CN110408380A - 一种单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针及其在检测间日疟原虫乳酸脱氢酶中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针及其在检测间日疟原虫乳酸脱氢酶中的应用，属于荧光探针技术领域。该荧光探针具有结构简单、易合成、稳定性强、生物兼容性好等优点，并能够对间疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)产生大幅度的线性荧光增强响应。该响应具有检测范围宽(0～1.0×10‑6mol/L)、灵敏度高，其检测限能够达到3.7ng/mL。另外，通过引入辅助剂“Al3+”，该探针能够彻底区分间疟原虫乳酸脱氢酶和其它类型的乳酸脱氢酶。本发明的检测方法速度快、操作简便、信号稳定、灵敏度高、无需预处理，无需复杂的检测仪器。

Description

一种单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针及其在检测 间日疟原虫乳酸脱氢酶中的应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针及其在检测间日疟原虫乳酸脱氢酶中的应用。
背景技术
疟疾是经蚊虫叮咬或输入带疟原虫患者的血液而感染所引起的虫媒传染病，每年会夺走超过43.5万人的生命(尤其是以5岁以下儿童为主要受害群体)，严重威胁人类健康。据《2018年世界疟疾报告》，2017年大约有2.19亿疟疾病例，与前一年相比略有增加。能够寄生于人体中的疟原虫主要有四种，分别是间日疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫和卵形疟原虫，它们是引发疟疾的元凶。在疟疾的早期诊断中，快速诊断试纸法(RDT)是目前最简单快速的诊断方法，承担了全球75％以上的疑似病例检测。然而，一些研究表明商业RDT无法准确检测低密度寄生虫(<200 寄生虫/μL)和低抗原浓度(<1ng/mL)的患者，导致许多假阴性结果。因此，开发新的检测方法对于疟疾诊断仍然至关重要，尤其是开发成本低、灵敏度高、选择性好的检测方法将极大减轻发展中国家的抗疟疾负担。
乳酸脱氢酶(LDH)是糖酵解途径中的末端酶，催化丙酮酸和还原型辅酶I (NADH)转化为乳酸和NAD+及其逆过程，广泛分布于所有活细胞中(动物，植物和原核生物)。最近研究发现疟原虫乳酸脱氢酶(PLDH)是疟疾的重要生物标志物，其在疟疾患者血清中具有较高浓度分布(约3～15pg/μL)。因此，研究人员们开发了一些PLDH生物传感器，并通过引入单链DNA适配体来提高检测选择性，但这种适配体的应用大幅度提高了检测成本，限制了该类检测方法的实际应用。因此以PLDH为靶点的新型检测方法亟待开发，尤其是成本低、性能好的探针将对疟疾诊断和控制至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针及其在检测间日疟原虫乳酸脱氢酶中的应用。
由于金属纳米簇具有超小尺寸、可控发射范围、高稳定性和水溶性、良好的生物相容性等优良特性，因而在过去十几年成为纳米材料研究领域的热点之一。尤其是作为一种新型的荧光团，其在化学检测及生物标记等领域显示出较高的应用前景。本发明中所述的一种单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针，在体外缓冲溶液中，对间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)显示出高选择性的荧光增强响应，为检测间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)提供了基础。
本发明所述的基于单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇(Au-AgNCs@AMP)荧光探针中，保护配体分子为单磷酸腺苷(AMP)，它是腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的两次水解得到的产物，还可以由肌腺苷酸脱胺酶释放一组氨基转化而成。此外，AMP 用于食品的苦味遮罩剂，在分解代谢的过程中，可以转化成为尿酸排出体外。因此引入AMP为配体的纳米发光材料具有良好的生物相容性，使其在生物成像、标记及传感等方面存在巨大潜力。
本发明所述的一种单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针，其由如下步骤制备得到：
