CN114199844A - 一种金纳米簇及其在制备检测碱性磷酸酶荧光探针中的应用 - Google Patents
一种金纳米簇及其在制备检测碱性磷酸酶荧光探针中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种胞苷5′‑单磷酸保护的金纳米簇(AuNCs@CMP)及其在制备检测碱性磷酸酶荧光探针中的应用，属于荧光探针技术领域。本发明开发了一种胞苷5′‑单磷酸保护的新型金属纳米簇，作为碱性磷酸酶(ALP)的纳米底物，实现对其高灵敏检测。壳寡糖(COS)的引入显著放大了ALP水解产物的荧光信号，将检测限(LOD)提高到0.00026U·L‑1。该荧光探针亦成功地应用于人血清中碱性磷酸酶的测定(LOD＝0.00066U·L‑1)。因此，本发明开发的AuNCs@CMP纳米底物，将金纳米簇、聚合物和酶水解分析相结合，能够实现磷酸酶的高选择性、高灵敏度的直接检测，拓展了纳米簇在生物学中的应用。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种新型的胞苷5′-单磷酸保护的金纳米簇(AuNCs@CMP)及其在制备检测碱性磷酸酶荧光探针中的应用。
背景技术
碱性磷酸酶(ALP)作为一种重要的水解酶，广泛分布于人体组织和体液中，以骨、肝、乳腺、小肠、肾中含量较高，其大部分由骨细胞产生，小部分来自肝，经胆汁排入肠道。ALP本质上催化核酸、功能蛋白和小分子的去磷酸化，促进代谢中磷酸单酯的转磷酸化，对维持活体的代谢平衡起着至关重要的作用。ALP在酶免疫检测和分子生物学中已被广泛应用，它也作为临床诊断的必要指标在常规血清检测中进行测定。
传统的mRNA和免疫反应的方法用于ALP水平定量测定，但具有造价高、耗时等弊端。近年来，基于荧光方法的选择性和灵敏度高吸引了人们的研究兴趣。然而，其固有的一些缺陷限制了其实际应用，包括有机染料的低溶解度和光稳定性，半导体量子点的毒性，以及检测过程均需借助其它媒介来实现。因此，开发简便、直接测定碱性磷酸酶的新材料对临床诊断具有重要价值。
发光金属纳米簇是一种很有前途的光学纳米材料，其优异的物理化学和良好的光学特性引起了广泛的兴趣。由于其制备简单、细胞毒性低，在生物传感和生物成像方面的应用受到了特别的关注。壳寡糖(COS)是由N-乙酞-D-葡萄糖胺以β-1,4糖苷键结合而成的多糖，在手术缝合线、营养保健品及可吸收型医用植入材料等方面具有广阔应用。高脱乙酞度的COS对于打开细胞间连接效果最显著，可通过动物肠道上皮细胞直接被吸收。基于COS的分子量低、水溶性好、功能作用大、易被人体吸收、生物活性高等优势，其优越的生物活性为碱性磷酸酶检测提供了基础。基于金纳米簇的ALP传感器件层出不穷，但复杂的平台构建和迂回的ALP检测过程限制了其研究进展。因此，迫切需要开发一种新的、直接、易操作的碱性磷酸酶检测系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的胞苷5′-单磷酸盐保护的金纳米簇(AuNCs@CMP)及其在制备检测碱性磷酸酶荧光探针中的应用。
本发明所述的胞苷5′-单磷酸保护的金纳米簇基于水热法制备，其是将HAuCl4、CMP和柠檬酸钠(氢氧化钠调节柠檬酸钠pH＝4～5)溶于蒸馏水得到混合溶液，溶液终体积为8～15mL，混合溶液中HAuCl4、CMP和柠檬酸钠的终浓度分别为0.8～1.2mM、2.8～3.2mM和20.0～30.0mM；然后在90～110℃下反应15～30min，反应结束后，将反应液冷却至室温，并采用丙酮法进行纯化：将上述制备的8～15mL反应液置于50mL离心管，向其中加入反应液体积1.5～3.0倍量的丙酮溶液振荡混合均匀，再将离心管以3000～5000转/分钟离心20～40分钟，最后收集沉淀并冷冻干燥过夜得到高红光发射的胞苷5′-单磷酸保护的金纳米簇(AuNCs@CMP)；进而溶于蒸馏水制得1000μg·mL-1的母液备用。
