CN101416054A - 荧光测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了通过分别地估测归因于固有滤波效应的不依赖于时间的改变，和估测由测定化学所引起的依赖于时间的改变而估测荧光测定中非荧光物质(例如，血红蛋白)浓度的方法和装置。这种方法排除了单独的光测或其它测定的需要，因此简化了方法学和相关的装设仪器。

Description

荧光测定法
技术领域
本发明涉及对样品中非荧光物质进行测定的方法，进一步地涉及用于根据这种方法进行测定的装置。
背景技术
欧洲专利号EP 0,772,779描述了通过荧光猝灭的糖化蛋白质的测定法。如该文献所示例的现有技术描述了利用荧光猝灭的糖化血红蛋白的测定法，所述荧光猝灭是当所述糖化血红蛋白结合通过特定荧光团与硼酸基团的化学连接产生的缀合物时产生的。然后，这种依赖于浓度的猝灭与通过现有技术确定的传统光度测定法所测定的总血红蛋白的测定进行比较。
然而，在该现有技术方法期间，存在不可避免的非特异性水平的荧光猝灭，其不是由所述缀合物与糖化血红蛋白结合引起的，而是由固有的滤波效应引起的。这种固有的滤波效应是由血红蛋白分子本身所引起的，该血红蛋白分子本身吸收由血红蛋白吸收光谱与荧光激发和发射光谱的光谱重叠所引起的激发辐射和发射的荧光。在计算中必须补偿这种背景荧光猝灭，以允许特定猝灭的定量，该特定猝灭只是归因于糖化血红蛋白的浓度和由此它的量子。EP 0,772,779的发明人通过在适合的波长(例如，405nm或415nm)测定反应溶液的光密度，和根据该光密度测定减去总荧光猝灭的按比例要素，完成了这个。
在EP 0,772,779中公开的方法中，利用传统的光测方法诸如，在405nm或415nm吸光度测定总血红蛋白浓度。对于如这里所述的起作用的方法，使用者必须在独立的仪器上进行两个独立的测定：光度计测定总的光密度和荧光计测定荧光猝灭。对于具有任何商业应用的检验，例如在糖尿病治疗中，为该检验特定设计和制造的任何仪器必须因此具有荧光计和光度计的双功能性。这是昂贵的，更复杂的和不期望的。
如EP 0,772,779中所描述的通过血红蛋白的荧光猝灭具有两个组成。首先，在荧光激发和发射波长，与血红蛋白样品结合的初始瞬间荧光下降就象中性密度滤光片一样起作用；其次，与糖化血红蛋白和荧光缀合物试剂的化学结合的时间过程相关的依赖于时间的荧光信号猝灭。
发明内容
如上所述和下面进一步讨论的，本发明的目的是克服现有技术方法的问题，希望开发出显著改进的测定方法，以及设计一种自动获得期望结果的仪器。作为该仔细研究的结果，本发明人已经确定通过下面的荧光改变时间过程作为测定反应进程，可以从依赖于时间的荧光猝灭单独测定不依赖于反应化学的背景荧光改变，即，瞬时减少或增加，该依赖于时间的荧光猝灭归因于靶化合物与荧光试剂的化学结合。从这个出发，他们也已经发现当向荧光试剂添加物质时，测定荧光的改变，尤其是猝灭效应的改变可以用于计算本身不是荧光的物质的浓度。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种对样品中非荧光物质进行测定的方法，该方法包括：
(a)在溶液中进行测定样品和荧光标记化合物之间的反应，在时间t0，样品和标记化合物结合；
(b)激发标记化合物中的荧光，其中标记物的性质和激发的性质是这样的：即，在通过标记化合物和非荧光物质的反应改变所述荧光的波长发生所述的荧光；
(c)随着反应进程检测所引起的荧光；
(d)从所检测的荧光计算F0和F∞值，F0是在时间t0时的荧光，F∞是在时间t∞时的荧光，这是所有的非荧光物质已经与标记化合物反应，或者反应已经达到平衡时的点；
(e)从F0和F∞值计算由于步骤(a)中反应的荧光中背景改变；和
(f)从所计算的值和适合的校准算法，确定与荧光标记化合物反应之前，在t0时，样品中存在的非荧光物质的浓度。