(1)利用蒸馏水配制20mmol/L的单磷酸腺苷溶液、10mmol/L的氯金酸溶液、10mmol/L的硝酸银溶液、500mmol/L的柠檬酸钠溶液；
制备方法一：向反应釜中分别依次加入2.5mL、20mmol/L的单磷酸腺苷溶液，5.9mL的蒸馏水，0.2mL、10mmol/L的氯金酸溶液，1mL、10mmol/L的硝酸银溶液，0.4mL、500mmol/L的柠檬酸钠溶液，将反应釜放入120℃的干燥箱中反应 30分钟后停止加热，待反应釜冷却至室温，即得到单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇(Au-AgNCs@AMP)荧光探针原液；
制备方法二：称取18.262mg(50mmol)单磷酸腺苷固体于反应容器中，加入 8.4mL蒸馏水混合充分，向混合溶液中加入0.2mL、10mmol/L氯金酸溶液，1mL、 10mmol/L硝酸银溶液，0.4mL、500mmol/L柠檬酸钠溶液，使用电加热套于80℃搅拌6h后，停止加热，待反应容器冷却至室温，即得到单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇(Au-AgNCs@AMP)荧光探针原液；
以上两种方法均可制备得到单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇 (Au-AgNCs@AMP)荧光探针原液，在制备过程中控制氯金酸、硝酸银、单磷酸腺苷的用量摩尔比为0.2：1：5。最后将获得的Au-AgNCs@AMP荧光探针原液采用丙酮沉淀的纯化方法(丙酮和原液的体积比为2:1)，离心，去掉上清(未反应的原料)，冻干得到沉淀，即单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针固体样品，在 4℃条件下避光保存。结果表明：以AMP作为配体保护的金银合金纳米簇荧光探针平均粒径为2.05nm，发光波长为550nm。
本发明主要基于上述单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇(Au-AgNCs@AMP) 荧光探针在20mM吗啉乙磺酸-氢氧化钠(MES-NaOH，pH＝6.50)缓冲溶液中对间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)进行检测。在含有Au-AgNCs@AMP荧光探针的 MES-NaOH缓冲溶液中，我们分别引入不同的商业化蛋白质(卵血清白蛋白，人血清白蛋白，牛血清白蛋白，球蛋白，间日疟原虫乳酸脱氢酶，溶菌酶，胰蛋白酶，泛素蛋白等)，荧光光谱图结果表明，Au-AgNCs@AMP荧光探针对PvLDH的荧光增强响应大幅度提升，而对其他蛋白质的响应十分微弱。进而，我们以不同类型的乳酸脱氢酶(PLDH)为参比，结果表明，Au-AgNCs@AMP荧光探针对不同类型的 PLDH的荧光响应有不同程度的增强，其中对PvLDH的响应尤为强烈。鉴于PLDH 的空间结构极其相似，不易区分，我们引入六水合氯化铝(AlCl3·6H2O)，在辅助剂Al3+作用下该Au-AgNCs@AMP荧光探针对PvLDH仍然表现出荧光增强响应，而对于其他PLDH荧光强度显示为微弱的淬灭响应，从而实现对间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)的高选择性识别响应。
本发明制备的单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针与其它的荧光探针相比具有结构相对简单、易于合成、稳定性强、响应灵敏度高等特点，能够对溶液中的间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)产生大幅度的线性荧光增强响应。并且该方法检测速度快、操作简便，灵敏度高、无需预处理，无需复杂的检测仪器，在医疗诊断和生物样品分析等领域具有非常重要的意义，尤其是在疟疾诊断和治疗效果的评估方面有着非常广阔的应用前景。
附图说明
图1：单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液(30μg/mL)与不同浓度间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)(0～1.0×10-6mol/L)相互作用的荧光发射光谱图。图中最上边的曲线对应PvLDH的浓度为1.0×10-6mol/L，最下边的曲线对应 PvLDH浓度为0mol/L；其余曲线对应PvLDH的浓度从上至下依次减小；