进一步，本发明制备的胞苷5′-单磷酸保护的金纳米簇(AuNCs@CMP)可用于痕量碱性磷酸酶的检测，其首先是将浓度为10UL-1的ALP母液和浓度为1000μg·mL-1的AuNCs@CMP母液在PBS(10.0mM，pH7.4)缓冲液中混合，AuNCs@CMP的终浓度为100μg·mL-1，ALP的终浓度为0～0.50U·L-1；然后将以上混合溶液在37℃孵育20min，再向以上混合溶液加入COS(终浓度40μg·mL-1)，混合均匀后在380nm激发下测量溶液在400～750nm范围内的荧光光谱，得到线性方程y＝0.09499x+1.6508，R2＝0.9947，其中y为485nm和570nm处荧光强度比值，x为ALP的浓度；进而利用该线性方程，最后测量溶液485nm和570nm处荧光强度比值，进而计算溶液中痕量ALP的浓度。
进一步，本发明制备的胞苷5′-单磷酸保护的金纳米簇(AuNCs@CMP)可用于血清中碱性磷酸酶的检测，其首先是将浓度为10％(v/v)的人血清白蛋白溶液在PBS(10.0mM，pH7.4)缓冲液中稀释得到人血清白蛋白浓度为5％(v/v)的PBS缓冲液，向其中加入终浓度为100μg·mL-1的AuNCs@CMP；再分别加入终浓度为0～0.50U·L-1ALP；然后将以上混合溶液在37℃下孵育20min，在380nm激发下测量溶液在400～750nm范围内的荧光光谱，得到线性方程y＝0.08789x+1.5928，R2＝0.9974，其中y为溶液485nm和570nm处荧光强度比值，x为ALP的浓度；最后利用该线性方程，通过测量人血清485nm和570nm处荧光强度比值，进而计算人血清中ALP的浓度。
本发明的胞苷5′-单磷酸盐保护的金纳米簇(AuNCs@CMP)，其在570nm红光发射，可作为直接测定碱性磷酸酶(ALP)的荧光探针。壳寡糖(COS)的存在使水解产物的荧光信号显著放大，最终ALP的检测限为0.0002552U·L-1，响应范围为0～0.02UL-1(如图9)。该荧光探针成功地应用于人血清中碱性磷酸酶的测定(LOD＝0.00066U·L-1，如图13所示)。因此，本发明将金纳米簇、聚合物和酶水解分析相结合，拓展了纳米簇在生物学中的应用。
附图说明
图1：实施例1制备得到的AuNCs@CMP的紫外可见吸收光谱、荧光激发光谱和发射光谱(从左到右)；紫外吸收谱在400-600nm之间没有等离子体共振吸收峰出现说明合成的材料为金属纳米簇，其最佳激发峰位于380nm，发射峰位于570nm，该波段为红光发射。
图2：AuNCs@CMP(100μg·mL-1)在0.30U·L-1ALP存在下在室温随孵化时间变化的发射光谱；插图显示了485nm和570nm荧光强度比值与孵化时间的关系图；对应实施例2；表明随着孵化时间的增加，485nm处荧光强度越来越强，570nm处荧光越来越弱；在插图中，随着孵化时间的增加，485nm和570nm处荧光强度比值也在增加。
图3：AuNCs@CMP(100μg·mL-1)在不同浓度ALP(0、0.0050、0.010、0.050、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50U·L-1)下的发射光谱，对应实施例2；表明随着ALP浓度的增加，485nm处的荧光强度越来越强，570nm处的荧光越来越弱。
图4：AuNCs@CMP(100μg·mL-1)与不同浓度ALP(0、0.0050、0.010、0.050、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50U·L-1)室温混合后在壳寡糖(COS)诱导下(40μg·mL-1)的发射光谱，对应实施例3；表明随着ALP浓度的增加，485nm处荧光强度越来越强，570nm处的荧光峰强度越来越弱。
