JP4184806B2

JP4184806B2 - ヘモグロビンアッセイ

Info

Publication number: JP4184806B2
Application number: JP2002583989A
Authority: JP
Inventors: ジョスティンホルトランド; ケースティンベーンストロン; エレンドワースキー; リセコーネリュセン
Original assignee: アクシス−シールドエイエスエイ
Priority date: 2001-04-24
Filing date: 2002-04-10
Publication date: 2008-11-19
Anticipated expiration: 2022-04-10
Also published as: NO20034687D0; DE60227935D1; EP1381869B1; JP2004529347A; AU2002244858B2; NO20034687L; WO2002086512A2; ATE403159T1; CN100593117C; CA2441929C; NO332622B1; WO2002086512A3; PT1381869E; CA2441929A1; ES2309154T3; US20040137641A1; EP1381869A2; GB0110053D0; US7374943B2; DK1381869T3

Description

本発明は、糖化ヘモグロビンのアッセイ方法についてその改良に関する。

生体液において、溶液中にあるタン白質は、絶えずグリコシル化の過程に曝されている。グルコースは、非酵素的反応によりタン白質と反応して糖タン白質を形成する。

大抵は糖タン白質形成のレベルは、問題の生体液におけるグルコース濃度に比例する。当初は糖タン白質として合成されなかったタン白質にとり、糖化（glycated）形態にある一部のタン白質は、それゆえ、生体におけるタン白質の寿命および該タン白質が曝されるグルコース濃度の関数となる。

血液、血漿または尿におけるグルコース濃度の測定は、試料採取時点のグルコース濃度についてだけの情報を与えるが、これとは相違してグリコシル化形態にあるタン白質の量は、生体によるグルコース濃度の長時間にわたる調節の手がかりを与える。

赤血球(血液の血球細胞)はおよそ120日間の平均寿命を有しており、大量のヘモグロビ
ンを含んでいる。グリコシル化された形態にある赤血球ヘモグロビンの分率は、糖尿病患者における疾患制御の好適な尺度となり、血液試料の採取に先立つ数週間における、患者血液中のグルコース濃度の関数である。

US-A-5242842 (Axis) 公報（特許文献１）において、レポーター標識試薬として、ボロン酸（boronic acid ）複合体、たとえば N-(レゾルフィン-4-カルボニル)ピペリジン-4-カルボン酸-N-ヒドロキシスクシンイミド（N-resorufin-4-carbonyl) piperidine-4-carboxylic acid-N- hydroxysuccinimide）エステル(RESOS)複合体またはアミノフェニルボロン酸を持つフルオレセインイソチオシアネート(FITC)を用いて、グリコシル化ヘモグロビンについてアッセイすることが提案された。

上記試薬の陰イオン性B (OH)^- ₃成分は、グリコシル化ヘモグロビンのシス−ジオール基に結合し、かくしてレポーター標識(たとえば RESOS または FITC)でグリコシル化ヘモグロビンを標識する。

US-A-5631364 (Axis)公報（特許文献２）において、具体的に有効なレポーター標識ボ
ロン酸複合体の一群が記載され、XC-DAPOL-CPBAとしてその中で言及されているキシレン-シアノール（cyanole）-フェニルボロン酸複合体が含まれている。

発色団標識は、この複合体に616 nmでの吸収極大(すなわち、青色)を与え、サンプルにおけるグリコシル化ヘモグロビンの比率は、616 nmならびにヘモグロビンが吸収極大を示す415 nmでのサンプルの吸光度を測定することにより決定できる。

この系を使用する、糖化 (glycatedすなわち、グリコシル化)ヘモグロビンの診断的ア
ッセイは、Axis-Shield PlcからNycoCard（登録商標）HbAlcテストとして商業的に入手できる。このテストの操作において、弱アルカリ性試薬水溶液を血液サンプルと混合し、該混合物を多孔性膜に適用し、該膜をすすいでから膜による光反射率(すなわち膜上に捕獲
されたヘモグロビン)が測定される。

上記試薬溶液は、界面活性剤 (赤血球を溶解しヘモグロビンを遊離化するため)、糖化
ヘモグロビンに結合させるXC-DAPOL-CPBAならびにヘモグロビンを沈殿させるための亜鉛
イオンを含有する。沈殿したヘモグロビンは、糖化および非糖化ヘモグロビンいずれも膜に捕捉され、他の糖化タン白質および過剰ボロン酸複合体は、洗浄過程で膜から洗い去られる。
米国特許第5242842号明細書米国特許第5631364号明細書