如这里所用的，当提到待要测定的物质(分析物)时，术语非荧光不意指物质完全是非荧光的。而是它意指在相关的激发和发射波长，它具有对荧光标记化合物的不同激发和或发射光谱。
本发明的目前主要期望的应用是血液中糖化血红蛋白的测定。实际上，本发明的起源在于改善该测定的方法，特别是测定样品中糖化血红蛋白(即，葡萄糖已经非酶促地结合的血红蛋白)的数量或比例。因为这个原因，尽管本发明同样可以应用于许多不同物质，特别是这样的物质，其中样品含量的吸收特征易于干扰适合荧光团的荧光特征的物质的测定，下面的说明书将更经常地在这方面描述本发明。
本发明的第一方面需要对待测定物质特异的标记化合物和由于标记物和物质的结合而适合地改变(可能是增加，但是更经常地是减少)的荧光。
标记化合物通常将包含荧光团和适合选择性结合物质的连接基团。可以基于实验检验或基于现存荧光团和连接基团相对于待检测物质的已知特征进行针对特定靶物质的适合荧光团和连接基团联合的选择。在EP 772,779中提到了一系列已知的荧光团，其内容在这里并入为参考文献。对于糖化蛋白质诸如糖化血红蛋白，适合的标记可以包含硼酸基团，其通过连接基团结合荧光素衍生物。硼酸结合糖化蛋白质的顺式二醇基团，但不是蛋白质特异的。优选地，该方法特别地适合糖化血红蛋白和可能具有下列结构式的适合标记物的检测：
Figure A200780012278D00071
在(f)部分中所用的校准算法可以具有公式y＝mx+c，其中m和c是斜率和截距校准常数，x＝(F0—F∞)/F0。靶非荧光物质可以是主物质(例如，所有形式的总血红蛋白)的亚种(例如，糖化血红蛋白)，并且与主物质比较，亚种将选择性地与标记化合物反应。在这种情况下，可以期望知道与荧光标记化合物反应前，t0时样品中存在的主物质(包括亚种)的总浓度。这可以从计算值和公式y＝m’x+c’的适合校准算法来确定；其中m’和c’是斜率和截距校准常数，x＝Log(FBlank/F0)。
在步骤(d)中F0和F∞值的计算优选地包括根据时间绘制检测的荧光数据，和对标绘点应用最佳适合曲线。绘制可以是实际的，乃至手动的，但是常常通过使最佳适合曲线的数学函数适合于数据，并且外推该函数至时间t0和t∞来自动和数学地获得该绘制，而不用产生这种图表。可以通过任何适合的数学方法获得曲线适合，并且在该说明书的后面描述两种特别适合的数学方法。利用这些体系，所记录的数据用于最小化差异，然后外推该曲线以提供F0和F∞值
在完全自动的仪器系统中，当向试剂添加血液，并且通过仪器混合时，在血液添加和混合后最初的大约5秒内可能测定初始的猝灭。然而，在非自动的系统中，由于操作者向包含试剂的反应池物理地添加血液样品，混合及将反应池返回荧光计所需要的有限时间，进一步延迟了初始结合反应的监测。因此，血液样品添加后在t0时的即刻实际的荧光水平不能在手动或自动系统中直接地被测定。为了克服该问题，在时间t0时，即，样品添加和混合后，但是反应发生前即刻的荧光水平F0是基于化学结合反应的速率公式，通过适合于时间过程荧光数据的曲线后退外推而被确定。而且，通过数据收集期间以外的该曲线适合的前进外推，也确定了在时间t∞时，反应端点的荧光水平F∞。
该方法中在t0和t∞时确定荧光水平已经表明产生了可靠和精确的结果。
测定反应混合物荧光的时间期间可以是适合于测定法使用的任何时间期间。长的期间给出了更大的精确性，但是较慢的测定过程，而短的期间是方便的，但是可以引起不太精确的结果，因为外推的数据量稀少。测定期间的适合长度将取决于被测定的物质和它与荧光标记物反应的时间表。在血红蛋白硼化物结合顺式二醇基团的情况下，约3分钟的测定期间通常是合适的。
优选地，在步骤(a)中，样品与标记化合物结合前，通过适合波长λn(即，与样品反应期间激发发生的波长是相同的)的入射电磁辐射单独激发标记化合物(其通常是试剂溶液的形式)，并且检测在发射频率的所引起的初始荧光(FBlank)。这联合F0值可以用于计算荧光中初始的改变，接着，利用下面的等式，该初始的改变可以用于计算荧光光密度(FOD)：
