CN107290310A - 糖化血红蛋白检测试剂盒（荧光淬灭法）制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种糖化血红蛋白检测试剂盒（荧光淬灭法）制备方法。液相硼酸盐亲和荧光淬灭法可定量检测糖化血红蛋白的试剂配方BBZ。本发明主要提供了试剂配方BBZ的主要成分、浓度及制备技术。该试剂可配合糖化血红蛋白分析仪A1C‑YouPan使用，用于临床定量检测糖尿病患者的糖化血红蛋白（HbA1c），也可用于正常人和糖尿病风险人群的监测。

Description

糖化血红蛋白检测试剂盒（荧光淬灭法）制备方法

技术领域

本发明涉及糖化血红蛋白检测试剂盒（荧光淬灭法）的制备方法，属于生物化学定量分析的范畴。

背景技术

与血糖检测相比，将HbA1c用作诊断试验确有优势，2011年WHO（World HealthOrganization,世界卫生组织）发表了用HbA1c诊断糖尿病的咨询报告，明确了HbA1c可以用于糖尿病的诊断，并推荐HbA1c≥6.5％作为糖尿病的诊断切点。

我们的糖化血红蛋白检测试剂盒（荧光淬灭法）性能稳定，具有准确度高、不易受干扰的优点。糖化血红蛋白检测试剂盒（荧光淬灭法）是配合一款POCT（point-of-caretesting）的检测设备使用，操作简单，而且我们的试剂盒配方采用液相硼酸盐亲和的方法，不涉及生物抗体，准确度高，不易受干扰。与目前国内的糖化血红蛋白检测试剂盒（免疫荧光法、免疫比浊法、免疫层析法）相比，具有明显优势。文献报道，免疫方法易受干扰物质及抗体质量的影响。造成干扰主要表现在三个方面。首先，被检测物质的某些物理性质例如颜色、荧光性、光分布等。干扰物质也可改变样本的物理性质例如表面张力、粘度、浊度、离子强度。第二，干扰物质的化学性质也可改变酶活性、破坏试剂成分、抑制或增强指示反应。干扰物质也可促使检测物质形成复合物。第三，干扰物质可有非特异性亲和反应影响。我们使用的糖化血红蛋白检测系统有三个主要的特征能够避免干扰物质的影响。首先，我们使用液相硼酸盐亲和糖化血红蛋白引起荧光淬灭而进行检测。液相硼酸盐亲和糖化血红蛋白的方法与以上免疫方法相比，由于不涉及抗体，采用的硼酸盐只能特异性结合糖类物质，所以不易受到干扰物质影响。第二，当样本加入到反应液里时，进行了大比例的稀释，4μL的血液加到2 L反应液里，稀释比例为1:500，如此大的稀释比例将会大大限制潜在干扰物质的影响。第三，分析系统使用荧光检测HbA1c，荧光基团发射出580nm的波长，主要潜在的干扰物质例如胆红素，在这个波长下不会有干扰产生。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过液相硼酸盐亲和荧光淬灭的原理可进行检测糖化血红蛋白含量的试剂盒配方及制备技术。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

（1）荧光物质的选择，曙红（又名伊红）是一种可发荧光的氧杂蒽类弱酸性有机染料，曙红荧光素由于具有高的发射效应、高荧光量子产率而被广泛应用于生物、医学领域。选取曙红—5-硫脲苯基硼酸三乙基胺盐作为主要反应物质。

（2）试剂杯材质的选择：聚甲基丙烯酸甲酯，俗称有机玻璃，具有较好的透明性、化学稳定性，力学性能和耐候性，易加工，外观优美等优点。

（3）不锈钢珠包被曙红—5-硫脲苯基硼酸三乙基胺盐

（4）配制荧光物质的水溶液（附表1），控制点温度，pH，浓度。

（5）分装溶液，试剂杯里分装2 mL反应试剂压内层铝箔膜，盖蓝色杯盖。在蓝色微孔里加入步骤2的包被曙红复合荧光物质的不锈钢珠，再次压外层铝箔膜。

表1

成分	含量
		氯化铵	0.535%
叠氮化钠	0.05%
		乙二胺四乙酸钠（EDTA）	2*10-8%
脱氧胆酸钠	0.4%
		Triton-100（辛基苯基聚氧乙烯醚）	3*10-8%

本发明的优点和有益效果：

本发明应用红细胞裂解液和荧光淬灭技术定量测定糖化血红蛋白，提供了反应试剂的配方成分及配制技术。该试剂盒性能稳定，准确度高，线性良好，精密度高配制操作简单，试剂盒是完全封闭的，不易受环境影响，同时不污染环境，对操作者安全，没有毒害作用。配合糖化血红蛋白分析仪A1C-YouPan配套使用，4分钟就出结果，实验步骤少，操作简单，减少患者的等待时间，提高了临床检测的效率。

附图说明

图1 糖化血红蛋白检测试剂盒试剂杯。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。

实施例1：试剂珠包被

不锈钢珠的制备采用4摄氏度孵育法。

试剂珠包被具体操作如下：称取0.0132g曙红偶联荧光物质，溶于160ml乙醇，将带底托的770个不锈钢珠浸泡溶液中，4摄氏度孵育过夜。

实施例2:试剂的配制

配制稀释液：首先将Triton-100稀释成体积分数为0.3%的溶液1，再将溶液1稀释10倍形成溶液2（浓度为3×10^-2%），继续稀释1000倍形成溶液3（3×10^-5%）作为母液备用。

配制1M氢氧化钠标准溶液：称取4.0g氢氧化钠溶于80 mL纯化水，溶解后定容至100 mL

配液：将5000 mL烧杯置于磁力搅拌器上，加入1000 mL去离子纯化水，分别称取8.56g氯化铵、6.4g脱氧胆酸钠加入烧杯中，溶解后加入1.6 mLTriton-100溶液3和0.32 mL的proclin300，混匀后加入去离子纯化水，转移至量筒定容至1600 mL 。使用氢氧化钠溶液调节pH到9.0。

实施例3:分装反应混合液

拿住购置的试剂杯（图1）的上部，加入2ml反应混合液，严禁接触底部。此杯相当于石英杯的作用，如污染将影响荧光吸光值。加入反应混合液以后，迅速压上内层铝箔膜，盖蓝色杯盖。此时将实施例1得到的不锈钢珠加到蓝色杯盖的小孔位置。不锈钢珠的作用除了包被荧光物质外，还相当于磁力搅拌器的作用（糖化血红蛋白分析仪检测室有电机装置）。最后，压外层铝箔膜。全部分装以后，将试剂杯装盒低温2-8摄氏度保存。

Claims (2)

1.液相硼酸盐亲和荧光淬灭法定量检测糖化血红蛋的试剂配方BBZ。

2.试剂配方成分、浓度及配制技术。