图2：单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液(30μg/mL)与不同浓度间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)相互作用的荧光发射强度与浓度的线性响应关系曲线图；横坐标为PvLDH浓度，纵坐标为其在530nm处荧光发射强度。
图3：低浓度的单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液(3.0μg/mL) 与低浓度间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)(0～100×10-9mol/L)相互作用的荧光发射光谱图；其横坐标为PvLDH浓度，纵坐标为其在530nm处荧光发射强度。图中最上边的曲线对应间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)的浓度为100×10-9mol/L，最下边的曲线对应间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)的浓度为0mol/L；其余曲线对应PvLDH的浓度从上至下依次减小；
图4：低浓度的单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液(3.0μg/mL) 与间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)相互作用的荧光发射强度与浓度的线性响应关系曲线图；其横坐标为PvLDH浓度，纵坐标为其在530nm处荧光发射强度。
图5：单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液(3.0μg/mL)与低浓度间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)相互作用的荧光发射强度与浓度的线性响应拟合图(如图5所示)；其横坐标为PvLDH浓度，纵坐标为其在530nm处荧光发射强度
图6：单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇(Au-AgNCs@AMP)荧光探针溶液 (30μg/mL)与不同蛋白质(1.0×10-6mol/L)相互作用诱导的荧光发射强度(530 nm)柱型图(1：Au-AgNCs@AMP为空白对照，在Au-AgNCs@AMP存在时从2～9 依次是浓度1.0μM的卵血清白蛋白，人血清白蛋白，牛血清白蛋白，球蛋白，间日疟原虫乳酸脱氢酶，溶菌酶，胰蛋白酶，泛素蛋白等)。
图7：单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液(15μg/mL)与四种不同类型的疟原虫乳酸脱氢酶(PLDH，0～2.0×10-6mol/L)相互作用的荧光发射强度与浓度的响应图；横坐标为PLDH浓度，纵坐标为其在530nm处荧光发射强度。 (PvLDH为间日疟原虫乳酸脱氢酶，PfLDH为恶性疟原虫乳酸脱氢酶，HLDH为人源乳酸脱氢酶，RLDH为兔肌乳酸脱氢酶)
图8：单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇(15μg/mL)荧光探针溶液与不同浓度Al3+(0～150μM)相互作用前后的荧光发射光谱图。图中最上边的曲线对应Al3+的浓度为150μM，最下边的曲线对应Al3+的浓度为0μM；其余曲线对应Al3+的浓度从上至下依次减小；
图9：单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液和辅助剂Al3+(150μM) 结合后与不同浓度的间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH，0～800×10-9mol/L)相互作用的荧光发射光谱图。最上边曲线对应的PvLDH的终浓度为800×10-9mol/L，最下边曲线对应的PvLDH的终浓度为0mol/L；其余曲线对应PvLDH的终浓度为从上至下依次减小；
图10：单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液和辅助剂Al3+(150μM) 结合后与恶性疟原虫乳酸脱氢酶(PfLDH，0～800×10-9mol/L)相互作用的荧光发射光谱图。最下边曲线到最上边曲线序号依次为1～9，相对应的PfLDH的终浓度为 0、500、700、400、100、200、600、800、300×10-9mol/L(辅助剂的引入屏蔽了该探针对PfLDH的荧光增强响应，导致荧光强度在小范围内波动)；