图5：图3和图4发射光谱中485nm和570nm处荧光强度比的比较曲线。在图3中，可以看到485nm和570nm处的荧光峰位较清晰；而在图4中，随着COS将信号放大后，485nm处荧光发射大幅度增强，570nm处的荧光峰强度相比较弱。图5表示，随着ALP浓度的增加，图3中485nm和570nm荧光强度比值也随之增加，但增加的趋势较缓慢；但图4中引入COS后，485nm和570nm荧光强度比值增加较图3的增加明显，这说明COS确实起到放大检测信号的作用。
图6：AuNCs@CMP(100μg·mL-1)和不同浓度ALP(0、0.0050、0.010、0.050、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50U·L-1)的混合物在37℃下加入COS(40μg·mL-1)后的发射光谱。表明随着ALP浓度的增加，485nm处荧光强度越来越强，570nm处的荧光峰强度相比较弱。相比于图4的室温下混合孵育，图6中37℃下混合孵育的实验组荧光强度增加更大，因此选用37℃作为最佳孵育温度。
图7：AuNCs@CMP(100μg·mL-1)和COS(40μg·mL-1)的混合物在37℃下加入不同浓度ALP(0～0.50U·L-1)后的发射光谱；如图7所示，不同浓度ALP对应的发射光谱曲线几乎重合，说明该添加顺序不能达到检测ALP的目的。
图8：在37℃下，ALP和COS(40μg·mL-1)添加顺序不同，AuNCs@CMP的485nm和570nm处荧光强度比值随ALP浓度的变化。表明，对于图7所示实验组随着ALP浓度的增加，485nm和570nm处荧光强度比值几乎没有变化，而图6所示实验组随着ALP浓度的增加，485nm和570nm处荧光强度比值增加明显。
因此，我们筛选出实验添加顺序为：AuNCs@CMP与ALP在37℃孵育20min，再向混合溶液引入COS，最终检测其荧光光谱变化。
图9：AuNCs@CMP(10.0μg·mL-1)和不同浓度ALP(0、0.0010、0.0030、0.0050、0.0070、0.010、0.015和0.020U·L-1)在37℃下加入4μg·mL-1COS后的发射光谱；插图为485nm和570nm处荧光强度比值与ALP浓度的关系曲线。表明随着ALP浓度的增加，485nm和570nm处荧光强度比值同样增加，485nm和570nm处荧光强度比值与ALP浓度间几乎成线性关系，线性方程为y＝0.09499x+1.6508，R2＝0.9947，其中y为485nm和570nm处荧光强度比值，x为ALP的浓度。
图10：AuNCs@CMP(100μg·mL-1)和不同浓度ALP(0、0.0050、0.010、0.050、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50U·L-1)在5％(v/v)人血清中，在40μg·mL- 1COS存在下的发射光谱。表明随着ALP浓度的增加，485nm处荧光强度增加明显，570nm处荧光强度较弱。
图11：图10中485nm和570nm处荧光强度比值与ALP浓度的关系曲线，表明随着ALP浓度的增加，485nm和570nm处荧光强度比值增加明显。
图12：AuNCs@CMP(10.0μg·mL-1)和不同浓度ALP(0、0.0010、0.0030、0.0050、0.0070、0.010、0.015、0.020U·L-1)在5％(v/v)人血清中，引入4μg·mL-1COS后的发射光谱，表明在人血清中随着ALP浓度的增加，485nm处荧光强度增加明显。
图13：图12中485nm和570nm处荧光强度比值与ALP浓度的对应曲线，表明随着ALP浓度的增加，485nm和570nm处荧光强度比值增加明显，485nm和570nm处荧光强度比值与ALP浓度间几乎成线性关系，线性方程为y＝0.08789x+1.5928，R2＝0.9974，其中y为485nm和570nm处荧光强度比值，x为ALP的浓度。通过该线性方程，可以通过测量溶液485nm和570nm处荧光强度比值，进而计算人血清中ALP的浓度。
