩衝液４、緩衝液５対緩衝液６、または緩衝液９対緩衝液１０）。これらの差異は、活性パーセントの明瞭な変化に対応する（図４３Ｃ）。緩衝液３、５、及び９は、溶液動態のＲＬＵ読み取りにおいて悪化した。また、これらの緩衝液は、最も高いｐＨ値を有し、ｐＨが、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３紙上の基質性能においても役割を果たし得ることを示した（表２）。
実施例２５
フリマジン活性及び安定性に対する個々の緩衝液成分の効果
特定の緩衝液成分が、固形紙表面上に保存されている間にフリマジン活性及び安定性に対して効果を有したかどうかを決定するために、８つの異なるタンパク質負荷緩衝液を調製した。調製及び試験した緩衝液は、以下のとおりである。
１．緩衝液１：水
２．緩衝液２：水＋５ｍＭのアスコルベート
３．緩衝液３：ＢＳＡ
４．緩衝液４：ＢＳＡ＋５ｍＭのアスコルベート
５．緩衝液５：Ｎａ3ＰＯ4＋Ｔｗｅｅｎ ２０
６．緩衝液６：Ｎａ3ＰＯ4＋Ｔｗｅｅｎ ２０＋５ｍＭのアスコルベート
７．緩衝液７：ＢＳＡ＋Ｎａ3ＰＯ4＋Ｔｗｅｅｎ ２０
８．緩衝液８：ＢＳＡ＋Ｎａ3ＰＯ4＋Ｔｗｅｅｎ ２０＋５ｍＭのアスコルベート
紙スポットに添加する前に、全ての緩衝液のｐＨを７に固定した。
スポットを、実施例６に記載されるように、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから調製した。各スポットを、緩衝液１～８のいずれかで処理し、次いで、３５℃で１時間乾燥させた。２００μＭのフリマジンストックをエタノール中で調製し、この溶液５μＬを各スポットに添加した。次いで、スポットを、３５℃でさらに１時間乾燥させた。試験時に、各条件に対応するスポットを、標準的な９６ウェルプレートの別個のウェルに入れ、各ウェルにおいて１００μＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．０）及び２ｎｇ／ｍＬのＮｌｕｃで、溶液中の最終濃度１０μＭのフリマジンに再水和した。ＲＬＵを読み取り、新たに調製した市販のフリマジン基質（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０５）と比較した。
これらの結果を、図４４に示す。アスコルベート、ＢＳＡ、またはそれら２つの組み合わせのいずれかを含有した緩衝液で前処理したスポットは、暗所で、２５℃で保存されている間、８日間にわたって良好な安定性を示した（図４４Ａ）。ＢＳＡまたはアスコルベートのいずれかを欠き、高レベルの塩を含むＴｗｅｅｎ ２０を含有した条件は、生シグナルのかなりの損失を示した。最初の数日間にも、活性パーセントの顕著な損失があった（図４４Ｂ）。これらの結果は、Ｔｗｅｅｎ ２０及び／または高塩の存在が、全体的なＲＬＵ出力の減少によって見られるように、固体表面上に乾燥及び保存されている間に基質の完全性に悪影響を与え得ることを示唆する。アスコルビン酸の存在は、この効果に対抗するのに役立つ。０日目からの代表的な動態トレースを、図４４Ｃに示す。シグナル損失の速度は、タンパク質緩衝液（緩衝液１または緩衝液２）の成分を欠く条件において、より速い。
実施例２６
フリマジン活性及び安定性に対するＰｒｉｏｎｅｘの効果
ＢＳＡをＰｒｉｏｎｅｘで置き換えることが、固体表面上に保存されている間にフリマジン活性及び安定性に対して効果を有したかどうかを決定するために、６つの異なるタンパク質負荷緩衝液を調製した。試験した緩衝液は、以下のとおりである。
１．緩衝液１：水
２．緩衝液２：水＋５ｍＭのアスコルベート
３．緩衝液３：１ｖ／ｖ％のＰｒｉｏｎｅｘ
４．緩衝液４：１ｖ／ｖ％のＰｒｉｏｎｅｘ＋５ｍＭのアスコルベート
５．緩衝液５：０．５ｖ／ｖ％のＰｒｉｏｎｅｘ
６．緩衝液６：０．５ｖ／ｖ％のＰｒｉｏｎｅｘ＋５ｍＭのアスコルベート
各緩衝液のｐＨを、ｐＨ７に維持した。
スポットを、実施例６に記載されるように、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから調製した。各緩衝液を、緩衝液１～６のいずれかで処理し、次いで、３５℃で１時間乾燥させた。２００μＭのフリマジンストックをエタノール中で調製し、この溶液５μＬを各スポットに添加した。次いで、スポットを、３５℃でさらに３０分間乾燥させた。次いで、スポットを、暗所で、２５℃で最大２０日間保存した。試験時に、各条件に対応するスポットを、標準的な９６ウェルプレートの別個のウェルに入れ、各ウェルにおいて１００μＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．０）及び２ｎｇ／ｍＬのＮｌｕｃで、溶液中の最終濃度１０μＭのフリマジンに再水和した。ＲＬＵを読み取り、新たに調製した市販のフリマジン基質（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０５）と比較した。結果を、図４４に記載する。
全ての場合において、実験の経過にわたって高レベルのＲＬＵ出力を観察した水で前処理した状態のみが、３週間にわたっていくらかのシグナル損失を示した（図４５Ａ）。試験の１日目の動態データを、図４５Ｂに示す。Ｐｒｉｏｎｅｘの存在は、一度再構成するとシグナルを安定化し、Ｐｒｉｏｎｅｘを欠く条件と比較して、シグナル減衰を制限するのに役立つ。
実施例２７
製剤化フリマジン活性及び安定性に対するＡＴＴの効果
ＡＴＴの存在が、固形紙表面上に保存されている間にフリマジン活性及び安定性に対して効果を有したかどうかを決定するために、６つの異なるタンパク質負荷緩衝液を調製した。調製及び試験した負荷緩衝液は、以下のとおりである。
１．水＋５ｍＭのアスコルベート
２．水＋５ｍＭのアスコルベート＋５ｍＭのＡＴＴ
３．１％のＰｒｉｏｎｅｘ＋５ｍＭのアスコルベート
４．１％のＰｒｉｏｎｅｘ＋５ｍＭのアスコルベート＋５ｍＭのＡＴＴ
５．０．５％のＰｒｉｏｎｅｘ＋５ｍＭのアスコルベート
６．０．５％のＰｒｉｏｎｅｘ＋５ｍＭのアスコルベート＋５ｍＭのＡＴＴ
各緩衝液のｐＨを、ｐＨ７に制御した。
スポットを、実施例６に記載されるように、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３タンパク質セーバカードから調製した。各緩衝液を、緩衝液１～６のいずれかで処理し、次いで、３５℃で１時間乾燥させた。２００μＭのフリマジンストックをエタノール中で調製し、この溶液５μＬを各スポットに添加した。次いで、スポットを、３５℃でさらに１時間乾燥させた。次いで、スポットを、暗所で、２５℃で最大２３日間保存した。試験時に、各条件に対応するスポットを、標準的な９６ウェルプレートの別個のウェルに入れ、各ウェルにおいて１００μＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．０）及び２ｎｇ／ｍＬのＮｌｕｃで、溶液中の最終濃度１０μＭのフリマジンに再水和した。ＲＬＵを読み取り、新たに調製した市販のフリマジン基質（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０５）と比較した。結果を、図４５に記載する。
全ての場合において、高いＲＬＵ出力を観察した（図４６Ａ）。また、２２日間保存した後のスポットからの動態トレースは、実験の経過にわたって高い安定したシグナルも示す（図４６Ｂ）。本発明の条件の全ては、周囲温度下での固体表面上の基質活性及び保存安定性に好ましい。
実施例２８
マイクロタイタプレートに向けて凍結乾燥した製剤化フリマジン
フリマジンを調製し、マイクロタイタプレートウェル内に直接凍結乾燥した。調製により、５％（ｗ／ｖ）のプルラン中の２００μＭまたは２ｍＭのフリマジンの凍結乾燥粉末製剤を含有するウェルを得、標準的な９６ウェルマイクロタイタプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３９１２）のウェル内に直接調製した。この形式の代表的な画像を、図４７Ａに示す。プレートを、以下のように調製した。エタノール中２ｍＭ及び２００μＭのフリマジンストックを調製した（溶液１）。別個に、５ｗ／ｖ％のプルランの溶液を水中で調製した（溶液２）。４５μＬの溶液２を、個々のウェルに添加した。次いで、５μＬの溶液１を、溶液２を含有するウェルの各々に添加し、完全にピペット操作して混合した。５μＬの純粋エタノールを、陰性対照として溶液２に添加した。プレートを、ドライアイス上に置いて１時間凍結させ、次いで、一晩凍結乾燥させた。
