CN113695585A - 一种酪蛋白保护的金银纳米簇的制备方法及其在金霉素检测中的应用 - Google Patents

一种酪蛋白保护的金银纳米簇的制备方法及其在金霉素检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及金银纳米簇合成技术领域，具体涉及一种酪蛋白保护的金银纳米簇的制备方法及其在金霉素检测中的应用，步骤如下：步骤一、称取酪蛋白，加入750μL水溶解，再加入50μL浓度为3M的氢氧化钠溶液调节溶液pH，在温度为37℃‑70℃水浴中加热20分钟，得到溶液A；步骤二、将氯金酸加入到步骤(一)得到的溶液A中混合均匀，再加入硝酸银溶液混合均匀，在温度为37℃‑70℃水浴中加热0‑4小时，得到溶液B；将步骤(二)得到的溶液B，保存在4℃条件下，得到酪蛋白‑金银纳米簇。本发明制得的荧光金银纳米簇具有独特的光物理特性、制备方法简单、高稳定性，检测金霉素方法快速便捷、检测灵敏度高，检测限低，是应用于生物和医学领域的理想荧光纳米材料。

Description

一种酪蛋白保护的金银纳米簇的制备方法及其在金霉素检测 中的应用
技术领域
本发明涉及金银纳米簇合成技术领域，具体涉及一种酪蛋白保护的金银纳米簇的制备方法及其在金霉素检测中的应用。
背景技术
酪蛋白约占牛奶蛋白的80％，是一种含磷且具有亲水性和疏水性氨基酸残基的两亲性共聚物。目前主要用作食物原料或微生物培养基，也是幼儿氨基酸以及钙磷的来源之一。酪蛋白具有防止矿物质流失，防治骨质疏松与佝偻病，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功能；同时，还能促进常量元素钙、镁与微量元素铁、锌等的吸收。酪蛋白含有多种氨基酸，尤其是丰富的脯氨酸残基，基于已有报道使用脯氨酸合成金属纳米簇，我们认为酪蛋白有望成为合成纳米簇的模板。
金属纳米团簇通常由几个到几百个原子组成，是具有荧光的超小纳米颗粒。化学还原法是常用的制备方法，其中蛋白质由于其含有许多活性位点如硫醇、氨基、羧基和羟基，能聚集和还原金属离子，常作为稳定剂和还原剂作用于金属中心，而且蛋白的结构稳定可保证其荧光性能不会因聚集而被淬灭，是常用的合成模板。制备所得的金属纳米簇具有超小尺寸，荧光强，斯托克斯位移较大，毒性低，稳定性好等优点，此外因其独特的光物理特性以及可能在细胞和组织中成像，是应用于分析和生物领域的理想荧光材料。双金属纳米簇由于在物理化学性质上具有协同作用，更有利于提高荧光强度而受到广泛关注。
金霉素是一种常见的广谱的四环素类抗生素，对革兰阳性菌和阴性菌均有抑制作用，可治疗畜禽的伤寒、白痢等病，同时也作为促进生长剂用于动物饲料中；但如果使用剂量不当或长期频繁使用，在动物体内形成残留会造成严重副作用，如水土污染、细菌产生耐药性，威胁人类健康。而针对金霉素的传统检测方法具有稳定性差、灵敏度低、耗时长等局限性，因而急需开发一种快捷高效的检测方法。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种酪蛋白保护的金银纳米簇的制备方法及其在金霉素检测中的应用，采用一步合成法在水溶液中制备酪蛋白-金银纳米簇，其具有独特的光物理特性、无毒且具有优异的生物相容性，检测金霉素方法快速简单、检测灵敏度好、检测限低。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种酪蛋白保护的金银纳米簇的制备方法，具体步骤如下：
步骤一、称取酪蛋白，加入750μL水溶解，再加入50μL浓度为3M的氢氧化钠溶液调节溶液pH，在温度为37℃-70℃水浴中加热20分钟，得到溶液A；
步骤二、将氯金酸加入到步骤(一)得到的溶液A中混合均匀，再加入硝酸银溶液混合均匀，在温度为37℃-70℃水浴中加热0-4小时，得到溶液B；
步骤三、将步骤二得到的溶液B，保存在4℃条件下，得到酪蛋白-金银纳米簇。
优选地，所述步骤(一)中，酪蛋白浓度为40mg ml-1，加热温度为65℃。
优选地，所述步骤(二)中，氯金酸和硝酸银的比例为8:1。
优选地，所述步骤(二)中，水浴加热的温度为65℃，加热时间为3小时。
本发明还提供了一种酪蛋白保护的金银纳米簇的制备方法得到的酪蛋白-金银纳米簇在金霉素检测中的应用，用磷酸缓冲液稀释酪蛋白-金银纳米簇，加入不同浓度的金霉素混合均匀，并在室温条件下孵育，激发波长条件下，随着金霉素浓度的逐渐增加，酪蛋白-金银纳米簇445nm处的荧光强度逐渐增强，660nm处的荧光强度保持不变，实现比率型检测。
优选地，在室温条件下孵育5分钟，在360nm激发波长条件下，实现快速检测。
本发明有益效果：
1、本发明以酪蛋白为模板，采用一步合成法在水溶液中制备酪蛋白-金银纳米簇，具有独特的光物理特性、毒性低、稳定性好和优异的生物相容性。
2、本发明制备的酪蛋白-金银纳米簇，检测金霉素方法快速简单、检测灵敏度好，检测限低，是应用于生物和医学领域的理想荧光纳米材料。
附图说明
图1是本发明制得的酪蛋白-金银纳米簇的激发光谱和发射光谱图；
图2是本发明不同金银比例合成酪蛋白-金银纳米簇的荧光光谱图；
图3是本发明不同反应时间合成酪蛋白-金银纳米簇的荧光光谱图；
图4是本发明不同浓度酪蛋白条件下合成酪蛋白-金银纳米簇的荧光光谱图；
图5是本发明不同温度合成酪蛋白-金银纳米簇的荧光光谱图；
图6是本发明优化后酪蛋白-金银纳米簇的形貌及尺寸分布；
图7是本发明加入不同浓度的金霉素后酪蛋白-金银纳米簇的荧光发射光谱图。
具体实施方式
下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
参照图1-图7，提高产物的发光性能，包括以下步骤：