具体实施方式
本发明中使用的胞苷5'-单磷酸盐(CMP)购于TCI(上海)发展有限公司产品(纯度≥99％)。氯金酸(HAuCl4)、柠檬酸钠、氢氧化钠(NaOH)购于北京化工厂(纯度≥99.9％，)。壳寡糖(COS，2000MW)购自阿拉丁化工有限公司。碱性磷酸酶(ALP，取自牛肠黏膜)，人血清白蛋白购自英国Sigma-Aldrich公司。蒸馏水(ρ＝18.2MΩcm，25℃)来自水净化系统(Millipore milliq)。磷酸二氢钠(NaH2PO4)和磷酸一氢钠(Na2HPO4)溶于蒸馏水得到浓度为10.0mM的溶液，将得到的10.0mM的磷酸二氢钠(NaH2PO4)和磷酸一氢钠(Na2HPO4)的水溶液混合制备磷酸缓冲液(PBS，10.0mM，pH7.4)。将购买的浓度为1000U·L-1ALP溶于PBS缓冲液(10.0mM，pH7.4)中稀释得到浓度为10U·L-1的ALP母液。
实施例1
AuNCs@CMP的制备与纯化：
基于水热法制备了CMP保护的金纳米簇AuNCs@CMP。将HAuCl4、CMP和柠檬酸钠(使用NaOH调节pH4.5)溶于蒸馏水得到混合溶液，混合溶液终体积为10.0mL，混合溶液中HAuCl4、CMP和柠檬酸钠的终浓度分别为1.0mM、3.0mM和25.0mM；以上混合溶液在100℃下反应20min，反应停止后，将反应产物冷却至室温，并采用丙酮法纯化：将上述制备的10.0mL溶液置于50mL离心管，向其中加入20mL丙酮溶液，振荡混合均匀，将离心管在离心机中以4000转/分钟离心30分钟后，收集沉淀并冷冻干燥过夜得到高红光发射的AuNCs@CMP，称重溶于蒸馏水制得1000μg·mL-1的浓度母液备用。
实施例2
以AuNCs@CMP为直接底物，测定ALP。
将已制备的浓度为10U·L-1的ALP母液和浓度为1000μg·mL-1的AuNCs@CMP母液在PBS(10.0mM，pH7.4)缓冲液中混合，混合得到AuNCs@CMP的终浓度为100μg·mL-1，ALP的终浓度分别为0、0.0050、0.010、0.050、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50U·L-1；以上混合溶液在37℃下孵育20min，测定溶液的发射光谱，均采用380nm的激发线。
实施例3
以AuNCs@CMP为直接底物，COS为放大器，测定ALP。
首先将浓度为10U·L-1的ALP母液和浓度为1000μg·mL-1的AuNCs@CMP母液(实施例1)在PBS(10.0mM，pH7.4)缓冲液中混合，混合得到AuNCs@CMP的终浓度为100μg·mL-1，ALP的终浓度分别为0、0.0050、0.010、0.050、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50U·L-1；以上混合溶液在37℃孵育20min，再加入COS(在PBS中的终浓度40μg·mL-1)，混合均匀后测定其发射光谱；为了形成对比，在AuNCs@CMP溶液(终浓度100μg·mL-1)中先加入COS(终浓度40μg·mL-1)，再向其中加入不同浓度的ALP溶液(终浓度分别为0、0.0050、0.010、0.050、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50U·L-1)，采用以上两种不同的添加顺序，比较其荧光光谱差异，相关光谱测量采用380nm的激发线。
实施例4
人血清中碱性磷酸酶的测定。