FOD＝Log[FBlank/F0]           (等式1)
该初始背景改变(通常地猝灭效应)的对数函数被命名为FOD。已经发现FOD与给定波长的反应溶液的光密度直接成比例。在测定涉及血红蛋白的情况下，它与在415nm测定的光密度成比例(参看图3)。因为，接着，在415nm的光密度与总血红蛋白浓度成比例，因此，背景荧光猝灭的测定也可以用于确定总血红蛋白浓度。因此，这种总血红蛋白的背景荧光猝灭确定可以用于替代光密度确定，否则需要通过单独的光测装置进行光密度确定。
每次测定前，不是必需都要确定FBlank，因为根据所用的反应池和标记化合物，该值可以是标准或恒定值。
根据本发明的第二方面，也提供了一种确定非荧光物质浓度的方法，包括激发匹配的荧光试剂的激发和发射光谱，该光谱重叠非荧光物质的吸收光谱；检测由此引起的荧光；向匹配的荧光试剂添加非荧光物质；添加后检测荧光；和从非荧光物质添加前后所检测的荧光之间的差异计算非荧光物质的浓度。
利用与所确定的标准比较的光密度测定，计算溶液中物质的浓度是公知的。然而，本发明的第二方面允许不使用光度计的情况下实验地推导浓度。
可以使用其中非荧光物质和试剂之间没有反应的本发明第二方面的方法，其可以与上述标记化合物类似。然而，可以存在改变(增加或减少)所检测荧光的依赖于时间的反应。通过监测这个，并且如第一方面所述，绘制图表(实际上或概念地)，通过从所测定的数据外推可以精确地估测初始改变效应的值。
当测定不与标记物反应以改变荧光的物质浓度时，不需要外推，因为样品添加后花费一些时间的荧光测定将与此后即刻的荧光测定一样。但是，当样品与试剂反应时，后退外推到t0可以用于克服直接测定F0值的无能为力。
因为本发明的各个方面都描述了对所存在的物质的量或浓度，或者由单独荧光数据分析而存在的物质亚种的量(诸如，总血红蛋白中糖化血红蛋白的水平)进行精确测定的方法，任何相关仪器的设计和构造都大大简化，结果费用也显著降低。特别地，不包括分光光度计的简化装置可以用于给出更好的结果。
根据本发明的第三方面，其进一步提供了一种用于样品中物质测定及利用荧光标记物的装置，其中该装置包括：
(a)适于容装荧光标记物和测定样品量的反应容器，其中在时间t0开始，标记化合物一起和样品中物质经历了反应，在改变标记化合物荧光特征的时间t∞时结束；
(b)具有波长λn的电磁辐射源激发标记化合物中荧光；
(c)检测装置随着反应进程测定所引起的荧光。
(d)处理器，其适于(1)当所有的物质已经与标记化合物反应时，从所测定的荧光计算F0和F∞值，F0是在时间t0时的荧光，F∞是在时间t∞时的荧光；(2)计算荧光中任何背景改变，该背景改变不归因于和归因于物质和标记化合物之间的反应；和(3)由所计算的值确定t0时样品中存在的非荧光物质和/或其亚种的量；
对于本发明的这些方面而言具有的益处是：样品的至少一种组成成分，它是待要被定量的物质，与期望物质比较需要定量的相关物质，或污染物都必须具有吸收光谱，该吸收光谱在某些程度上与荧光标记物/试剂的激发和发射光谱重叠。因此，激发辐射的波长和荧光标记物的性质必须互相匹配以，并且基于要进行测定的性质来选择它们，所述性质接着包括待要定量的物质和样品中易于发现的其它物质的特征。
这里所述的本发明的方法和装置的许多修改对本领域技术人员而言显而易见，并且这些修改落入了本发明的保护范围内。然而，为了更好地理解它的原理，只是通过实施例的方式，现在将参考适合附图的一些实施例详细地描述本发明。
附图说明
图1是图表，图示了在415nm的光密度(OD)和所添加的血红蛋白量之间的关系。
图2是糖化血红蛋白/曙红-硼酸结合反应期间荧光信号时间过程的绘图。
图3是图表，表示在415nm的OD和由背景荧光猝灭所获得的FOD之间关系。