しかしながら上記アッセイの結果は試薬の貯蔵期間とともに変動し、約６ヶ月間以上保存されると信頼できないものとなる。臨床検査室は様々な時期からの試験キットを有するかもしれないため、ボロン酸複合体に依拠する糖化ヘモグロビンアッセイの再現性ある精度を増す必要性がある。

上記アッセイの信頼性は、ボロン酸複合体および亜鉛がアッセイキットにおいて別個の試薬として存在するならば改善できることを本発明者らは今や見出している。かくして、本発明は、一つの面として、
沈殿ヘモグロビンを保持することができる多孔性膜;
塩基性水溶液の亜鉛イオンを含むか、または水溶性亜鉛化合物を含む第一試薬;
発色団−ボロン酸複合体を含む第二試薬;
および必要に応じて水性洗浄試薬;
を含み、さらに第一試薬および第二試薬のうち少なくとも１つは、赤血球を溶解するこ
とができる界面活性剤を含有し、ならびに該第二試薬が液体なら酸性であることを特徴とする、糖化ヘモグロビンアッセイのためのキット
を提供する。

本発明キットの第二試薬は溶液であってもよく、乾燥されたかまたは溶媒フリーの物質であってもよい。この試薬は、好ましくは少なくとも界面活性剤を一部含んでもよい。
該試薬が液体である場合、その溶媒は水であるか、または水と混合し得る有機溶媒、たとえばアルコール、エーテル、ケトン、アミド、スルホキシドなどである。あるいはこれらの２以上の混合物であってもよい。好ましい溶媒の例として水、メタノール、DMSOおよびホルムアミドが挙げられる。該試薬は、好ましくは酸(たとえばクエン酸)を含み、液体であるなら、好ましくはそのpHは6未満、より好ましくは5未満である。該試薬が乾燥されているかまたは溶媒フリーであるならば、溶媒が水、メタノール、またはメタノールと水 (好ましくは70容量%までのメタノール、たとえば少なくとも20%、たとえば30〜70%)である溶液を乾燥させることにより調製されることがとりわけ好ましい。溶媒として水の使用が、特に望ましい。驚くべきことにボロン酸複合体および界面活性剤を含む溶液を、たとえば蒸発により乾燥させると油性残渣が残り、このものは該複合体または界面活性剤だけの場合よりも、より急速に水に溶解することが見いだされた。さらにメタノール/水の系が
使用される場合、該残渣はメタノールだけの場合よりもさらにもっと一様に表面をコートすることが見出されている。溶媒として水だけを使用するとき、その結果はさらに良好である。界面活性剤の溶液を乾燥することは、通常、ぼってりとしたポリッジ（porridge）様の残渣となることで問題が多いことは長い間知られていたことは特記すべきである。加えてこの一様で水に急速に分散できる残渣を形成できる能力は最も驚くべきことである。

乾燥または溶媒フリーの形態の第二試薬を製造する際に、ヘモグロビンアッセイを妨害しない水溶性の高分子、たとえばアルブミン(たとえば牛血清アルブミン)といったタン白質を添加することは、とくに長期にわたる保存をしても乾燥残渣はさらに一様であることがわかっていることからとりわけ有益である。第二試薬が液体であるときでもそうした高
分子を含めることは、複合体が沈殿する事態を減らすことからもまた有益である。さらに第一試薬または第二試薬のいずれか、または両方にそれを含めることは、第一試薬と第二試薬とを均一に混合するのに要する時間が短縮できることがわかっている。その結果、第一試薬および第二試薬のいずれか、または両者とも上記高分子の化合物、とりわけBSAを1% w/vまでの濃度、とくに0.025〜0.3% w/v、さらに好ましくは0.05〜0.1% w/vで含むことが望ましい。

該ボロン酸複合体として、たとえばUS-A-5242842, US-A-5631364 および US-A-5739318に記載された発色団−ボロン酸複合体のいずれでもよい。しかし、XC-DAPOL-CPBAが望ま
しい。

上記試薬に使用される界面活性剤は、赤血球を溶解することができる界面活性剤であればどれでもよく、たとえばデオキシコール酸塩（deoxycholate）、トリトンおよびツィーン（Tween）である。しかしながら、トリトンといった非イオン性界面活性剤が好ましく
、とりわけトリトンX-100が望ましい。