フリマジンケーキを含有するプレートを、各ウェルにおいて１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）及び２ｎｇ／ｍＬのＮｌｕｃで、それぞれ、最終濃度１０μＭまたは１００μＭのフリマジンに再水和した。ＲＬＵを読み取り、新たに調製した市販のフリマジン基質（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０５）または５ｗ／ｖ％のプルランの存在下での新たなＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質と比較した。動態データを、図４７Ｂに示す。この実施例は、凍結乾燥粉末製剤形式を、マイクロタイタプレートなどの固体表面上に直接調製し、ＰＢＳなどの水性緩衝液を使用して再構成することができることを示す。
実施例２９
基質添加のための層状形式
図４８は、基質または検出成分のいずれかをそれぞれ含有する、個々の紙カード上の別個の表面成分、または同じ表面の別個に処理された成分を含む、２成分層状系の予測例を示す。使用時に、表面の両側を、各表面を互いに密接に接触して保持するように、一緒に折り畳む。次いで、目的の分析物を含有する試料溶液を、折り畳んだ表面材料に添加する。溶液の存在により、異なる成分が固体マトリックス内で再水和及び混合され、生体発光複合体の相補的誘導形成をもたらす。このプロセスは、基質と組み合わせて光を生成し、次いで、この光を検出及び分析することができる。
実施例３０
基質製剤に対するアスコルビン酸ナトリウムの効果
１体積のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１３）を、０～３００ｍＭの範囲の濃度でアスコルビン酸ナトリウムを含有する、５０体積のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１２）と組み合わせた。溶液を３７℃でインキュベートした後、いくつかの時点でアッセイした。製造業者の説明書に従って使用されるＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（実験過程中－２０℃で保存し、各時点について再構成した）を、陽性対照として使用した。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素を発現する細胞培養物を、各時点の試料として使用した。１体積の再構成したＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液を、１体積の試料と混合した。３分後、発光強度を、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ（登録商標）Ｈ１ ９６ウェルプレートリーダで測定した。各試料について、発光強度をバックグラウンド減算し、－２０℃の対照シグナルに正規化した。
アスコルビン酸ナトリウムのＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液への添加は、図４９に示すように、再構成後の試薬活性の損失を低減する。基質を、３００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを含有するＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液中で再構成し、３７℃で２３時間保持する場合、発光強度は、アスコルビン酸ナトリウムの不在下で３８％と比較して、対照の６６％である。３７℃で４１時間後、発光強度は、９％と比較して３１％である。安定化効果は、アスコルビン酸ナトリウムの量が減少するとともに減少する。３ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを含有する緩衝液条件からの結果は、実験エラーに起因する可能性が最も高いことに留意されたい。
実施例３１
基質製剤に対するヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリンの効果
４倍のフリマジン溶液を、２００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）、２００ｍＭのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）、及び６００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを含有する緩衝液中でストックを１：２５に希釈することによって調製した。この溶液を、Ｖｉｒｔｉｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｐｒｏ（登録商標）凍結乾燥機を使用して、４８時間凍結乾燥した。次いで、これらの凍結乾燥調製物を、実験期間中、高温（３７℃）で保存した。２４時間及び４８時間後、ペレットをＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液中で再構成し、その結果、溶液中の成分の最終濃度は、２倍のフリマジン（ストックから１：５０希釈）、１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１００ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ、及び３００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムであった。比較のために、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）基質をＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液中で調製し、実験期間中、３７℃でインキュベートした。製造業者の説明書に従って使用されるＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）基質（実験過程中－２０℃で保存し、各時点について再構成した）を、陽性対照として使用した。各場合において、１体積の再構成したＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質を、１体積の試料と混合した。３分後、発光強度を、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ ９６ウェルプレートリーダで測定した。ＮａｎｏＬｕｃを発現する細胞培養物を、試料として使用した。各試料について、発光強度をバックグラウンド減算し、－２０℃の対照シグナルに正規化した。
図５０に示すように、凍結乾燥前にＨＰ－β－ＣＤ及びアスコルビン酸ナトリウムを緩衝液に添加することにより、ペレットを（溶媒を添加することなく）Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）緩衝液中に直接溶解させ、３７℃で４８時間にわたって安定性を維持することができた。３７℃でインキュベートしたＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液中の作動濃度Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）基質の非凍結乾燥溶液は、同じ時間が経過した後、活性の９０％の減少を示した。加えて、ペレットを標準的なキット調製物と比較する場合、いくつかのシグナル増強を観察したことに留意することが重要である。
実施例３２
基質製剤に対する個々の及び組み合わせた緩衝添加剤の効果
フリマジンを、緩衝液中に以下の最終組成物で１：５０に希釈した。
－Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）緩衝液
－Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）＋３００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム
－Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）緩衝液＋１００ｍＭのヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）
－Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）＋３００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム＋１００ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ
ＮａｎｏＬｕｃを発現する１体積の細胞培養物を、１体積の各緩衝液に添加し、混合した。３分後、発光強度を、標準的なプレートリーダで測定した。同じ手順に従って、バックグラウンド強度を、１体積の細胞培養培地を各緩衝液と混合することによって測定した。