图4是图表，表示不同血红蛋白类型之间的光谱差异。
图5是图表，表示胆红素的吸收光谱。
图6是实施例1中样品1根据时间的荧光数据的图表绘图。
图7是实施例1的糖化血红蛋白浓度对特异性猝灭的绘图。
图8是实施例1的总血红蛋白浓度对荧光光密度(FOD)的绘图。
具体实施方式
本发明可以用于测定血液中血红蛋白，特别是糖化血红蛋白。在该方法中，荧光标记化合物，其可以是荧光素-硼酸或者如该实施例是曙红-硼酸化合物，被引入到小池中，并且在引入血液样品之前，通过在适合波长(510nm)的EM辐射在荧光计中激发它，并且通过检测在580nm的发射测定荧光空白(FBlank)。选择这些波长是因为随着移除曙红Y激发峰，发现了改善的测定性能。对应于血液中所发现的许多不同血红蛋白物种(即，羧基血红蛋白，氧化、脱氧化、间位血红蛋白)吸收光谱的点的所选定的激发波长具有最小的差异。同样地，选定580nm(带有40nm的通带)所监测的发射波长，以最小化发射通带上各种血红蛋白物种的整体吸收之间的差异。从小池移除荧光计或留在原位，立刻添加血液样品，并混合，并且检测和记录随着时间过程中的荧光。绘制这个数据，并且曲线适合数据组。图2表示这种反应时间表，其中在t0(11)时，样品引入前，记录标记的初始荧光FBlank10。从手动系统中小池的再次引入或在自动系统中在点13混合后，随着时间流逝(通常以1秒的间隔)记录反应的实际实验荧光数据，直到适合的期间已经过去为止。通过后退外推，在t0(11)时确定荧光水平F0(参看标记14的点)，即，当样品已经被添加，但是没有发生与标记物的反应的点。通过前进外推(其没有示出，因为测定数据的末端不在图2图表中)，相似地确定在反应端点t∞时的荧光水平F∞(15)。
许多潜在的曲线适合程序中的两个已经被证明在F0和F∞的外推估测及随后的FOD推导和特异性猝灭中是有效的。
在第一个中，利用基于下面的通用速率等式(等式2)的曲线适合程序，基于3分钟测定中每个第二测定点的荧光测定的Ft-actual进行估测的Ft-estimate：
Ft＝F0+(F∞-F0)×(1-e-t/θ)       等式2
其中
Ft＝在时间t秒时的荧光
F0＝在时间0时的荧光
F∞＝在无穷大时间的荧光(即，在反应终点)
e＝2.7813(自然对数底)
θ＝速率常数
利用通过最小化在每个第二数据点的适合和测定数值之间的平方差总和而迭代确定的F0、F∞和θ，即，通过适合程序最小化∑(Ft-actual-Ft-estimate)2。
第二种方法使用了第二顺序化学反应的速率等式，代替上面所用的通用速率等式(等式2)。
因此：
A+B→C
V0＝k[A][B]
其中，
V0是反应速率
k＝速率常数
速率常数k被定义为：
k＝A.e-E/(RT)
其中，
E＝常数，
A＝活化能
R＝气体常数，及
T＝绝对温度
V0用于计算每秒的荧光强度，改变的反应物浓度，然后，重新计算的V0用于下一个时间点。通过调整如前面例子中的E、A和R值，迭代过程最小化估测值和测定值之间的平方差总和。
然而，应该注意到至少在血红蛋白定量的情况下，本发明涉及估测由荧光猝灭引起的初始荧光下降的原理，该荧光猝灭是由于血红蛋白的固有滤波效应，然后可能利用这个来估测样品中物质或实际上任何猝灭材料的浓度。通过实际中同样可接受的曲线适合的其它方法可以获得数据的数学模拟。
通过下面的表达式确定FOD参数、荧光光密度：
FOD＝Log[FBlank/F0]       (等式1)
已经发现FOD与总血红蛋白浓度线性相关。已经表明血红蛋白浓度与415nm的血液样品的光密度成比例，并且图3表示FOD直接地与样品的OD成比例。当测定血液样品的血红蛋白时初始改变是下降(猝灭)，当初始改变计算为对数函数(FOD)时，其与在其它波长，通过吸收光度学的血红蛋白测定相关。