为验证该方法在临床诊断中的实际应用，将AuNCs@CMP用于人血清中碱性磷酸酶的检测。将购买的浓度为10％(v/v)的人血清白蛋白溶液在PBS缓冲液中稀释得到人血清白蛋白浓度为5％(v/v)的PBS缓冲液，再向其中加入AuNCs@CMP溶液(终浓度100μg·mL-1)，然后加入不同浓度的ALP溶液(终浓度分别为0、0.0050、0.010、0.050、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50U·L-1)，以上混合溶液在37℃下孵育20min。在380nm激发下，获得以上样品在400～750nm范围内的荧光光谱。
还需要说明的是，本发明的具体实施例只是用来示例性说明，并不以任何方式限定本发明的保护范围，本领域的相关技术人员可以根据上述一些说明加以改进或变化，但所有这些改进和变化都应属于本发明权利要求的保护范围。
Claims (6)
1.一种胞苷5′-单磷酸保护的金纳米簇，其特征在于：是基于水热法制备，将HAuCl4、胞苷5′-单磷酸(CMP)和柠檬酸钠(pH＝4.0～5.0)溶于蒸馏水得到混合溶液，溶液终体积为8～15mL，混合溶液中HAuCl4、CMP和柠檬酸钠的终浓度分别为0.8～1.2mM、2.8～3.2mM和20.0～30.0mM；然后在90～110℃下反应15～30min，反应结束后，将反应液冷却至室温：然后将上述制备的8～15mL反应液置于离心管中，向其中加入反应液体积1.5～3.0倍量的丙酮溶液振荡混合均匀，再将离心管以3000～5000转/分钟离心20～40分钟，最后收集沉淀并冷冻干燥过夜得到高红光发射的胞苷5′-单磷酸保护的金纳米簇。
2.权利要求1所述的胞苷5′-单磷酸保护的金纳米簇在制备检测碱性磷酸酶荧光探针中的应用。
3.如权利要求2所述的胞苷5′-单磷酸保护的金纳米簇在制备检测碱性磷酸酶荧光探针中的应用，其特征在于：用于溶液中痕量碱性磷酸酶的检测。
4.如权利要求3所述的胞苷5′-单磷酸保护的金纳米簇在制备检测碱性磷酸酶荧光探针中的应用，其特征在于：首先是将浓度为10U·L-1的ALP母液和浓度为1000μg·mL-1的AuNCs@CMP母液在PBS(10.0mM，pH7.4)缓冲液中混合，AuNCs@CMP的终浓度为100μg·mL-1，ALP的终浓度为0～0.50U·L-1；然后将以上混合溶液在37℃孵育20min，再加入壳寡糖(COS)，其终浓度为40μg·mL-1；混合均匀后在380nm激发下测量溶液在400～750nm范围内的荧光光谱，得到线性方程为y＝0.09499x+1.6508，R2＝0.9947，其中y为发射光谱485nm和570nm处荧光强度比值，x为ALP的浓度；最后利用该线性方程，通过测量溶液485nm和570nm处荧光强度比值，进而计算溶液中痕量ALP的浓度。
5.如权利要求2所述的胞苷5′-单磷酸保护的金纳米簇在制备检测碱性磷酸酶荧光探针中的应用，其特征在于：用于人血清中碱性磷酸酶的检测。
6.如权利要求5所述的胞苷5′-单磷酸保护的金纳米簇在制备检测碱性磷酸酶荧光探针中的应用，其特征在于：首先是将浓度为10％(v/v)的人血清白蛋白溶液在PBS(10.0mM，pH7.4)缓冲液中稀释得到人血清白蛋白浓度为5％(v/v)的PBS缓冲液，向其中加入浓度为100μg·mL-1的AuNCs@CMP；再加入终浓度为0～0.50U·L-1ALP；然后将以上混合溶液在37℃下孵育20min，在380nm激发下测量溶液在400～750nm范围内的荧光光谱，得到线性方程y＝0.08789x+1.5928，R2＝0.9974，其中y为溶液485nm和570nm处荧光强度比值，x为ALP的浓度；最后利用该线性方程，通过测量人血清485nm和570nm处荧光强度比值，进而计算人血清中ALP的浓度。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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