これらの実験結果は、ＨＰ－β－ＣＤがシグナル増強の主要な原因物質であることを示唆する。図５１Ａに示すように、ＨＰ－β－ＣＤは、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）緩衝液を単独で含む溶液と比較して、１５～２０％シグナルを増強する。レポーター酵素が存在しない場合のバックグラウンドシグナル（図５１Ｂ）は、シグナルの増加がバックグラウンドシグナルの増加に起因しないことを示した。
実施例３３
基質安定性に対する混合ポリマー基質製剤の効果
Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）基質（１：５０希釈）の調製物を、２００ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ、６００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、及び１０ｗ／ｖ％のプルランを含有するＭＥＳ（ｐＨ６．０）溶液中で凍結乾燥した。凍結乾燥後、バイアルに手でキャップをした（真空下ではない）。いくつかのバイアルを、３７℃のインキュベータに保存し、一方、他のバイアルを、室温でラボベンチ上に放置した。各測定の前に、バイアルを、各成分の最終濃度が１００ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ、３００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、及び５％のプルランとなるように、元の体積の２倍で再水和した。製造業者の説明書に従って使用されるＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）基質（実験過程中－２０℃で保存し、各時点について再構成した）を、陽性対照として使用した。各場合において、１体積の再構成したＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質を、１体積の試料と混合した。３分後、発光強度を、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ ９６ウェルプレートリーダで測定した。ＮａｎｏＬｕｃを発現する細胞培養物を、試料として使用した。各試料について、発光強度をバックグラウンド減算し、－２０℃の対照シグナルに正規化した。
図５２に示すように、凍結乾燥調製物中のプルランの存在は、室温及び３７℃で保存される場合、基質がその活性を１５日間にわたって保持することを可能にする。プルランの添加は、酸素及び水分に対するバリアを提供すると考えられ、前述の添加剤と組み合わせた場合、フリマジンの活性を数週間～数か月間にわたって保持する可能性を有する安定化マトリックスを提供する。不活性ガスと組み合わせた場合、この保存方法は、この基質の非常に長期間の安定性を達成する見込みを示す。
実施例３４
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７で製剤化したＪＲＷ－０２３８
２．５ｍｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をまとめて、５ｍＬスナップトップエッペンドルフチューブに入れた。ポリマーを、溶解するまで水浴中で７０℃に加熱し、透明な溶液にした。セレンテラジン類似体であるＪＲＷ－０２３８の１７４ｍＭのストックを、ＥｔＯＨ中で調製した。このストック５μＬを溶融ポリマーに添加し、ピペット操作して混合した。２つの別個の条件を調製した。条件１－基質を添加した後、基質／ポリマー溶液を、高真空下で３０分間乾燥させた。条件２－基質を添加した後、基質／ポリマー溶液を４５μＬの水でさらに希釈し、一晩凍結乾燥した。最終的な乾燥製剤化基質の代表的な例を、図５３に示す。
条件１及び２の両方からの試料を水中で再構成し、１００μＭに希釈し、分析ＨＰＬＣを介して化学的完全性について分析した（図５４）。新たに調製した基質（ＥｔＯＨ中の１００μＭのＪＲＷ－０２３８、図５４Ａ）と比較して、製剤化基質条件はいずれも、有意な化学分解を示さなかった（図５４Ｂ及び図５４Ｃ）。ピーク情報を、表３に要約する。
Figure 0007447101000005
両方の条件からの再構成した試料を、暗所で、周囲温度で放置した。２４時間後、条件１から調製した試料において、少量の沈殿物を観察した。条件２から調製した溶液は、実験の過程にわたって透明なままであった。この一連の実験は、セレンテラジン類似体の固体製剤を、有機溶媒または安定化剤を必要とすることなく、合成ポリマーで調製し、水性培地中の全体的な動態溶解度を改善することができることを示す。しかしながら、調製方法は、熱力学的溶解度に対して効果を有し得る。凍結乾燥した条件（条件２）は、周囲温度で２４時間後も依然として溶液中にあった。これは、水中で再構成されて２４時間以内に溶液から沈殿し始めた、条件１からの試料とは対照的である。
実施例３５
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７で製剤化したフリマジン
この製剤を、セレンテラジン類似体であるフリマジンについても調製した。２．５ｍｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をまとめて、１．５ｍＬスナップトップエッペンドルフチューブに入れた。ポリマーを、溶融するまで水浴中で７０℃に加熱した。１０ｍＭのフリマジンストック溶液を、ＥｔＯＨ中で調製した。次いで、このストック５μＬを溶融ポリマーに添加し、ピペット操作して混合した。２つの別個の条件を調製した。条件１－基質を添加した後、溶液を、真空下で３０分間乾燥させた。条件２－基質を添加した後、基質／ポリマー溶液を４５μＬの水でさらに希釈し、凍結し、次いで一晩凍結乾燥した。
条件１及び２の両方の試料を水中で再構成し、１００μＭに希釈し、分析ＨＰＬＣを介して基質の完全性について分析した（図５５）。新たに調製したフリマジン（図５５Ａ）と比較して、条件１は、かなりの分解を示した（図５５Ｂ）。これは、この試料を再構成するために必要とされた広範な超音波処理に起因し得る。対照的に、条件２からの再構成した試料は、有意な分解を示さなかった（図５５Ｃ）。ピーク情報を、表４に要約する。
Figure 0007447101000006
この一連の実験は、フリマジンを含むセレンテラジン類似体の固体製剤を、有機溶媒または安定化剤を必要とすることなく、合成ポリマーで調製し、水性培地中の全体的な動態溶解度を改善することができることを示す。
実施例３６
水中の製剤化ＪＲＷ－０２３８の最大濃度
２５ｍｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７をまとめて、１．５ｍＬスナップトップエッペンドルフチューブに入れた。ポリマーを、溶融するまで水浴中で７０℃に加熱した。３．４ｍｇのＪＲＷ－０２３８を５０μＬのＥｔＯＨ中に溶解し、次いで熱ポリマーに添加し、ピペット操作によって混合した。追加の５０μＬのＥｔＯＨを使用して基質を洗浄し、ポリマー溶液に移行するのを補助した。溶媒を、加熱せずに減圧下で除去した。
４つのバイアルを同様の方法で調製し、全てのバイアルは、７．３：１ｗ／ｗのポリマー対基質の比率を含有した。以下に記載するように、異なる体積の水を使用して、初期水性ストックを作製した。
バイアル１：ポリマーに基質を注入した後、溶液を５００μＬの水中に取り込んだ。全ての材料は、超音波処理後に溶液中に溶解した。試料を凍結し、一晩凍結乾燥した。基質の算出濃度を、５ｗ／ｖ％のポリマーを含む１７．４ｍＭであると決定した。
バイアル２：ポリマーに基質を注入した後、溶液を４００μＬの水中に取り込んだ。全ての材料は、超音波処理後に溶液中に溶解した。試料を凍結し、一晩凍結乾燥した。水中の基質の算出濃度を、６．２５ｗ／ｖ％のポリマーを含む２１．４ｍＭであると決定した。
バイアル３：ポリマーに基質を注入した後、溶液を２５０μＬの水中に取り込んだ。全ての材料は、超音波処理後に溶液中に溶解した。試料を凍結し、一晩凍結乾燥した。水中の基質の算出濃度を、１０ｗ／ｖ％のポリマーを含む３４．４ｍＭであると決定した。
バイアル４：ポリマーに基質を注入した後、溶液を１００μＬの水中に取り込んだ。全ての材料は、超音波処理後に溶液中に溶解した。試料を凍結し、一晩凍結乾燥した。水中の基質の算出濃度を、２５ｗ／ｖ％のポリマーを含む８５．４ｍＭであると決定した。