称取一定量的酪蛋白，加入750μL水溶解，加入氢氧化钠溶液，水浴加热20分钟；将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入150μL浓度为10mM的硝酸银溶液混合均匀，水浴加热一段时间；利用荧光光谱仪检测产物的激发光谱和发射光谱。如图2所示，通过改变氯金酸和硝酸银的比例，观察不同金银比例的荧光光谱，随着金元素的比例逐渐增加，荧光强度逐渐增强，当氯金酸和硝酸银的比例为8:1时，荧光强度达到最强；因此选择氯金酸和硝酸银的比例为8:1作为制备酪蛋白-金银纳米簇的最佳反应比例。
称取一定量的酪蛋白，加入750μL水溶解，加入氢氧化钠溶液，水浴加热20分钟；将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入37.5μL浓度为10mM的硝酸银溶液混合均匀，水浴加热20分钟；利用荧光光谱仪检测产物的激发光谱和发射光谱。如图3所示，增加反应时间，观察不同反应时间的荧光光谱，随着反应时间的增加，荧光强度逐渐增强，反应时间为3小时荧光强度达到最强；因此选择3小时作为制备酪蛋白-金银纳米簇的最佳反应时间。
称量15mg的酪蛋白，加入750μL水溶解，加入氢氧化钠溶液，水浴加热20分钟；将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入37.5μL浓度为10mM的硝酸银溶液混合均匀，水浴加热3小时；利用荧光光谱仪检测产物的激发光谱和发射光谱。如图4所示，增加酪蛋白的浓度，观察荧光光谱，随着酪蛋白浓度的增加，荧光强度逐渐增强，当使用40mg ml-1的酪蛋白时，荧光强度最强；因此选择40mg ml-1的酪蛋白作为制备酪蛋白-金银纳米簇的最佳浓度。
称量40mg的酪蛋白，加入750μL水溶解，加入氢氧化钠溶液，37℃水浴加热20分钟；将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入37.5μL浓度为10mM 的硝酸银溶液混合均匀，37℃水浴加热3小时；利用荧光光谱仪检测产物的激发光谱和发射光谱。如图5-6所示，增加水浴加热温度，观察荧光光谱，随着水浴温度的增加，荧光强度逐渐增强，当温度为65℃时，荧光强度最佳；因此选择65℃作为制备酪蛋白-金银纳米簇的最佳温度。条件优化后制备的酪蛋白-金银纳米簇尺寸大小分布均一，其平均粒径为2.5～3nm。
以酪蛋白-金银纳米簇为荧光探针检测金霉素：
用磷酸缓冲液稀释酪蛋白-金银纳米簇，加入一定量的金霉素，混合液在室温下孵育5分钟，在360nm激发波长条件下，随着金霉素浓度的逐渐增加，酪蛋白-金银纳米簇在445nm 处的荧光强度逐渐增强，660nm处的荧光强度保持不变。
(一)酪蛋白-金银纳米簇的制备及优化
实施例一：第一步，称量40mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；再加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，65℃水浴加热20分钟；第二步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入150μL浓度为10mM的硝酸银溶液混合均匀，65℃水浴加热3小时，得到酪蛋白-金银纳米簇。
实施例二：第一步，称量40mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；再加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，65℃水浴加热20分钟；第二步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入50μL浓度为10mM的硝酸银溶液混合均匀，65℃水浴加热3小时，得到酪蛋白-金银纳米簇。
实施例三：第一步，称量40mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；再加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，65℃水浴加热20分钟；第二步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入37.5μL浓度为10mM的硝酸银溶液混合均匀，65℃水浴加热3 小时，得到酪蛋白-金银纳米簇。
实施例四：实施例一、实施例二、实施例三得到的酪蛋白-金银纳米簇，如图2所示，在 360nm激发波长下，通过比较其荧光强度，确定当氯金酸和硝酸银的比例为8:1时，酪蛋白- 金银纳米簇的荧光发射强度最强。
实施例六：第一步，称量40mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；再加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，65℃水浴加热20分钟；第二步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入37.5μL浓度为10mM的硝酸银溶液混合均匀，65℃水浴加热1 小时，得到酪蛋白-金银纳米簇。
实施例七：第一步，称量40mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；再加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，65℃水浴加热20分钟；第二步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入37.5μL浓度为10mM的硝酸银溶液混合均匀，65℃水浴加热2 小时，得到酪蛋白-金银纳米簇。
实施例八：第一步，称量40mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；再加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，65℃水浴加热20分钟；第二步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入37.5μL浓度为10mM的硝酸银溶液混合均匀，65℃水浴加热4 小时，得到酪蛋白-金银纳米簇。