除了上述的益处，特别地在血液的糖化血红蛋白的存在或定量测定中，本发明也具有其它重要的有益的效果。根据供体血液的氧化状态和他/她的生理学条件，红细胞中血红蛋白以各种状态存在。脱氧血红蛋白、氧化血红蛋白、羧基血红蛋白、巯基血红蛋白和间位血红蛋白是其中的一些类型，或者可以根据血液样品的年龄和来源，以变化的量存在于血液样品中的血红蛋白的化学修饰。每种类型的血红蛋白的特征在于当受到变化波长的光时，具有唯一的吸收光谱(参看图4的氧化血红蛋白和脱氧血红蛋白的比较)。贮藏和加工过的血液样品特别地累积显著比例的间位血红蛋白，其中铁离子被氧化，改变了其吸收光谱，并且是其深红色/褐色着色的原因。
如EP 0,772,779所示例的现有技术没有意识到或反驳由于血红蛋白分子固有的吸收及由于血红蛋白分子与荧光缀合物的光谱重叠，带有血红蛋白分子相关吸收光谱的血红蛋白分子状态对其猝灭荧光能力的影响。实际上，它期望在405或415nm的血红蛋白测定精确地预测由于样品中血红蛋白的存在而引起的初始猝灭下降。这只对具有相同光谱的血红蛋白样品是正确的，因为初始猝灭下降是由对应于所用荧光团的激发和发射波长λn的次级血红蛋白吸收峰引起的。是次级吸收峰显示了血红蛋白状态之间的最大变化性。
测定中血红蛋白类型的这些差异是如此的显著以致于为了校准该测定，必须使用与研究的未知样品具有相同血红蛋白类型组分的标准。当然，实际中，即使从手指刺伤或从静脉穿刺术新抽取的样品，在测定时，个体血红蛋白分布图的状态是未知的，因此，由于不可接受的不精确性可能发生，用作非常仔细方法点的测定是妥协的。
而且，对HbAlc和其它糖化血红蛋白的临床测定常常经受验证过程，该验证过程包括通过中心实验室的贮藏血液样品的分配和通过不同系统的它们的同时分析。如果在新鲜的患者样品和贮藏或实验室管理的血液样品之间不进行相同地测定，将出现不可接受的偏差，并且测定将不能获得正确的值。
因此，除了装设仪器和测定要求简化外，本发明另外的益处是这样的事实：基于样品的固有荧光猝灭的光密度测定(FOD)减少了误差，通过给定个体的血红蛋白分布图的复合光谱中差异，该误差可以引入到检验方法学中，因为在这些波长的各种血红蛋白类型的光谱更接近地匹配。
本发明的最后的有益效果是减小由许多干扰因素的存在而引起的误差，该干扰因素可能影响在405或415nm的吸收测定。例如，本身表现为黄疸(即，皮肤和眼球变黄)的患有肝病的患者具有胆红素的高循环水平。胆红素是血红蛋白代谢的循环副产物，与血红蛋白的主峰具有明显的重叠吸收(图5)。现有技术的方法，是从在血红蛋白主吸收峰的血红蛋白光密度测定来估测背景荧光猝灭，该方法将受升高循环水平的胆红素的影响。本发明通过在大于500nm波长的背景荧光猝灭估测总血红蛋白来排除该潜在的误差来源。
实施例1
向反应池引入已知体积(2.5mL)包含缓冲液(主要是HEPES)的试剂和荧光标记化合物(硼化曙红)。这被引入到本发明的仪器中，并且在510nm被激发。以1秒间隔读取空白荧光读数。
然后，在时间t0，总血红蛋白含量/浓度和糖化血红蛋白的百分比已知的一定体积的血液被引入到反应池中，并且混合。然后，每秒测定在510nm的荧光，直到3分钟的反应时间为止。从大约第7秒起，仅记录荧光中引起混合结果所花费的时间。
在下面的表1中列出了荧光信号和参照的空白和血液读数。
表1
Figure A200780012278D00141
Figure A200780012278D00151
Figure A200780012278D00161
Figure A200780012278D00171
除了原始的荧光数据，表1也表示了对该数据进行的各种数学运算。第一个数学运算是从空白和血液读数的原始荧光数据减去该荧光背景(FBgd)。荧光背景信号(FBgd)来源于缓冲液的读数，该缓冲液没有荧光标记试剂存在，并且其读数以前测定过。它主要是读数器常数，该背景主要是荧光计的电零位；因为已经优化了荧光计的滤光器以从缓冲液有效地将“滤光器突破(filter breakthrough)”减少为零。