第一試薬は塩基性の水溶液であってもよく、あるいは水に溶解し得るか、または塩基性水溶液を生じる水性塩基であってもよい。第二のケースでは、水で元に戻すだけで済む乾燥水溶液であってもよい。

第一試薬は、好ましくは界面活性剤を含んでもよく、さらに他の所望する成分、たとえば無機塩 (たとえば塩化ナトリウムもしくは塩化マグネシウムおよびアジ化ナトリウム)
、グリシンおよび緩衝性化合物を含むことができる。亜鉛は好ましくは無機塩、たとえば塩化物として導入される。主たる溶媒は、好ましくは水であるが、水と混合する他の溶媒が存在してもよい。試薬のpHは塩基性であるが、好ましくは弱塩基性であり、たとえば 7.1〜8.5、好ましくは 8.0〜8.2、とくに約8.1であるのが望ましい。しかしながら第一お
よび第二試薬の混合物が両者を結合したときに塩基性となるようにすべきである。

第一試薬は好ましくは亜鉛を5〜30mM、とくに7〜20mMで、ならびに界面活性剤を0.05
〜0.22 w/vで含み、しかもpH7.8〜8.2に緩衝化することが好ましい。

第二試薬は水性液体であれば、好ましくは0.15〜0.75 mg/g、とくに0.20〜 0.50 mg/g
の複合体、0.05〜0.25% w/v 、とくに 0.1〜0.2% w/vの界面活性剤、ならびに5〜20% v/v、とくに10〜15% v/vの水と混合する有機溶媒 (たとえばホルムアミドまたはDMSO)を含
んでいる。もし第二試薬は乾燥される場合、0.1〜0.5 mg/mL、とくに0.1〜0.4 mg/mL、とりわけ0.15〜0.3 mg/mLの複合体、0.1〜0.5% w/v、とくに0.25〜0.4% w/vの界面活性剤、0.2〜0.6 mM、とくに 0.4〜0.55mMの酸 (たとえばクエン酸)、70% v/vまで、好ましくは0もしくはまで (たとえば 1% v/vより上) 〜50% v/vのメタノール、ならびに好ましくは 0.025〜0.3% w/v、とくに 0.05〜0.1%のBSAを含む水溶液から好ましく形成される。

洗浄試薬は、水性緩衝液たとえばヘペス（Hepes）が便利である。とりわけ好適な洗浄
試薬は、50 mM モルホリン、200 mM NaCl、0.5% w/v トリトンX-100、0.1% w/vグリセリ
ン、0.05% w/v NaN₃、pH 9.1からなる。

本発明のキットで使用される膜は、適切な孔サイズのいずれの膜であってもよいが、ガラス繊維またはホウケイ酸塩フィルター（borosilicate filter）またはセルロース性の
膜で、たとえば孔サイズとして0.5〜1.5μm、とくに 0.8〜1.0μmを有するものである。
望ましくは、吸着層、たとえばセルロース層またはポリエーテルスルホン層（a polyether sulphone layer）が、サンプル適用表面から離れた表面で膜に対して配置され、サンプルおよび試薬を毛細管作用で該膜を通して引き込むように働く。

本発明のキットにおいて、第一試薬および第二試薬(第二試薬が液体である場合) は、
好ましくは２室を分ける脆い膜を有する２室の容器に配置される。これは、たとえば柔軟な容器内部に配置された破壊できる容器(たとえばガラス)の形態をとることができる。その脆い膜の仕切り(たとえば、ガラスバイアルの壁)を壊すことにより、２つの試薬は血液サンプルと接触することとなる前に混合される。

第二試薬が乾燥された物質である場合、それは好ましくはキットにおいて容器の底部および/または壁または栓の表面に塗布されて存在する。このようにして、第一試薬は、第
二試薬の容器に充填され、上記複合体をアッセイ用溶液中に導入するか、あるいは乾燥させた第二試薬で塗布された栓が、液体の第一試薬のバイアル(たとえば予備充填バイアル)の首部分につけられる。第二試薬が液体であれば、乾燥させた第一試薬がアッセイに使
用される溶液中にとり込まれるように用いられる。