图11：单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液和辅助剂Al3+(150μM) 结合后与人源乳酸脱氢酶(HLDH，0～800×10-9mol/L)相互作用的荧光发射光谱图。最下边曲线到最上边曲线序号依次为1～9，相对应的HLDH的终浓度为800、 700、600、500、400、0、300、200、100×10-9mol/L(辅助剂的引入屏蔽了该探针对HLDH的荧光增强响应，导致荧光强度在小范围内波动)；
图12：单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液和辅助剂Al3+(150μM) 结合后与兔肌乳酸脱氢酶(RLDH，0～800×10-9mol/L)相互作用的荧光发射光谱图。最下边曲线到最上边曲线序号依次为1～9,相对应的RLDH的终浓度为800、700、 600、500、400、200、300、0、100×10-9mol/L(辅助剂的引入屏蔽了该探针对RLDH 的荧光增强响应，导致荧光强度在小范围内波动)；
图13：单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液(15μg/mL)和辅助剂 Al3+(150μM)结合后与不同类型疟原虫乳酸脱氢酶(PLDH，0～800×10-9mol/L)相互作用的荧光发射强度与浓度的响应图；横坐标为PLDH的浓度，纵坐标为其在530 nm处荧光发射强度。(PvLDH为间日疟原虫乳酸脱氢酶，PfLDH为恶性疟原虫乳酸脱氢酶，HLDH为人源乳酸脱氢酶，RLDH为兔肌乳酸脱氢酶)。
具体实施方式
本发明中使用的硝酸银、氯金酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、吗啉乙磺酸、六水合氯化铝等化学试剂都购自国药集团化学试剂有限公司；卵血清白蛋白，人血清白蛋白，牛血清白蛋白，球蛋白，溶菌酶，胰蛋白酶，泛素蛋白，兔肌乳酸脱氢酶(RLDH)等都是购自美国Sigma公司。另外，间日疟原虫乳酸脱氢酶 (PvLDH)，恶性疟原虫乳酸脱氢酶(PfLDH)，人源乳酸脱氢酶(HLDH)等都是参照文献(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2013,110,15967–15972)方法克隆、表达、纯化，并最终通过利用pH＝7.40的20mmol/L的磷酸缓冲溶液透析获得。所得乳酸脱氢酶浓度通过仪器Nano Drop 2000c测得，并利用所配磷酸缓冲溶液稀释获得50× 10-6mol/L的母液。卵血清白蛋白，人血清白蛋白，牛血清白蛋白，球蛋白，溶菌酶，胰蛋白酶，泛素蛋白，兔肌乳酸脱氢酶(RLDH)等都分别称量后，通过加入对应体积的二次蒸馏水获得100×10-6mol/L的母液。
实施例1：
参照文献(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2013,110,15967–15972)方法，将含有pET28a-PvLDH质粒的E.coli BL21(DE3)37℃，在LB培养基中220转/分钟振摇，培养过夜。以体积比1:100的比例接种，37℃，180转/分钟振摇培养至OD600＝0.8～1.0，以体积比1:5000加入IPTG诱导LDH的表达，25℃，180转/分钟振摇诱导表达13 h后，4℃，4000rpm离心30min收集菌体。以20mM磷酸缓冲液(pH＝7.4)重悬菌体，经超声破碎后离心收集上清。
对收集的上清使用Ni2+-NTA柱纯化本发明所使用的间日疟原虫乳酸脱氢酶：将上清液缓慢流过Ni2+-NTA柱，重复3次，然后用3倍柱体积缓冲液(20mM磷酸缓冲液)洗柱，重复3次，最后用3倍柱体积洗脱缓冲液(20mM磷酸缓冲液中含50mM、100mM、200mM、300mM、400mM咪唑)梯度洗脱得到本发明所使用的间日疟原虫乳酸脱氢酶。经SDS-PAGE鉴定，所表达、纯化得到的间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)，单体分子量约为37kDa。通过替换对应质粒(pET28a-PfLDH， pET28a-HLDH)，分别表达纯化得到恶性疟原虫乳酸脱氢酶(PfLDH)，人源乳酸脱氢酶(HLDH)。
实施例2：
单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针的制备：