对最后三个空白读数进行平均以确定FBlank。
校正的荧光数据然后除以参照。如果根据时间绘制这个，就产生了如图6所示的曲线。利用前述的适合算法，曲线与这些数值适合，并且数值(如右手栏所示)也被绘制在图6中图表上。通过分别与t0和t∞适合的数据的后退和前进外推，可以推导出该样品的F0和F∞值。
表2表示对20个样品进行等同测定的结果。表1中的样品(样品1)测定伴随有19个其它样品，这些样品也具有已知的总血红蛋白的参照量(总Hb)，糖化血红蛋白的浓度([Alc])和糖化血红蛋白的百分数(％Alc)。
FBlank(校正的)是表1中空白的“荧光信号/荧光参照”值的平均数。
对于每个样品，利用下面的公式，从FBlank、F0和F∞计算荧光光密度(FOD)和特异性猝灭(SQ)：
FOD＝Log[(FBlank-FBgd)/(F0-FBgd)]  [等式1B]
SQ＝(F0-F∞)/(F0-FBgd)            [等式3]
从FOD和SQ，分别计算总血红蛋白的浓度和糖化血红蛋白(Alc)浓度。
[总Hb]＝m.FOD+c                  [等式4]
[Alc]＝m’.SQ+c’                [等式5]
校准常数m、m’、c & c’是从利用已知[Alc]和[总Hb]浓度样品的标准曲线(直线)测定数据推导出的。对于c & c’是零的样品数据，在两个绘图中都已经限制了该数据，使其经过零。
然后，由此计算样品中糖化血红蛋白的百分数：
％Alc＝([Alc]/[Hb])*100％                [等式6]
％Alc＝((m’.SQ+c’)/(m.FOD+c))*100      [等式7]
如果根据FOD绘制总血红蛋白浓度的值，已经发现它们是直接地成比例的，并且可以根据等式y＝mx+c概括该图表，该等式中y是总血红蛋白浓度，x是FOD。然后，可以计算特定组的特定反应参数的m和c以产生标准校准曲线。图8表示样品1到20的[总Hb]对FOD，同时通过等式y＝mx+c概括与其适合的线条。
同样，已经发现了特异性猝灭与Alc浓度直接成比例，并且根据等式y＝m’x+c’可以概括该图表，该等式中y是糖化血红蛋白浓度，x是特异性猝灭。然后，可以计算特定组的特定反应条件的m’和c’以给出进一步的标准。图7表示样品1到20的[Alc]对SQ，同时通过等式y＝m’x+c’概括与其适合的线条。
对于该实施例，在下面的表3中示出了源自这些的标准。
表3
 
[Alc]对SQ斜率＝m’ 0.1302
[Alc]对SQ截距＝c’ 0
[总Hb]对FOD斜率＝m 1.318
[总Hb]对FOD截距＝c 0
推导特定组反应标准的这些校准常数，并且这些常数可以用于利用相同标准的随后的测定。不同的反应条件可以要求推导不同的校准常数。
表2表示糖化血红蛋白计算的百分比数值，以及与已知值的比较表明本发明测定法的精确性质。实际上，样品数据组中误差的标准偏差刚好是0.4％Alc，证明了本发明的精确性。
Figure A200780012278D00201

Claims (19)

1.一种对测定样品中非荧光物质进行测定的方法，该方法包括：
(a)在溶液中进行测定样品和荧光标记化合物之间的反应，在时间t0时，样品和标记化合物结合；
(b)激发标记化合物中的荧光，其中标记物的性质和激发的性质是这样的：即，在通过标记化合物和非荧光物质的反应改变所述荧光的波长发生所述的荧光；
(c)随着反应进程检测所引起的荧光；
(d)当所有的非荧光物质已经与标记化合物反应时，从所检测的荧光计算F0和F∞值，F0是在时间t0时的荧光，F∞是在时间t∞时的荧光；
(e)从F0和F∞值计算由于步骤(a)中反应的荧光中背景改变；