供されるキットの試薬容器は、液体の喪失または湿気の進入を防止するためにキャップをつけることが望ましい。

さらに別の側面から、本発明は糖化ヘモグロビンについての血液サンプルのアッセイ方法を提供する。その方法は、
血液サンプルを、赤血球を溶解することができる界面活性剤、発色団−ボロン酸複合体ならびに亜鉛イオンの水溶液と接触させ、
該サンプルをインキュベートしてから、沈殿ヘモグロビンを保持することができる多孔性膜に該サンプルを通し、該膜をフラッシュ（flush）してヘモグロビンに結合していな
い複合体を除去し、
ヘモグロビンおよび該複合体がそれぞれ光を吸収する波長で該膜から反射される光を測定し、
ならびに反射されたその光の強度を測定し、それを血液サンプル中の糖化ヘモグロビ
ンの比率を示す量(たとえば定量的、半定量的または定性的な指示量)を与えるように比
較することを含んでおり、
該複合体および亜鉛イオンは、塩基性水溶液中に亜鉛イオンを含む第一試薬と発色団
−ボロン酸複合体を含む第二試薬とを結合することによって一緒になり、
さらに第一試薬および第二試薬のうちの少なくとも１つが赤血球を溶解することができる界面活性剤を含むものであり、
なお、第二試薬は、液体であれば酸性であることを特徴としている。

明らかに本発明のキットは、本発明のアッセイ方法において使用するのがよい。

上記のように、界面活性剤と複合体との組み合わせは、界面活性剤または複合体単独であるよりも一層容易に水に溶解する。よって別の面から本発明は、不飽和環式有機酸 (たとえば500〜1500Dの分子量をもつもの、具体的にはボロン酸複合体) と界面活性剤(たと
えば非イオン性界面活性剤、とくにトリトン)との溶液 (たとえば、水性溶液、アルカノ
ール（alkanolic）溶液または水性-アルカノール溶液)を乾燥させることにより調製され
る水溶性物質を提供する。そのような溶液は、もちろん該物質が水と接触させた場合に、同様に遊離される溶質を含んでもよい。

［実施例］
限定を目的としない以下の実施例について、本発明をさらに説明する。

実施例2、5および6における第二試薬の乾燥条件および実施例3における溶液前駆体の乾
燥条件は以下のとおり：
プログラム可能な真空コントローラを備えた真空乾燥オーブンまたは凍結乾燥機を使用した。その装置は40〜65分以内に、7〜10 mbarの圧力に到達するようにセットしなければならない。乾燥する試験管の数（液体の量）および凍結乾燥機の種類に依存して、その設定は変化するであろう。よって設定は、プラスチック壁上に乾燥物質の均一な薄膜を生成するように変えられるかもしれない。

ヘレウス（Heraeus）真空乾燥オーブン (VT 6025)については、次のような設定が用い
られてきた(400〜500本の試験管)：
温度: 30°C
P2を得る時間: 5分
P2: 100mBar
P2で留まる時間: 5 分
P3を得る時間: 5 分
P3: 50 mBar
P3で留まる時間: 5 分
P4を得る時間: 5 分
P4: 20 mBar
P4で留まる時間: 5 分
P5を得る時間: 10 分
P5: 7 mBar
P5で留まる時間: 804 分

・二液アッセイ
第一試薬
第一試薬は次を含む：
200mM ヘペス（Hepes）緩衝液
50mM グリシン
18mM ZnCl₂
30mM MgCl₂
400mM NaCl
0.15% w/v トリトン X-100
0.05% w/v NaN₃
pH 8.12
上記試薬は1mLの 1M Hepes、0.25 mLの1M グリシン、2mL のH₂O、0.09 mL の1M ZnCl₂
、0.15 mLの1M MgCl₂、0.4 mLの 5M NaCl、0.075 mLの10%トリトン X-100および0.025 mLの10% NaN₃を混合することにより調製できる。そのpHを、8.12に調整し、水を加えて5 mLとする。

第一試薬は、代わりに次のようにして調製してもよい:
24.6 mgの塩化亜鉛を2.5 mLの水に溶解する。233.8 mgの塩化ナトリウム、 61 mgの塩化
マグネシウム・６水塩、0.05 mLの10% アジ化ナトリウムおよび 0.1 mL の10% トリトン X-100を2.5 mLの水に溶解する。次いで両液を結合する。 476.6 mg HEPES および 37.6 mg グリシンを1.5 mLの水および0.4 mLの 5M 水酸化ナトリウムに溶解する。次に前記HEPES溶液を亜鉛およびトリトン X-100 溶液に加えて、そのpHを8.1に調整し容量を10 mLとする。
第二試薬
第二試薬は以下を含む：
12.4% v/v ホルムアミド
0.32 mg/mL XC-DAPOL-CPBA
0.15% w/v トリトン X-100
上記試薬は、0.11 mLのホルムアミド、 0.52 mLのXC-DAPOL-CPBA (3.15 g/L、ホルム
アミド中) を混合し、ならびに水を加えて5mLとすることにより調製できる。 DMSOをホルムアミドの代わりに用いてもよい。
アッセイ操作:
100 μLの第一試薬を100 μLの第二試薬と混合する。生成混合液を5 μL 血液に加え、2 分間インキュベートする。つぎに25μLのアリコートをガラス繊維フィルター上に置く
。 25 μLの洗浄用溶液 pH 9.1(実施例 4) を加えてその結果をNycoCard（R）リーダーで632および 476nmで読み取った。