称取氯金酸(HAuCl4)339.79mg(1mmol/L)，加入100mL蒸馏水配置浓度 10mmol/L氯金酸溶液(避光保存)；称取硝酸银(AgNO3)16.987mg(0.1mmol/L)，加入10mL蒸馏水配置浓度10mmol/L硝酸银溶液(避光保存)；称取80mg(2 mmol/L)氢氧化钠(NaOH)加入2mL蒸馏水配置浓度1mol/L氢氧化钠溶液；称取73.048mg(0.2mmol/L)单磷酸腺苷溶于10mL蒸馏水中配置浓度20mmol/L 单磷酸腺苷溶液；称取735.25mg(2.5mmol/L)柠檬酸钠加入5mL蒸馏水配置500 mmol/L柠檬酸钠溶液；称取24.143mg(0.1mmol)六水合氯化铝(AlCl3·6H2O) 加入10mL蒸馏水配置10mmol/L氯化铝溶液；称取426.5mg(0.2mmol/L)吗啉乙磺酸-水合物(MES)加入10mL蒸馏水配置20mmol/L吗啉乙磺酸溶液，用1mol/L 氢氧化钠调节pH＝6.5的乙磺酸-氢氧化钠(MES-NaOH)缓冲溶液。
第一种方法：取0.2mL、10mmol/L氯金酸溶液加入20mL反应釜中，加入2.5 mL、20mmol/L单磷酸腺苷溶液，向反应釜中加入5.9mL蒸馏水混合均匀，向该混合溶液中加入1mL、10mmol/L硝酸银溶液，0.4mL、500mmol/L柠檬酸钠溶液。将反应釜放入120℃的高温干燥箱中加热30分钟后取出，冷却至室温，取出反应后溶液，得到单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针原液；
第二种方法：称取18.262mg单磷酸腺苷固体(50mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入8.4mL蒸馏水混合充分，向混合溶液中加入0.2mL、10mmol/L氯金酸溶液， 1mL、10mmol/L硝酸银溶液，0.4mL、500mmol/L柠檬酸钠溶液，使用电加热套 80℃搅拌6h后，停止反应，冷却至室温，取出反应后溶液，得到单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针原液；
单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液的纯化：取单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针原液10mL于50mL离心管中，向其中加入20mL丙酮溶液，振荡混合均匀，使用高速离心机4000rpm离心30分钟；离心后，去除上清(除掉过量的柠檬酸钠和单磷酸腺苷)。最后，冻干沉淀，4℃避光保存，称量待使用。
单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针(方法一)与(方法二)结构相同，只是制备路径不同，从而使它们的荧光发射强度略有不同，对间日疟原虫乳酸脱氢酶荧光响应的增强倍数也有轻微差异。
实施例3：
单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针检测溶液中间日疟原虫乳酸脱氢酶的方法：将实施例2制备的Au-AgNCs@AMP荧光探针溶液冻干称重后的固体，用已配置的pH＝6.5MES-NaOH缓冲溶液稀释，配制成浓度为30μg/mL的溶液，分别取1mL该荧光探针溶液，向每1mL荧光探针溶液中分别加入间日疟原虫乳酸脱氢酶的母液，使其终浓度分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、130、 150、170、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000×10-9mol/L(浓度通过仪器nano 2000测得)，并利用荧光光谱仪记录荧光探针溶液对不同浓度的间日疟原虫乳酸脱氢酶响应的荧光发射光谱(激发波长为340nm)。如图1所示，随着间日疟原虫乳酸脱氢酶浓度的增加，其在550nm处的荧光发射峰强度逐渐增强并蓝移至500nm。同时，通过绘制该体系荧光发射强度(530nm)与间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)浓度的关系曲线图(如图2所示)，可实现单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针对间日疟原虫乳酸脱氢酶检测，且具有良好的线性依赖关系 (如图2中插图，R2＝0.9970)，因此单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针能够实现在大范围内检测间日疟原虫乳酸脱氢酶。
实施例4：