(f)从所计算的值和适合的校准算法，确定非荧光物质与荧光标记化合物反应之前，在t0时样品中存在的非荧光物质的浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之前，标记化合物被激发，并且检测所引起的初始荧光(FBlank)。
3.如权利要求2所述的方法，其中利用下面的等式，F0和FBlank的值用于计算荧光光密度(FOD)：
FOD＝Log[FBlank/F0]        (等式1)
4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中步骤(d)中F0和F∞值的计算包括使最佳适合曲线的数学函数适合数据，并且外推该函数到时间t0和t∞。
5.如前述任一权利要求所述的方法，其中在(f)部分中所使用的校准算法具有公式y＝mx+c，其中m和c是斜率和截距校准常数，并且x＝(F0-F∞)/F0。
6.如前述任一权利要求所述的方法，其中非荧光物质是主物质的亚种，并且亚种选择性地与标记化合物反应，其中从计算值和公式y＝m’x+c’的适合校准算法，确定在与荧光标记化合物反应之前，在t0时样品中存在的主物质和亚种的总浓度，其中m’和c’是斜率和截距校准常数，并且x＝Log(FBlank/F0)。
7.如前述任一权利要求所述的方法，其中待要测定的物质是糖化蛋白质，并且优选地是糖化血红蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其中标记化合物包含硼酸基团，该基团能够选择性地结合糖化蛋白质的顺式二醇基团。
9.如前述任一权利要求所述的方法，其中荧光标记化合物在200nm到800nm的范围，优选地约510nm具有主要激发波长。
10.如前述任一权利要求所述的方法，其中荧光标记化合物包含荧光素残基。
11.如权利要求10所述的方法，其中荧光化合物是分子式F-NH-CS-NH-Ph-B(OH)2的基团，其中Ph是苯基，F是荧光素残基。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中荧光化合物是结构式I的化合物：
Figure A200780012278C00031
13.如前述任一权利要求所述的方法，其中样品是血液样品，血浆样品、血清样品或尿液样品。
14.如权利要求1所述的方法，以及基本上如这里所述的。
15.一种检测非荧光物质浓度的方法，包括激发匹配的荧光试剂的激发和发射光谱，该光谱重叠非荧光物质的吸收光谱；检测由此引起的荧光；向匹配的荧光试剂添加非荧光物质；添加后检测荧光；和从非荧光物质添加前后所检测的荧光之间的差异计算非荧光物质浓度。
16.如权利要求15所述的方法，其中随着时间的过去，物质与荧光试剂反应以改变荧光，并且在物质添加后开始至少5秒的时间期间检测荧光数值的范围，并且该测定数值的范围用于时间t0时，物质添加后直接外推荧光数值。
17.一种用于样品中物质测定的装置，该装置包括：
(a)荧光标记化合物的供应；
(b)适于容装荧光标记化合物和测定样品量的反应容器，其中在时间t0开始，它们一起经历了反应，在改变标记化合物荧光特征的时间t∞时结束；
(c)具有波长λn的电磁辐射源激发标记化合物中荧光；
(d)检测装置随着反应进程测定所引起的荧光；和
(e)处理器，其适于当所有的物质已经与标记化合物反应时，从所测定的荧光计算F0和F∞值，F0是在时间t0时的荧光，F∞是在时间t∞时的荧光；其适于计算荧光中任何背景改变，该背景改变不归因于和归因于物质和标记化合物之间的反应；和其适于由所计算的值确定t0时样品中存在的非荧光物质和/或其亚种的量和/或浓度。
18.如权利要求17所述的装置，其适于接收来源于血液的样品，并且进行测定以确定血红蛋白和/或糖化血红蛋白的量。
19.如权利要求17或18所述的装置，其中λn约是510nm。
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