・溶液および乾燥複合体アッセイ
第一試薬
第一試薬は次を含む：
100mM Hepes
25mM グリシン
9mM ZnCl₂
15mM MgCl₂
200mM NaCl
0.1% w/v トリトンX-100
0.05% w/v NaN₃
pH 8.12
上記試薬は1mLの1M Hepes、0.25 mLの1M グリシン、2mL のH₂O、0.09 mL の1M ZnCl₂、
0.15 mLの1M MgCl₂、0.4 mLの 5M NaCl、0.1 mLの10%トリトン X-100および0.05 mLの10% NaN₃を混合することにより調製できる。そのpHは、8.12に調整され、水を加えて10 mL
とする。

第一試薬は、代わりに次のようにして調製してもよい：
12.3 mgの塩化亜鉛を2.5 mLの水に溶解する。116.9 mgの塩化ナトリウム、 30.5 mgの
塩化マグネシウム・６水塩、0.05 mLの10% アジ化ナトリウムおよび 0.1 mL の10% トリ
トン X-100を2.5 mLの水に溶解する。次いで両液を結合する。238.3 mg HEPES および18.8 mgグリシンを1.5 mLの水および 0.2 mL の5M 水酸化ナトリウムに溶解する。次に前記HEPES 溶液を亜鉛およびトリトン X-100 溶液に加えて、そのpHを8.1に調整し容量を10 mLとする。
第二試薬
(A) 溶液前駆体
溶液前駆体は、以下を含む：
64.1% v/v メタノール、
0.23 mg/mL XC-DAPOL-CPBA、
0.336% w/v トリトン X-100、
0.48 mM クエン酸
該溶液前駆体は、XC- DAPOL-CPBAをメタノールに溶解して 0.36 mg/mLとして調製する
。この溶液2 mLを、105μLの10% トリトン X-100、1mLの水および 15 μLの0.1 M クエ
ン酸と混合する。
(B) 第二試薬
150 μLの溶液前駆体を蒸発させる。

該溶液前駆体は、代わりに次を含んでもよい：
20% v/v メタノール
0.3〜0.5 mg/mL XC-DAPOL-CPBA
0.34% w/v BSA
0.336% w/v トリトン X-100
0.4〜0.6 mM クエン酸（pH 4.1とするため）
該溶液前駆体は、XC- DAPOL-CPBAをメタノールに溶解して2.5 mg/mLとして調製する。
この溶液2 mLを、4.8 mLの0.7% トリトンX-100、および 2 mLの0.5% w/v BSAと混合する
。pHを0. 1 M クエン酸 (約 50〜60μL)を用いて4.1に調整する。水を加えて10 mL容量とする。使用するXC-DAPOL-CPBA量は、620 nmで32.5の光学密度(OD)を与えるように調整さ
れる。

この溶液前駆体125μLを真空乾燥して第二試薬を得る。
アッセイ操作:
200μLの第一試薬を第二試薬と混合し、次いで血液5μLと混合する。以降のアッセイ
操作は、実施例 1における操作と同じである。

・乾燥させた緩衝液および液体複合体のアッセイ
(A) 溶液前駆体
第一試薬は次を含む：
50 mM グリシンアミド塩酸塩
10 mM ZnCl₂
20 mM MgCl₂
200 mM NaCl
0.1% w/v トリトン X-100
0.05% w/v NaN₃
pH 8.12
13.6 mgのZnCl₂ を2.5 mLの水に溶解する。 116.9 mgのNaCl、 40.6 mgの MgCl₂ x 6 H₂O、 0.05 mLの10% w/v NaN₃ および0.1 mLの10% w/v トリトン X-100 を2.5 mLの水に溶解する。次いで両溶液を混合する。 55.2 mgのグリシンアミド（glycinamide）を、1.5 mLの水および 0.4 mLの5M NAOHに溶解し、次いでこの溶液を前記亜鉛溶液に加える。 pH
を8.1に調整し容量を10 mLとする。
(B) 第一試薬
200 μL の溶液前駆体を真空乾燥させる。
第二試薬
実施例 2において溶液前駆体と言及しているBSA含有溶液を液体形態で使用する。
アッセイ操作:
200μLの第一試薬を第二試薬と混合し、次いで5μLの血液と混合する。以降のアッセ
イ操作は、実施例1における操作と同じである。

