CN108896750A - 一种BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器的制备方法和用途 - Google Patents

一种BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器的制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学领域，提供了一种BSA‑Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器的制备方法和用途。该发明包括(1)制备BSA‑Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器；(2)尿酸酶催化尿酸生成H2O2；(3)用BSA‑Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器检测H2O2，从而检测尿酸含量。与现有技术相比，BSA‑Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器不仅具有荧光传感器时间短，操作简单，无需处理前期样品，无毒性，成本低等优点，还较于单荧光传感器有更高的灵敏度和准确度。血清中尿酸水平与人体疾病息息相关，发明一种比例型荧光传感器检测尿酸具有重要的意义。

Description

一种BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器的制备方法 和用途
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器的制备方法和用途。
背景技术
尿酸(2，6，8-三羟基嘌呤)是人体核蛋白和核酸中嘌呤分解代谢的最终产物。当机体出现代谢紊乱时，会引起嘌呤过量，嘌呤代谢产生的尿酸也相应增加。一般来说，尿酸水平过高会引起人类的相关疾病，例如痛风，肾脏疾病和心血管疾病等。因此，在临床诊断领域中分析尿酸来早期诊断嘌呤代谢疾病是非常必要的。
迄今为止，人血清中尿酸的检测工具很多，如酶法，尿酸传感器，电化学法，高性能液相色谱等。与以前报道的检测尿酸的方法相比，基于金属纳米材料的荧光传感器具有检测时间短，操作简单，无需处理以往样品，无毒性，成本低等优点。然而，这种基于金属纳米材料检测策略常采用单荧光测试，易受样品的环境条件和光检测器的漂移等因素的影响，这限制了检测的灵敏度和准确度。幸运的是，因为比例型荧光传感器允许在两个不同的波长下同时测量荧光强度，可以有效避免背景荧光的潜在干扰，所以它的检测灵敏度更高和准确性更强。目前，使用比例型荧光检测方案的报道已经有很多。因此，比例型荧光传感器策略的发展具有重要的意义，而且通过比例型荧光传感器对血清中尿酸的检测并无报道。
发明内容：
本发明的目的是建立一种BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器，并用于检测血清中的尿酸。
一种BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备牛血清蛋白--金银合金纳米簇(BSA-Au/Ag NCs)水溶液：
将4mL的氯金酸(10mM)和1mL的硝酸银(10mM)混合(金银摩尔比为4:1)，加入到5mL的牛血清蛋白溶液(0.75mM)中，强有力搅拌混合5分钟后，用氢氧化钠调节溶液的酸碱度，然后置于37℃的恒温油浴锅反应12小时，反应结束后用超纯水透析纯化48小时，得到牛血清蛋白--金银合金纳米簇水溶液；
牛血清蛋白为保护剂和还原剂。
(2)建立BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器：
将步骤(1)得到的BSA-Au/Ag NCs水溶液、OPD、HRP加入到稀释液磷酸盐缓冲液中，得到BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器。
步骤(2)中，所述BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器中，BSA-Au/Ag NCs的浓度为20nM，OPD的浓度为50～300μM；HRP的浓度为10ng/mL；所用磷酸盐缓冲液浓度为10mM，pH＝6.0。
HRP为催化OPD的酶。
将本发明制备的BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器用于检测尿酸的用途，具体检测方法，包括如下步骤：
(1)尿酸酶催化尿酸生成H2O2；
催化pH为4～8；催化时间为10～60分钟；催化温度为25～50℃；尿酸酶含量为5～200μg/mL。
(2)将步骤(1)制得的H2O2加入BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器中，反应温度为25～50℃；时间为10～60分钟；检测其荧光强度，580nm处荧光强度为I580，690nm处荧光强度为I690，得出I580/I690；
(3)配置一系列不同浓度的尿酸，经尿酸酶催化后，加入BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器中，反应完全后检测产物荧光，根据不同浓度的尿酸对应的荧光信号强度得到一系列的I580/I690，建立标准曲线。
本发明的有益效果为：
(1)本发明基于无色、无荧光的OPD在HRP的催化下，被H2O2氧化为黄色有荧光的oxOPD(荧光峰值I580)，同时，H2O2可降低BSA-Au/Ag NCs荧光峰值(I690)，荧光比值(I580/I690)与H2O2的浓度成正比例。而尿酸酶催化尿酸产生H2O2，因此可利用上述BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器对尿酸进行检测。
(2)本发明所构建的比例型荧光传感器检测方法特异性好、灵敏度高、检测限低，可有效避免背景荧光的潜在干扰，为人体血清中的尿酸检测提供了一条有效的新途径。
附图说明
图1为在不同尿酸浓度(0-90μM)作用下比例型荧光传感器的荧光光谱图。
图2为比例型荧光传感器的荧光比率值(I580/I690)与尿酸浓度(0-90μM)的关系图，插图为5-50μM的尿酸与荧光比率值(I580/I690)的线性关系图。
图3为不同干扰物质对比例型荧光传感器的荧光比率值(I580/I690)的影响图。
图4为使用本发明制备的荧光传感器(左)和使用AU2700全自动生化分析仪(右)分别分析血清中尿酸的结果。
图5不同OPD浓度对BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器的影响。
具体实施方式
下面用实例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实例中未标明具体条件的实验中，均按照常规条件，或制造厂商建议条件。
实例1
(1)制备牛血清蛋白--金银合金纳米簇(BSA-Au/Ag NCs)水溶液：
将4mL的氯金酸(10mM)和1mL的硝酸银(10mM)混合(使金银摩尔比为4:1；氯金酸和硝酸银的总体积保持5mL)，加入到5mL的牛血清蛋白水溶液(0.75mM)中，强有力搅拌混合5分钟后，用氢氧化钠调节溶液的酸碱度，然后置于37℃的恒温油浴锅反应12小时，反应结束后用超纯水透析纯化48小时，得到牛血清蛋白--金银合金纳米簇水溶液；
(2)建立BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器：
将步骤(1)得到的BSA-Au/Ag NCs水溶液、OPD、HRP加入到磷酸盐缓冲液(10mM,pH＝6.0)中，得到BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器。其中，BSA-Au/Ag NCs的浓度为20nM，OPD的浓度为100μM；HRP的浓度为10ng/mL。
尿酸酶(50μg/mL)与不同浓度的尿酸(0-100μM)在37℃的黑暗环境中温育45分钟产生H2O2。然后将上述反应中所产生的75μL H2O2注入BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器，在温度为37℃的条件下，反应45分钟，测定荧光强度值I690和I580，并在450-850nm的发射波长范围内收集的荧光光谱。
(3)特异性分析：
由于本发明旨在开发检测血清样本中尿酸的含量，我们测定了一些常见的潜在干扰物质，包括相关金属离子(K+，Na+)，糖苷(葡萄糖)，氨基酸(L-苯丙氨酸，L-酪氨酸)等。我们选择上述物质的浓度为5.0mM，而尿酸的浓度为0.2mM。如图3所示，与其他物种相比，即使尿酸含量低于其他物质25倍，依然只有尿酸的I580/I690明显上升，这强烈地表明，BSA-Au/AgNCs/OPD/HRP比例型荧光传感器具有很强的抗干扰能力和检测尿酸的高度特异性。
(4)血清中尿酸的检测：
收集人血清样品，用磷酸缓冲液稀释10倍，无需其他预处理。尿酸酶(50μg/mL)与不同的血清样本分别混合，在37℃的黑暗环境中温育45分钟以产生H2O2。然后将上述反应中所产生的75μL H2O2注入BSA-BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器，在温度为37℃的条件下，反应45分钟，测定荧光强度值I690和I580，并在450-850nm的发射波长范围内收集的荧光光谱。
如图1所示，随着尿酸浓度的增加，580nm处的荧光强度在逐渐增强，690nm处的荧光强度在逐渐降低。
从图2得出了，比例型荧光传感器的荧光比率值(I580/I690)与尿酸浓度的关系图，随着尿酸浓度的增加，I580/I690在逐渐增加，在5-50μM得到线型方程y＝0.304+0.038x。
如图3所示，不同干扰物质对比例型荧光传感器的荧光比率值(I580/I690)的影响，BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器具有很强的抗干扰能力和检测尿酸的高度特异性。
如图4所示，本发明的检测结果与现阶段医院临床检测结果一致
从图5可以得出，I580/I690＝4.4201～8.4031，说明该传感器在OPD的浓度为50-300μM范围内响应灵敏。
实例2
(1)牛血清蛋白--金银合金纳米簇水溶液的制备步骤同实施例1；
(2)建立BSA-BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器系统：
将步骤(1)得到的BSA-Au/Ag NCs水溶液、OPD、HRP加入到磷酸盐缓冲液(10mM,pH＝6.0)中，得到BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器。其中，BSA-Au/Ag NCs的浓度为20nM，OPD的浓度为50μM；HRP的浓度为10ng/mL。
加入H2O2，得到I580/I690＝4.4201
实例3
(1)牛血清蛋白-金银合金纳米簇水溶液的制备步骤同实施例1；
(2)建立BSA-BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器系统：
将步骤(1)得到的BSA-Au/Ag NCs水溶液、OPD、HRP加入到磷酸盐缓冲液(10mM,pH＝6.0)中，得到BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器。其中，BSA-Au/Ag NCs的浓度为20nM，OPD的浓度为200μM；HRP的浓度为10ng/mL。
加入H2O2，得到I580/I690＝7.4580
实例4
(1)牛血清蛋白-金银合金纳米簇水溶液的制备步骤同实施例1；
(2)建立BSA-BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器系统：
将步骤(1)得到的BSA-Au/Ag NCs水溶液、OPD、HRP加入到磷酸盐缓冲液(10mM,pH＝6.0)中，得到BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器。其中，BSA-Au/Ag NCs的浓度为20nM，OPD的浓度为300μM；HRP的浓度为10ng/mL。
加入H2O2，得到I580/I690＝5.9094。