实施例九：实施例三、实施例六、实施例七、实施例八得到的酪蛋白-金银纳米簇，如图3所示，在360nm激发波长下，通过比较其荧光强度，确定反应时间为3小时，酪蛋白-金银纳米簇的荧光发射强度最强。
实施例十：第一步，称量15mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；再加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，65℃水浴加热20分钟；第二步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入37.5μL浓度为10mM的硝酸银溶液混合均匀，65℃水浴加热3 小时，得到酪蛋白-金银纳米簇。
实施例十一：第一步，称量25mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；再加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，65℃水浴加热20分钟；第二步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入37.5μL浓度为10mM的硝酸银溶液混合均匀，65℃水浴加热 3小时，得到酪蛋白-金银纳米簇。
实施例十二：称量35mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；再加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，65℃水浴加热20分钟；第二步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入37.5μL浓度为10mM的硝酸银溶液混合均匀，65℃水浴加热3小时，得到酪蛋白-金银纳米簇。
实施例十三：实施例三、实施例十、实施例十一、实施例十二得到的酪蛋白-金银纳米簇，如图4所示，在360nm激发波长下，通过比较其各自荧光发射强度，确定当酪蛋白浓度为 40mg ml-1时，荧光发射强度最强。
实施例十四：第一步，称量40mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；再加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，37℃水浴加热20分钟；第二步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入37.5μL浓度为10mM的硝酸银溶液混合均匀，37℃水浴加热 3小时，得到酪蛋白-金银纳米簇。
实施例十五：第一步，称量40mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；再加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，50℃水浴加热20分钟；第二步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中混合均匀，再加入37.5μL浓度为10mM的硝酸银溶液混合均匀，50℃水浴加热 3小时，得到酪蛋白-金银纳米簇。
实施例十六：实施例三、实施例十四、实施例十五得到的酪蛋白-金银纳米簇，如图5所示，在360nm激发波长下，通过比较其各自荧光发射强度，确定当反应温度为65℃时，荧光发射强度最强。
(二)酪蛋白-金银纳米簇作为荧光探针检测金霉素
实施例十七：参照图7，用磷酸盐缓冲液稀释酪蛋白-金银纳米簇原液，然后加入浓度为 0.1～5.5μM的金霉素溶液，在室温下孵育5分钟后，用荧光光谱仪检测360nm激发波长下的荧光光谱。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (6)

1.一种酪蛋白保护的金银纳米簇的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤一、称取酪蛋白，加入750μL水溶解，再加入50μL浓度为3M的氢氧化钠溶液调节溶液pH，在温度为37℃-70℃水浴中加热20分钟，得到溶液A；
步骤二、将氯金酸加入到步骤(一)得到的溶液A中混合均匀，再加入硝酸银溶液混合均匀，在温度为37℃-70℃水浴中加热0-4小时，得到溶液B；
步骤三、将步骤(二)得到的溶液B，保存在4℃条件下，得到酪蛋白-金银纳米簇。
2.根据权利要求1所述的一种酪蛋白保护的金银纳米簇的制备方法，其特征在于：所述步骤(一)中，酪蛋白浓度为40mg ml-1，加热温度为65℃。
3.根据权利要求1所述的一种酪蛋白保护的金银纳米簇的制备方法，其特征在于：所述步骤(二)中，氯金酸和硝酸银的比例为8:1。
4.根据权利要求1所述的一种酪蛋白保护的金银纳米簇的制备方法，其特征在于：所述步骤(二)中，水浴加热的温度为65℃，加热时间为3小时。
5.一种根据权利要求1-4任一项所述的酪蛋白保护的金银纳米簇的制备方法得到的酪蛋白-金银纳米簇在金霉素检测中的应用，其特征在于：用磷酸缓冲液稀释酪蛋白-金银纳米簇，加入不同浓度的金霉素混合均匀，并在室温条件下孵育，激发波长条件下，随着金霉素浓度的逐渐增加，酪蛋白-金银纳米簇445nm处的荧光强度逐渐增强，660nm处的荧光强度保持不变，实现比率型检测。
6.根据权利要求5所述的一种酪蛋白保护的金银纳米簇在金霉素检测中的应用，其特征在于，在室温条件下孵育5分钟，在360nm激发波长条件下，实现快速检测。
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