凍結乾燥後、各試料を、それぞれ、５００μＬ、４００μＬ、２５０μＬ、または１００μＬの水のいずれかで再構成した。各条件の全ての材料は、溶液中に溶解した。これらの溶液の代表的な画像を、図５６に示す。周囲温度で２４時間後、再構成したストックを遠心分離し、沈殿は観察されなかった。溶液中に２４時間放置した後の再構成した基質の化学的完全性を示す代表的なＨＰＬＣトレースを、図５７に示す。有意な化学分解は観察されなかった。ピーク情報を、表５に要約する。
Figure 0007447101000007
これらの実験は、高濃度のセレンテラジン類似体ＪＲＷ－０２３８を、固体状態のポリマーで製剤化することによって、周囲条件下で化学的完全性のいかなる損失も伴わずに水中で達成することができることを示す。
実施例３７
観察可能な基質溶解性の損失を伴わない、より低いポリマー／基質比
２３．８、２０．４、１７、１３．６、１０．２、及び６．８ｍｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７をまとめて、個々の１．５ｍＬスナップトップエッペンドルフチューブに入れた。ポリマーを、溶融するまで水浴中で７０℃に加熱した。２３．７ｍｇのＪＲＷ－０２３８を３５０μＬのＥｔＯＨ中に溶解し、このストック５０μＬを、熱ポリマーを含有する各バイアルに添加し、ピペット操作によって十分に混合した。次いで、バイアルを高真空下に３０分間置いて、全ての有機溶媒を除去した。各バイアルを、それぞれ、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、または２倍ｗ／ｗポリマー／基質のいずれかを用いて、５００μＬの水で最終濃度１７．４ｍＭのＪＲＷ－０２３８に希釈した。各チューブを凍結し、一晩凍結乾燥させた。
試験の時点で、５００μＬの水を各バイアルに添加し、全ての材料が溶解するまでボルテックスした。初期再構成後、基質に対して２倍ｗ／ｗのポリマーを含有する試料を除いて、全ての試料が透明であった（図５８Ａ）。この試料だけは、わずか濁っていることを観察した。溶液中に室温で１時間置いた後、基質に対して２倍ｗ／ｗのポリマーを含有する試料を除いて、再構成した基質は依然として溶液中にあることを観察した（図５８Ｂ）。
実施例３８
動物全体撮像に使用される固体製剤
マウスモデルにおける動物全体撮像のために、固体製剤化ＪＲＷ－０２３８のストック試料を、以下のように調製した。９０ｍｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７をまとめて、ガラスのスクリューキャップバイアルに入れた。次いで、ポリマーを、溶解する（透明な溶液になる）まで水浴中で７０℃に加熱した。１２．５ｍｇのＪＲＷ－０２３８を２５０μＬのＥｔＯＨ中に溶解し、熱ポリマーに添加し、薄型スパチュラで十分に混合した。次いで、溶媒を減圧下で除去した。この濃縮試料を、３．６４６ｍＬの水で希釈して、水中８．７ｍＭの基質のマスターストックを作製した。次いで、この水性ストック４８０μＬを、１．５ｍＬのスクリューキャップバイアルに取り、凍結し、一晩凍結乾燥した。この製剤の代表的な画像を、図５９Ａに示す。試験の時点で、４８０μＬの水をバイアルに添加し、全ての材料が溶解するまで約１５秒間ボルテックスした（図５９Ｂ）。
Ａｎｔａｒｅｓタンパク質構築物（米国特許第９，９０８，９１８号を参照）、ＮａｎｏＬｕｃとシアン励起性オレンジ－赤色蛍光タンパク質（ＣｙＯＦＰ）との融合を発現するように操作されたトランスジェニックマウス対象（平均年齢：６か月齢）を、イソフルランを使用して麻酔し、腹腔内注射（Ｉ．Ｐ．）または皮下注射（Ｓ．Ｃ．）のいずれかを介して、４８０μＬの再構成した基質の溶液を注射した。次いで、各マウスを、Ａｍｉ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、注射後毎分撮像した。図６０Ａは、再構成したＪＲＷ－０２３８を腹腔内注射した５匹の動物由来の平均ＲＬＵのトレースを示す。図６０Ｂは、光出力をその最大値で測定した場合の各マウスの代表的な画像である。図６１Ａは、再構成したＪＲＷ－０２３８を皮下注射した５匹の動物由来の平均ＲＬＵのトレースを示す。図６１Ｂは、光出力がその最大値であると測定された場合の各マウス対象の代表的な画像を示す。合わせて、これらの結果は、インビボ撮像を、乾燥製剤として調製され、使用時に水中で再構成され、腹腔内または皮下注射経路を介して生きた動物対象に注射されたセレンテラジン類似体で達成することができることを示す。
前述の発明を実施するための形態及び付随する実施例は、単に例示的なものであり、添付の特許請求の範囲及びその同等物によってのみ定義される本開示の範囲に対する限定とみなされるべきではないことを理解されたい。
開示された実施形態に対する様々な変更及び修正は、当業者には明らかであろう。本開示の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関するものを含むが、これらに限定されないそのような変更及び修正は、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行われ得る。
実施例３９
より大規模なポリマーフリマジン製剤の調製
乾燥フリマジン製剤をより大きな体積に拡大し、これらの組成物を製造条件下で調製し得ることを実証した。ケーキ中のフリマジン濃度は、２００ｕＭである。ケーキを１０ｍＬ体積のストックに再構成し、２倍（２０ｕＭ）のフリマジンストックを得ることができる。次いで、これを、試料で１：１に希釈し、最終濃度１０μＭにすることができる。
バルク溶液を調製するために、５０ｍＬのミリＱ精製水を、１．２５ｇのプルラン、３５．７ｍｇのＡＴＴ、及び４４ｍｇのアスコルベートに添加し、全ての固体が溶解するまで混合した。最終溶液は、それぞれ、５ｍＭのＡＴＴ及び５ｍＭのアスコルベートを有する２．５ｗ／ｖ％のプルランを含有する。
２９．４ｍＬのプルラン溶液を、５０ｍｌのプラスチックバイアル中に計り入れた。ＥｔＯＨ中の１０ｍＭのストックとして調製した６００μＬのフリマジンを添加し、十分に混合した。少量の薄い針状沈殿物を、溶液中に観察した。この沈殿物は、溶液中のＥｔＯＨと相互作用するプルランポリマーに起因する可能性が最も高い。これは、調製の成功または最終材料の特性に影響を与えなかった。
１０ｍＬの琥珀色ガラスバイアルを使用した。１ｍＬのフリマジン－プルランストック溶液を、１０ｍＬの琥珀色ガラスバイアルに取り、ゴムストッパーをバイアルに部分的に挿入した。
使用される凍結乾燥機（Ｖｉｒｔｉｓ Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ凍結乾燥機）は、４平方フィートの棚面及び合計で３つの棚を有する。冷凍システムは、２つの２段階圧縮機で構成されている。真空／圧力制御を、単一の真空ポンプと、窒素を凍結乾燥機チャンバに排出して、真空ポンプの吸引力のバランスを取り、指定された設定値で圧力を保持する調節制御バルブとにより達成する。棚は、油圧ピストンを介して圧縮可能である。手動で分配した生成物の１７８×１０バイアル（１４個の異なる製剤の組み合わせを含む）を含有する１つの小型トレイを、＋４．７℃の温度である凍結乾燥機内の単一の棚上に充填した。次いで、生成物に、－５０℃の棚温度で２時間凍結ステップを行い、その後、次いでコンデンサステップを開始した。実行中、コンデンサ温度は、－５℃～８７℃で実行した。次に、真空を引き下げ、７５及び２００ｍＴｏｒｒの圧力設定値で実行した。これら両方の圧力設定値での良好な制御が、実行全体を通して示された。凍結乾燥レシピ／サイクルの全てのステップを、プログラムしたように実行した。生成物プローブの平均温度に基づいて、昇華は約７．５時間続き、脱着は約１６．１時間続いた。実行の終わりに、バイアルを窒素でバック充填し、約６００Ｔｏｒｒの圧力（約７４０Ｔｏｒｒは大気圧）で完全に挿入されたストッパーで密封した。
凍結乾燥後、窒素ガスを、２０倍のフリマジンを含む凍結乾燥ケーキを含有する各ガラスバイアルに投与して、バイアルの頭部空間を充填し、それぞれ、キャップを完全に密封し、バイアルを２５℃または６０℃のいずれかで保存した。凍結乾燥後の様々な時点で、製剤化フリマジンを０．０１％のＢＳＡを含有する１０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．０）で再構成し、バイアルを手動で振盪し、室温で５分間平衡化させた。製剤化フリマジンストック溶液５０ｕｌを、０．０１％のＢＳＡ（最終［Ｎｌｕｃ］＝０．５ｎｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．０）中の１ｎｇ／ｍｌの精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素（Ｎｌｕｃ）（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ４９９）５０ｕｌに添加した。使用した対照は、各時点のデータ収集のために－２０℃から新たにサンプリングしたＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０５）の１０ｕＭの最終溶液であった。アッセイを、固体で白色の非結合表面（ＮＢＳ）プレート中で実施し、総発光を収集するルミノメータ（ＧｌｏＭａｘ（登録商標）ディスカバーマルチモードマイクロプレートリーダ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号ＧＭ３０００）上の動態読み取りを使用して分析した。