将实施例2制备的Au-AgNCs@AMP荧光探针冻干称重后的固体，用已配置的 pH＝6.5MES-NaOH缓冲溶液稀释，配制成3.0μg/mL低浓度的溶液，分别取1mL 作为荧光探针溶液。向每1mL荧光探针溶液中分别加入间日疟原虫乳酸脱氢酶 (PvLDH)的母液，使其终浓度分别为0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10、30、50、70、 100×10-9mol/L，并利用荧光光谱仪记录该荧光探针溶液对不同浓度的PvLDH响应的荧光发射光谱(激发波长为340nm)(如图3所示)。并绘制该体系的荧光发射强度(530nm)与PvLDH浓度的关系曲线图，进一步通过线性拟合即可获得该单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇对PvLDH的荧光检测线性关系(如图4所示)，发现其对PvLDH浓度具有较好的线性依赖关系。进而计算出该单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针对PvLDH的检测限为0.1×10-9mol/L(3.7pg/μL)(如图5所示)，相比疟疾患者体内的实际PvLDH浓度(3～15pg/μL)，该荧光探针检测方法具有较低的检出限。因此本发明制备的单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针可以高灵敏度地检测PvLDH。
实施例5：
将实施例2制备的Au-AgNCs@AMP荧光探针冻干称重后的固体，用已配置的 pH＝6.5MES-NaOH缓冲溶液稀释，配制成浓度为30μg/mL的溶液，分别取1mL 作为荧光探针溶液。向每1mL荧光探针溶液中分别加入不同待测蛋白质的母液，使其终浓度为1.0×10-6mol/L，蛋白质包括：卵血清白蛋白，人血清白蛋白，牛血清白蛋白，球蛋白，间日疟原虫乳酸脱氢酶，溶菌酶，胰蛋白酶，泛素蛋白(如图 6，顺序从左到右)，并利用荧光光谱仪检测该荧光探针溶液对不同待测蛋白质响应的荧光发射光谱(激发波长为340nm)。同时比较该单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液对不同待测蛋白质响应的荧光发射强度(530nm)。如图6所示，结果显示其对间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)产生了约6倍的荧光增强响应，对实验中涉及的其它蛋白质则基本没有荧光增强响应。该结果证明单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液对PvLDH具有高选择性的荧光线性增强响应。
实施例6：
将实施例2制备的Au-AgNCs@AMP荧光探针冻干称重后的固体，用已配置的 pH＝6.5MES-NaOH缓冲溶液稀释，配制成浓度为30μg/mL的溶液，分别取1mL 作为荧光探针溶液。向每1mL荧光探针溶液中分别加入不同类型的乳酸脱氢酶 (PLDH)的母液，使其终浓度分别为100、200、300、400、500、600、700、800、 900、1000、2000×10-9mol/L)，乳酸脱氢酶(PLDH)包括间日疟原虫乳酸脱氢酶 (PvLDH)，恶性疟原虫乳酸脱氢酶(PfLDH)，人源乳酸脱氢酶(HLDH)，兔肌乳酸脱氢酶(RLDH)。利用荧光光谱仪检测该荧光探针溶液对不同类型的待测PLDH 响应的荧光发射光谱(激发波长为340nm)。并绘制该体系的荧光发射强度(530nm) 与不同待测蛋白质响应的浓度关系曲线图，结果如图7所示，随着PLDH浓度的增加，其荧光发射增强幅度逐渐增大，并且不同类型的PLDH诱导的荧光发射强度增强倍数具有较大差异(该荧光探针对PvLDH产生了约6倍的荧光增强响应，对 PfLDH产生了约5倍荧光增强响应，对HLDH和RLDH产生了约3倍荧光增强响应)。其中，该荧光探针对PvLDH的荧光增强响应最为强烈。该结果证明单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针溶液对PLDH具有荧光增强响应，且对不同类型的PLDH响应差异较大。因而本发明制备的单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针可以用来检测PLDH，但是该探针溶液不能区分不同类型的PLDH。
实施例7：
单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇(Au-AgNCs@AMP)荧光探针中引入辅助剂Al3+：将实施例2制备的Au-AgNCs@AMP荧光探针冻干称重后的固体，用已配置的pH＝6.5MES-NaOH缓冲溶液稀释，配制成浓度为30μg/mL的溶液，分别取1mL 该荧光探针溶液，向每1mL荧光探针溶液中分别加入六水合氯化铝(AlCl3·6H2O)，使其终浓度分别为10、20、30、40、50、60、70、100、150、200、250、300、400 ×10-6mol/L，混匀并静止10分钟，利用荧光光谱仪记录荧光探针溶液对不同浓度 AlCl3·6H2O的发射光谱(激发波长为340nm)(如图8所示)。结果显示Al3+的引入诱导Au-AgNCs@AMP荧光发射强度增强到3倍，该图说明了Al3+能够与 Au-AgNCs@AMP荧光探针产生较强的相互作用。