洗浄溶液
洗浄溶液は以下を含む：
50mM モルホリン
200 mM NaCl
0.5% w/v トリトン X-100
0.1% w/v グリセリン
0.05% w/v NaN₃
溶液は、成分を混合して調製し、pH 9.1に調整して水を所望の濃度になるまで加える。

溶液および乾燥複合体アッセイ
アッセイ用の物質は、該溶液前駆体が、ボロン酸複合体を0.5 mM NaOHに溶解して0.25 mg/mLとすることにより調製すること以外は、実施例2のようにして調製できる。その際10〜30 分間の撹拌を要する。つぎに該溶液2 mLを0.05 mLの10% トリトン X-100 と混合し
、さらに10分間撹拌する。次いで0. 1Mクエン酸、0.01 mLを加えることによりpHを約4.5
まで下げる。アッセイは、実施例2のように行なわれる。

溶液および乾燥複合体によるアッセイ
アッセイ用の物質は、該溶液前駆体が、ボロン酸を10 mM NaOHに溶解して 2.5 mg/mLとすることにより調製すること以外は、実施例 2のようにして調製できる。この溶液2 mLを、4.8 mLの0.7% w/vトリトンX-100、および 2 mLの0.5% w/v BSAと混合する。pHを0. 1 Mクエン酸 (50〜60μL)を用いて4.1に調整する。水を加えて10 mL容量とする。使用する複合体の量は、620 nmで32.5の光学密度(OD)を与えるように調整される。

アッセイは、実施例 2のように行なわれる。

Claims

沈殿ヘモグロビンを保持することができる多孔性膜;
塩基性水溶液の亜鉛イオンを含むか、または水溶性亜鉛化合物を含む第一試薬;
発色団−ボロン酸複合体を含む第二試薬;
を含み、さらに第一試薬および第二試薬のうち少なくとも１つは、赤血球を溶解することができる界面活性剤を含有し、ならびに該第二試薬が液体なら酸性であり、該ボロン酸複合体および該亜鉛がアッセイキットの別個の試薬に存在することを特徴とする、糖化ヘモグロビンアッセイのためのキット。
さらに水性洗浄試薬を含むことを特徴とする請求項１に記載のキット。
前記第一試薬が、塩基性水溶液の亜鉛イオンを含むことを特徴とする請求項１または2に記載のキット。
前記第二試薬が界面活性剤を含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のキット。
前記第二試薬が乾燥物質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のキット。
前記第二試薬が液体であり、かつ、前記第一試薬および該第二試薬が２室を有する容器に配置され、該２室が脆い膜で分けられていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のキット。
前記第一試薬が界面活性剤を含有することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のキット。
第一試薬および第二試薬の少なくとも１つがアルブミンを含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のキット。
前記第一試薬および第二試薬のうちの一方は液体状態で容器にあり、他方が、該容器に用いられる栓に塗布された乾燥形態にあることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のキット。
血液サンプルを、赤血球を溶解することができる界面活性剤、発色団−ボロン酸複合体ならびに亜鉛イオン水溶液と接触させ、
該サンプルをインキュベートしてから、沈殿ヘモグロビンを保持することができる多孔性膜に該サンプルを通し、該膜をフラッシュしてヘモグロビンに結合していない複合体を除去し、
ヘモグロビンおよび該複合体がそれぞれ光を吸収する波長で該膜から反射される光を測定し、
ならびに反射されたその光の強度を測定し、それを血液サンプル中の糖化ヘモグロビンの比率を示す量を与えるように比較することを含んでおり、
該複合体および亜鉛イオンは、塩基性水溶液中に亜鉛イオンを含む第一試薬と発色団−ボロン酸複合体を含む第二試薬とを結合することによって一緒になり、
さらに第一試薬および第二試薬のうちの少なくとも１つが赤血球を溶解することができる界面活性剤を含むものであり、
なお、第二試薬は、液体であれば酸性であることを特徴とする、糖化ヘモグロビンについての血液サンプルのアッセイ方法。