図６２Ａは、時点「０日目」における凍結乾燥製剤化フリマジンケーキを示し、これは、バイアルが、均等に分布した均一なケーキをバイアルの底部に含有することを示し、外観にいかなる明白な欠陥も有しないバイアルは、製剤及び凍結乾燥プロトコールが適切であったことを示す。図６２Ｂは、上記のように緩衝液で再構成した後の製剤化フリマジンを使用して生ＲＬＵとして発現したＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）活性の結果を示す。製剤化フリマジンを、対照基質（ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）生細胞基質、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０５）と同様に実施した。これは、加速安定性研究を開始するためのベースライン読み取り値である。次いで、バイアルまたは対照基質の一部を、６０℃または２５℃で置いた。新しいバイアルを様々な時点で再構成し、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）酵素を使用して活性について分析した。図６３は、２５℃（青色の、中が塗りつぶされた円）または６０℃（赤色の正方形）のいずれかで保存した製剤化試料由来の、２５℃（緑色の三角形）または６０℃（オレンジ色の逆三角形）で保存したＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）生細胞基質由来の、及び３４日間モニタリングした場合に－２０℃（黒色の菱形）で維持された新たに調製した対照ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）生細胞基質由来の生ＲＬＵを示す。０日目に再構成したバイアルを溶液中に維持し、室温で維持し、同様に活性についても１８日間にわたってサンプリングした（淡青色の、中が塗りつぶされていない円）。データは、製剤化フリマジンが、試験した両方の温度で試験した期間にわたって活性を維持し、有機溶媒中に溶解したフリマジンを超える改善を示すことを示す。全ての製剤化フリマジンは、固体フリマジンの挙動とは完全に対照的に、緩衝液の添加後５分以内に再構成した。
図６２及び６３の結果は、フリマジン組成物を、より大きな規模で、ならびにより厳しい品質管理条件下で、例えば、ガラスバイアル中及び不活性雰囲気下で調製することができることを実証する。組成物を、周囲温度または高温で長期間保存し、有機溶媒または特別な緩衝条件を必要とせずに中性緩衝液中で再構成することができる。水性緩衝液中で再構成した後でさえ、組成物は、溶液中及び周囲条件下で最大２４～４８時間保存している間、いかなる有意な性能も失わず、いくらかの活性を最大１８日間維持する。
実施例４０
製剤化ＪＲＷ－１７４４の調製
Figure 0007447101000008
 ６－（３－アミノ－２－フルオロフェニル）－８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）イミダゾ［１，２－α］ピラジン－３（７Ｈ）－オン
実施例３４及び３８のＪＲＷ－０２３８と同様の様式で、ＪＲＷ－１７４４の製剤化実施例を調製した。固体製剤化ＪＲＷ－１７４４のストック試料を、以下のように調製した。７７ｍｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７（約７．２倍ｗ／ｗ）をまとめて、ガラスのスクリューキャップバイアルに入れた。次いで、ポリマーを、溶解する（透明な溶液になる）まで水浴中で８０℃に加熱した。１０．８ｍｇのＪＲＷ－１７４４を少量のＥｔＯＨ中に溶解し、熱ポリマーに添加し、薄型スパチュラで十分に混合した。追加のＥｔＯＨ（合計最大２ｍＬ）を使用して、全ての基質をポリマー溶液に完全に移し、溶解した。次いで、溶媒を減圧下で除去した。次いで、この濃縮試料を高真空下に１時間置いて、残留ＥｔＯＨを除去し、オレンジ色の固体を得た。この固体を３．０ｍＬの水中で希釈し、超音波処理して、水中８．７ｍＭのＪＲＷ－１７４４のマスターストックを作製した。次いで、この水性ストックの４８０μＬのアリコートを、１．５ｍＬのスクリューキャップバイアルに移し、凍結し、一晩凍結乾燥した。
実施例４１
製剤化ＪＲＷ－１７４３の調製
Figure 0007447101000009
 ６－（３－アミノ－２－フルオロフェニル）－８－（２－フルオロベンジル）－２－（フラン－２－イルメチル）イミダゾ［１，２－α］ピラジン－３（７Ｈ）－オン
実施例３４及び３８のＪＲＷ－０２３８と同様の様式で、ＪＲＷ－１７４３の製剤化実施例を調製した。
製剤化ＪＲＷ－１７４３のストック試料を、以下のように調製した。７２ｍｇ（７．２倍ｗ／ｗ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７をまとめて、ガラスのスクリューキャップバイアルに入れた。次いで、ポリマーを、完全に溶解するまで水浴中で８０℃で加熱した（図６４Ａ）。
１０．０ｍｇの固体ＪＲＷ－１７４３を少量のＥｔＯＨ中に溶解し、薄型スパチュラで攪拌しながら熱ポリマーに移した。追加のＥｔＯＨ（合計最大２ｍＬ）を使用して、基質をポリマー溶液に移すのを補助した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、ポリマー／基質混合物を、赤みがかったオレンジ色のゲルに濃縮した。次いで、この濃縮試料を高真空下に１時間置いて、あらゆる残留ＥｔＯＨを除去した。
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７中の製剤化ＪＲＷ－１７４３のマスターストックを調製するために、２．６ｍＬの水をゲルに添加し、得られた溶液を完全に均質になるまで超音波処理した（図６４Ｂ）。この体積でのＪＲＷ－１７４３の最終濃度を、８．７ｍＭと算出した。次いで、この水性ストックの４８０μＬのアリコートを、１．５ｍＬのスクリューキャップバイアルに移し、凍結し、一晩凍結乾燥し、ＪＲＷ－１７４３を含有する凍結乾燥ケーキを得た（図６４Ｃ）。
製剤化ＪＲＷ－１７４３を含有する１つのバイアルを、４８０μＬの水中で再構成した（図６４Ｃ中央及び右）。水中の基質濃度の吸光度測定を実施し、この溶液中のＪＲＷ－１７４３の作動濃度を、約８．７ｍＭの理論濃度と比較して、８．５ｍＭで実測したことを示した（図６５）。
配列
配列番号１－天然成熟Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼアミノ酸配列
ＦＴＬＡＤＦＶＧＤＷＱＱＴＡＧＹＮＱＤＱＶＬＥＱＧＧＬＳＳＬＦＱＡＬＧＶＳＶＴＰＩＱＫＶＶＬＳＧＥＮＧＬＫＡＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＦＱＭＧＬＩＥＭＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＩＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＰＧＩＡＶＦＤＧＫＱＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＹＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＮＩＬＡ
配列番号２－Ｎｌｕｃアミノ酸配列
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ
配列番号３－ＬｇＴｒｉｐ（３５４６）
ＭＫＨＨＨＨＨＨＶＦＴＬＤＤＦＶＧＤＷＥＱＴＡＡＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＬＱＮＬＡＶＳＶＴＰＩＭＲＩＶＲＳＧＥＮＡＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＡＤＱＭＡＱＩＥＥＶＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＰＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＫＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＴＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤ
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕セレンテラジン及びその類似体または誘導体から選択される化合物と、
ポリマーと、
を含む組成物。
〔２〕前記化合物が、セレンテラジン、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈ－ｈ、フリマジン、ＪＲＷ－０２３８、ＪＲＷ－１７４３、及びＪＲＷ－１７４４から選択される、前記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕前記化合物が、フリマジンである、前記〔１〕に記載の組成物。
〔４〕前記ポリマーが、天然バイオポリマーである、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔５〕前記天然バイオポリマーが、プルラン、トレハロース、マルトース、セルロース、デキストラン、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される、前記〔４〕に記載の組成物。
〔６〕前記天然バイオポリマーが、プルランである、前記〔５〕に記載の組成物。
〔７〕前記ポリマーが、環状糖類ポリマーまたはその誘導体である、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔８〕前記ポリマーが、ヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリンである、前記〔７〕に記載の組成物。
〔９〕前記ポリマーが、合成ポリマーである、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔１０〕前記合成ポリマーが、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１１〕前記合成ポリマーが、少なくとも１つのポリ（プロピレンオキシド）ブロックと少なくとも１つのポリ（エチレンオキシド）ブロックとを含むブロックコポリマーである、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１２〕前記合成ポリマーが、ポロキサマーである、前記〔１１〕に記載の組成物。
〔１３〕前記組成物が、緩衝液、界面活性剤、還元剤、塩、ラジカル捕捉剤、キレート剤、タンパク質、またはそれらの組み合わせをさらに含む、前記〔１〕～〔１２〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔１４〕前記組成物が、リン酸緩衝液、トリシン、及び２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸から選択される緩衝液をさらに含む、前記〔１３〕に記載の組成物。
〔１５〕前記組成物が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、及びポリソルベート８０から選択される界面活性剤をさらに含む、前記〔１３〕または前記〔１４〕に記載の組成物。
〔１６〕前記組成物が、チオ尿素及び６－アザ－２－チオチミンから選択される還元剤を含む、前記〔１３〕～〔１５〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔１７〕前記組成物が、塩化ナトリウム及びリン酸ナトリウムから選択される塩をさらに含む、前記〔１３〕～〔１６〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔１８〕前記組成物が、アスコルビン酸及びアスコルビン酸ナトリウムから選択されるラジカル捕捉剤をさらに含む、前記〔１３〕～〔１７〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔１９〕前記組成物が、キレート剤をさらに含み、前記キレート剤が、クエン酸及びトランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－四酢酸から選択される、前記〔１３〕～〔１８〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔２０〕前記組成物が、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、及び高度に精製された豚由来の皮膚コラーゲンのポリペプチド画分から選択されるタンパク質をさらに含む、前記〔１３〕～〔１９〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔２１〕前記組成物が、凍結乾燥粉末またはケーキの形態である、前記〔１〕～〔２０〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔２２〕前記組成物が、可鍛性フィルムの形態である、前記〔１〕～〔２０〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔２３〕前記組成物が、溶液である、前記〔１〕～〔２０〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔２４〕セレンテラジン及びその類似体または誘導体から選択される化合物と、
紙もしくは繊維マトリックス、プラスチック、ガラス、または金属から選択される表面と、
を含む組成物。
〔２５〕前記化合物が、セレンテラジン、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈ－ｈ、フリマジン、ＪＲＷ－０２３８、ＪＲＷ－１７４３、及びＪＲＷ－１７４４から選択される、前記〔２４〕に記載の組成物。
〔２６〕前記化合物が、フリマジンである、前記〔２４〕に記載の組成物。
〔２７〕前記組成物が、ポリマーをさらに含む、前記〔２４〕～〔２６〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔２８〕前記ポリマーが、天然バイオポリマーである、前記〔２７〕に記載の組成物。
〔２９〕前記天然バイオポリマーが、プルラン、トレハロース、マルトース、セルロース、デキストラン、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される、前記〔２８〕に記載の組成物。
〔３０〕前記天然バイオポリマーが、プルランである、前記〔２９〕に記載の組成物。
〔３１〕前記ポリマーが、環状糖類ポリマーまたはその誘導体である、前記〔２７〕に記載の組成物。
〔３２〕前記ポリマーが、ヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリンである、前記〔３１〕に記載の組成物。
〔３３〕前記ポリマーが、合成ポリマーである、前記〔２７〕に記載の組成物。
〔３４〕前記合成ポリマーが、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される、前記〔３３〕に記載の組成物。
〔３５〕前記合成ポリマーが、少なくとも１つのポリ（プロピレンオキシド）ブロックと少なくとも１つのポリ（エチレンオキシド）ブロックとを含むブロックコポリマーである、前記〔３３〕に記載の組成物。
〔３６〕前記合成ポリマーが、ポロキサマーである、前記〔３５〕に記載の組成物。
〔３７〕前記組成物が、緩衝液、界面活性剤、還元剤、塩、ラジカル捕捉剤、タンパク質、またはそれらの組み合わせをさらに含む、前記〔２４〕～〔３６〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔３８〕前記組成物が、リン酸緩衝液、トリシン、及び２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸から選択される緩衝液をさらに含む、前記〔３７〕に記載の組成物。
〔３９〕前記組成物が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、及びポリソルベート８０から選択される界面活性剤をさらに含む、前記〔３７〕または前記〔３８〕に記載の組成物。