实施例8：
辅助剂Al3+作用的单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇(Au-AgNCs@AMP)荧光探针检测MES-NaOH缓冲溶液中乳酸脱氢酶(PLDH)的方法：将实施例2制备的Au-AgNCs@AMP荧光探针溶液冻干称重后的固体，用已配置的pH＝6.5 MES-NaOH缓冲溶液稀释，配制成浓度为30μg/mL的溶液。向以上配置的 Au-AgNCs@AMP荧光探针中加入六水合氯化铝(AlCl3·6H2O，150μM)，溶液混匀静止10分钟，得到辅助剂Al3+作用的单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针。
分别取1mL以上荧光探针溶液，向每1mL荧光探针溶液中分别加入间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)(如图9所示)、恶性疟原虫乳酸脱氢酶(PfLDH)(如图 10所示)、人源乳酸脱氢酶(HLDH)(如图11所示)、兔肌乳酸脱氢酶(RLDH)(如图12所示)的母液，使其终浓度分别为0、100、200、300、400、500、600、700、 800×10-9mol/L(浓度通过仪器nano 2000测得)，并利用荧光光谱仪记录荧光探针溶液对不同浓度的PLDH响应的荧光发射光谱(激发波长为340nm)。结果表明(如图13所示)，Al3+作为辅助剂的引入影响了PLDH与Au-AgNCs@AMP荧光探针的相互作用：对于PvLDH的荧光响应增强到3倍；而PfLDH、HLDH、RLDH不产生荧光增强响应，且有微弱的荧光淬灭响应。在辅助剂的作用下，该探针对不同类型的乳酸脱氢酶荧光增强响应出现显著差异，从而实现对PvLDH的选择性识别。因此，辅助剂Al3+的引入达到了拆分PvLDH的目的。
还需要说明的是，本发明的具体实施例只是用来示例性说明，并不以任何方式限定本发明的保护范围，本领域的相关技术人员可以根据上述一些说明加以改进或变化，但所有这些改进和变化都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针，其由如下步骤制备得到：
(1)利用蒸馏水配制20mmol/L的单磷酸腺苷溶液、10mmol/L的氯金酸溶液、10mmol/L的硝酸银溶液、500mmol/L的柠檬酸钠溶液；
(2)向反应釜中分别依次加入2.5mL、20mmol/L的单磷酸腺苷溶液，5.9mL的蒸馏水，0.2mL、10mmol/L的氯金酸溶液，1mL、10mmol/L的硝酸银溶液，0.4mL、500mmol/L的柠檬酸钠溶液，将反应釜放入120℃的干燥箱中加热30分钟后停止加热，待反应釜冷却至室温，即得到单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针原液；
或，称取50mmol单磷酸腺苷固体于反应容器中，加入8.4mL蒸馏水混合充分，向混合溶液中加入0.2mL、10mmol/L氯金酸溶液，1mL、10mmol/L硝酸银溶液，0.4mL、500mmol/L柠檬酸钠溶液，使用电加热套于80℃搅拌6h后，停止加热，待反应容器冷却至室温，即得到单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针原液；
(3)将步骤(2)获得的单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针原液用丙酮沉淀的方法进行纯化，其中丙酮和单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针原液的体积比为2：1，然后离心去掉上清，冻干沉淀即得到单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针固体样品，在4℃条件下避光保存。
2.权利要求1所述的单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针在检测间日疟原虫乳酸脱氢酶中的应用。
3.如权利要求2所述的单磷酸腺苷保护的金银合金纳米簇荧光探针在检测间日疟原虫乳酸脱氢酶中的应用，其特征在于：是在辅助剂Al3+的作用下实现对间日疟原虫乳酸脱氢酶的检测。
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