Claims (6)

1.一种BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备牛血清蛋白--金银合金纳米簇BSA-Au/Ag NCs水溶液，备用；
(2)建立BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器：将步骤(1)得到的BSA-Au/Ag NCs水溶液、OPD、HRP加入到稀释液磷酸盐缓冲液中，得到BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器。
2.如权利要求1所述的一种BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器中，BSA-Au/Ag NCs的浓度为20nM，OPD的浓度为50～300μM；HRP的浓度为10ng/mL。
3.如权利要求1所述的一种BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所用磷酸盐缓冲液浓度为10mM，pH＝6.0。
4.将权利要求1所述制备方法制得的BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器用于检测尿酸的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，利用BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器检测尿酸的方法，包括如下步骤：
(1)尿酸酶催化尿酸生成H2O2；
(2)将步骤(1)制得的H2O2加入BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器中，反应温度为25～50℃，时间为10～60分钟；检测其荧光强度，580nm处荧光强度为I580，690nm处荧光强度为I690，得出I580/I690；
(3)配置一系列不同浓度的尿酸，经尿酸酶催化后，加入BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器中，反应完全后检测产物荧光，根据不同浓度的尿酸对应的荧光信号强度得到一系列的I580/I690，建立标准曲线。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，步骤(1)中，催化pH为4～8；催化时间为10～60分钟；催化温度为25～50℃；尿酸酶含量为5～200μg/mL。
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