〔４０〕前記組成物が、チオ尿素及び６－アザ－２－チオチミンから選択される還元剤を含む、前記〔３７〕～〔３９〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔４１〕前記組成物が、塩化ナトリウム及びリン酸ナトリウムから選択される塩をさらに含む、前記〔３７〕～〔４０〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔４２〕前記組成物が、アスコルビン酸及びアスコルビン酸ナトリウムから選択されるラジカル捕捉剤をさらに含む、前記〔３７〕～〔４１〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔４３〕前記組成物が、キレート剤をさらに含み、前記キレート剤が、クエン酸及びトランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－四酢酸から選択される、前記〔３７〕～〔４２〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔４４〕前記組成物が、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、及び高度に精製された豚由来の皮膚コラーゲンのポリペプチド画分から選択されるタンパク質をさらに含む、前記〔３７〕～〔４３〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔４５〕前記表面が、セルロース紙、ニトロセルロース紙、ナイロン紙、綿紙、ポリエステル紙、カルボキシメチルセルロースナトリウム、多孔質または高分子膜、高純度綿繊維、綿／レーヨン混合高純度綿、及びガラス微小繊維から選択される、前記〔２４〕～〔４４〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔４６〕セレンテラジン及びその類似体または誘導体から選択される化合物を安定化させる方法であって、セレンテラジン化合物またはその類似体もしくは誘導体を有効量のポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触させて、組成物を形成することを含む、前記方法。
〔４７〕前記化合物が、熱分解、化学分解、光誘導分解、またはそれらの組み合わせに対して安定化される、前記〔４６〕に記載の方法。
〔４８〕セレンテラジン及びその類似体または誘導体から選択される化合物の溶解性を改善する方法であって、セレンテラジン化合物またはその類似体もしくは誘導体を有効量のポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触させて、組成物を形成することを含む、前記方法。
〔４９〕前記化合物の溶解性が、前記ポリマー及び／または前記紙もしくは繊維マトリックスと接触していない化合物と比較して、水溶液中で改善される、前記〔４８〕に記載の方法。
〔５０〕セレンテラジン及びその類似体または誘導体から選択される化合物の再構成速度を改善する方法であって、セレンテラジン化合物またはその類似体もしくは誘導体を有効量のポリマー及び／または紙もしくは繊維マトリックスと接触させて、組成物を形成することを含み、
前記化合物の再構成速度が、前記ポリマーまたは前記紙もしくは繊維マトリックスと接触していない化合物と比較して改善される、前記方法。
〔５１〕前記化合物が、セレンテラジン、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈ－ｈ、フリマジン、ＪＲＷ－０２３８、ＪＲＷ－１７４３、及びＪＲＷ－１７４４から選択される、前記〔４６〕～〔５０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５２〕前記化合物が、フリマジンである、前記〔５１〕に記載の方法。
〔５３〕前記ポリマーが、天然バイオポリマーである、前記〔４６〕～〔５２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５４〕前記天然バイオポリマーが、プルラン、トレハロース、マルトース、セルロース、デキストラン、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される、前記〔５３〕に記載の方法。
〔５５〕前記天然バイオポリマーが、プルランである、前記〔５４〕に記載の方法。
〔５６〕前記ポリマーが、環状糖類ポリマーまたはその誘導体である、前記〔４６〕～〔５２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５７〕前記ポリマーが、ヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリンである、前記〔５６〕に記載の方法。
〔５８〕前記ポリマーが、合成ポリマーである、前記〔４６〕～〔５２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５９〕前記合成ポリマーが、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される、前記〔５８〕に記載の方法。
〔６０〕前記合成ポリマーが、少なくとも１つのポリ（プロピレンオキシド）ブロックと少なくとも１つのポリ（エチレンオキシド）ブロックとを含むブロックコポリマーである、前記〔４６〕～〔５２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６１〕前記合成ポリマーが、ポロキサマーである、前記〔６０〕に記載の方法。
〔６２〕前記組成物が、緩衝液、界面活性剤、還元剤、塩、ラジカル捕捉剤、タンパク質、またはそれらの組み合わせをさらに含む、前記〔４６〕～〔６１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６３〕前記組成物が、リン酸緩衝液、トリシン、及び２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸から選択される緩衝液をさらに含む、前記〔６２〕に記載の方法。
〔６４〕前記組成物が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、及びポリソルベート８０から選択される界面活性剤をさらに含む、前記〔６２〕または前記〔６３〕に記載の方法。
〔６５〕前記組成物が、チオ尿素及び６－アザ－２－チオチミンから選択される還元剤を含む、前記〔６２〕～〔６４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６６〕前記組成物が、塩化ナトリウム及びリン酸ナトリウムから選択される塩をさらに含む、前記〔６２〕～〔６５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６７〕前記組成物が、アスコルビン酸及びアスコルビン酸ナトリウムから選択されるラジカル捕捉剤をさらに含む、前記〔６２〕～〔６６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６８〕前記組成物が、キレート剤をさらに含み、前記キレート剤が、クエン酸及びトランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－四酢酸から選択される、前記〔６２〕～〔６７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６９〕前記組成物が、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、及び高度に精製された豚由来の皮膚コラーゲンのポリペプチド画分から選択されるタンパク質をさらに含む、前記〔６２〕～〔６８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７０〕前記紙または繊維マトリックスが、セルロース紙、ニトロセルロース紙、ナイロン紙、綿紙、ポリエステル紙、カルボキシメチルセルロースナトリウム、多孔質または高分子膜、高純度綿繊維、綿／レーヨン混合高純度綿、及びガラス微小繊維から選択される、前記〔４６〕～〔６９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７１〕前記接触ステップが、
前記化合物を有機溶媒中に溶解させて、第１の溶液を形成することと、
前記第１の溶液を前記ポリマー及び／または前記紙もしくは繊維マトリックスと混合して、混合物を形成することと、
前記混合物を乾燥させることと、を含む、前記〔４６〕～〔７０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７２〕前記混合ステップが、前記ポリマーを第２の溶液中に溶解させることと、前記第２の溶液を前記第１の溶液と混合することと、を含む、前記〔７１〕に記載の方法。
〔７３〕前記混合ステップが、前記第１の溶液を前記紙または繊維マトリックスに適用することを含む、前記〔７１〕に記載の方法。
〔７４〕前記乾燥ステップが、凍結乾燥を含む、前記〔７１〕～〔７３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７５〕前記乾燥ステップが、空気乾燥を含む、前記〔７１〕～〔７４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７６〕前記乾燥が、不活性雰囲気中、周囲温度で行われる、前記〔７１〕～〔７４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７７〕前記乾燥が、真空乾燥を含む、前記〔７１〕～〔７４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７８〕前記乾燥が、約３０℃～約７０℃の温度で行われる、前記〔７１〕～〔７４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７９〕前記溶液のうちの１つまたは全てが、脱酸素化される、前記〔７１〕～〔７８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８０〕前記方法が、前記化合物を前記ポリマーと接触させることを含む、前記〔４６〕～〔７９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８１〕前記方法が、前記ポリマーを前記紙または繊維マトリックスと接触させることを含む、前記〔４６〕～〔７９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８２〕前記方法が、前記ポリマーを前記ポリマー及び前記紙または繊維マトリックスと接触させることを含む、前記〔４６〕～〔７９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８３〕前記〔１〕～〔４５〕のいずれか１項に記載の組成物を含む、キット。
〔８４〕前記組成物が、１つ以上の容器に含まれている、前記〔８３〕に記載のキット。
〔８５〕前記組成物が、複数のチューブに含まれている、前記〔８４〕に記載のキット。
〔８６〕前記組成物が、複数の紙スポットの形態であり、各スポットが、約２ｍｍ～約５ｍｍの直径を有する、前記〔８３〕～〔８５〕のいずれか１項に記載のキット。

Claims (16)

  1. セレンテラジン、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈ－ｈ、フリマジン、ＪＲＷ－０２３８、ＪＲＷ－１７４３、及びＪＲＷ－１７４４から選択される化合物と、
    プルランと、
    を含む、凍結乾燥粉末または凍結乾燥ケーキの形態である組成物。
  2. 前記化合物が、フリマジンである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記組成物が、緩衝液、界面活性剤、還元剤、塩、ラジカル捕捉剤、キレート剤、タンパク質、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記組成物が、
    リン酸緩衝液、トリシン、及び２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸から選択される緩衝液；
    ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、及びポリソルベート８０から選択される界面活性剤；
    チオ尿素及び６－アザ－２－チオチミンから選択される還元剤；
    塩化ナトリウム及びリン酸ナトリウムから選択される塩；
    アスコルビン酸及びアスコルビン酸ナトリウムから選択されるラジカル捕捉剤；
    クエン酸及びトランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－四酢酸から選択されるキレート剤；もしくは
    ウシ血清アルブミン、ゼラチン、及び高度に精製された豚由来の皮膚コラーゲンのポリペプチド画分から選択されるタンパク質；
    又はそれらの組み合わせ
    をさらに含む、請求項３に記載の組成物。
  5. セレンテラジン、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈ－ｈ、フリマジン、ＪＲＷ－０２３８、ＪＲＷ－１７４３、及びＪＲＷ－１７４４から選択される化合物を安定化させる方法であって、前記化合物を有効量のプルランと接触させること、および凍結乾燥粉末または凍結乾燥ケーキの形態の組成物を形成することを含み、前記化合物が、熱分解、化学分解、光誘導分解、またはそれらの組み合わせに対して安定化される、前記方法。
  6. セレンテラジン、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈ－ｈ、フリマジン、ＪＲＷ－０２３８、ＪＲＷ－１７４３、及びＪＲＷ－１７４４から選択される化合物の溶解性を改善する方法であって、前記化合物を有効量のプルランと接触させること、および凍結乾燥粉末または凍結乾燥ケーキの形態の組成物を形成することを含み、前記化合物の溶解性が、前記プルランと接触していない化合物と比較して、水溶液中で改善される、前記方法。
  7. セレンテラジン、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈ－ｈ、フリマジン、ＪＲＷ－０２３８、ＪＲＷ－１７４３、及びＪＲＷ－１７４４から選択される化合物の再構成速度を改善する方法であって、前記化合物を有効量のプルランと接触させること、および凍結乾燥粉末または凍結乾燥ケーキの形態の組成物を形成することを含み、
    前記化合物の再構成速度が、前記プルランと接触していない化合物と比較して改善される、前記方法。
  8. 前記化合物が、フリマジンである、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記組成物が、緩衝液、界面活性剤、還元剤、塩、ラジカル捕捉剤、タンパク質、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記組成物が、
    リン酸緩衝液、トリシン、及び２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸から選択される緩衝液；
    ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、及びポリソルベート８０から選択される界面活性剤；
    チオ尿素及び６－アザ－２－チオチミンから選択される還元剤；
    塩化ナトリウム及びリン酸ナトリウムから選択される塩；
    アスコルビン酸及びアスコルビン酸ナトリウムから選択されるラジカル捕捉剤；
    クエン酸及びトランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－四酢酸から選択されるキレート剤；もしくは
    ウシ血清アルブミン、ゼラチン、及び高度に精製された豚由来の皮膚コラーゲンのポリペプチド画分から選択されるタンパク質；
    又はそれらの組み合わせ
    をさらに含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記接触ステップが、
    前記化合物を有機溶媒中に溶解させて、第１の溶液を形成することと、
    前記第１の溶液を前記プルランと混合して、混合物を形成することと、
    前記混合物を凍結乾燥して凍結乾燥粉末または凍結乾燥ケーキを形成することと、を含む、請求項５～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記混合ステップが、前記プルランを第２の溶液中に溶解させることと、前記第２の溶液を前記第１の溶液と混合することと、を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記溶液のうちの１つまたは全てが、脱酸素化される、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物を含む、キット。
  15. 前記組成物が、１つ以上の容器に含まれている、請求項１４に記載のキット。
  16. 前記組成物が、複数のチューブに含まれている、請求項１５に記載のキット。
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