CN1454262A - 用于测定5′－核苷酸酶活性的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于测定5’－核苷酸酶活性的方法，其中以本身已知的方式、在本身已知的条件下将生物学样品与作为底物的核苷酸戊糖单磷酸一起保温，用钼酸铵和还原剂处理释放的无机磷酸而将其转变成有色复合物，通过已知方法测量颜色强度，并使用已知计算方法和/或借助校准曲线，由测量值计算5’－核苷酸酶活性或单位时间内释放的无机磷酸的量(该数值与5’－核苷酸酶活性成正比)。依照本发明，将5’－AMP、5’－CMP、5’－UMP、5’－GMP、5’－IMP和5’－TMP用作核苷酸戊糖单磷酸，并在所有这六种底物上进行测量。本发明还涉及用于进行上述方法的试剂盒。
Description
本发明涉及用于测定体液、组织制备物和/或细胞元件中的5’-核苷酸酶(5’-核糖核苷酸磷酸水解酶)活性的方法。本发明还涉及可用于依照本发明的方法的试剂盒。
在恶性过程偶联、伴随和作为其维持因素的代谢扰动中，核苷酸代谢变化同样发挥重要作用。这解释了在肿瘤治疗所采用的干预中将影响与这些过程密切相关的DNA/RNA合成和核酸-核苷酸代谢作为主要目标的原因。
检查核酸-核苷酸代谢过程在检测肿瘤过程和区分良性与恶性过程中具有突出重要性。在监测肿瘤治疗时检查核酸代谢过程的变化同样是必不可少的，因为在压倒性多数的化疗中当人为引起核酸-核苷酸代谢扰动和人为损害DNA合成时显示治疗效果。这些人为引起的变化是肿瘤治疗有效性的决定性因素，但是它们对健康细胞的基本损害和对细胞及器官功能的扰动也负有责任。
在常规条件下，5’-核苷酸酶(5’-核糖核苷酸磷酸水解酶)即由Reis检测到的一种酶(J.Reis，ber die spezifische Phosphataseder Nerwengewebe，Enzymologia，2：110-115，1937)的活性测定是最合适的方法之一。这种酶只催化核苷酸戊糖单磷酸(5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5’-IMOP、5’-TMP、dAMP、dCMP、dUMP、等)的水解，生成核苷酸和无机磷酸(O.Bodansky、M.K.Schwartz，5’-Nucleotidase(5’-核苷酸酶)，Adv.Clin.Chem.，11：277-327，1968)，而且可以看作是最灵敏的质膜标记之一。5’-核苷酸酶的活性测定既用于临床目的又用于实验测试；在前一种情况中，通常在非溶血血清和/或血溶物上进行测量，而在后一种情况中，通常在体液、组织制备物(如质膜)和/或细胞元件(如微粒体、细胞质、溶酶体)上进行测量(A.Solyom、E.G.Trans，Enzyme Markers inCharacterization of Isolated Plasma Membranes(分离质膜表征中的酶标记)，Enzyme，13：329-372，1972)。
由于5’-核苷酸酶特异分割核苷酸戊糖单磷酸，因此广泛用于测定5’-核苷酸酶的方法是将生物学样品与核苷酸戊糖单磷酸底物一起保温，然后在加入合适的显色剂后通过比色法(分光光度法)测定单位时间内在酶的作用下释放的无机磷酸的量。若待检验的生物学样品还包含干扰5’-核苷酸酶的成分(对于血液或血清，这种成分是碱性磷酸酶；对于溶酶体膜，这种成分是其它糖磷酸)，则在存在能够抑制其作用的抑制剂时进行保温。在存在还原剂(通常是氯化锡，任选与肼盐或抗坏血酸一起)时使用钼酸铵作为显色剂，它与无机磷酸发生反应而形成强烈的蓝色复合物。考虑到钼酸铵会沉淀生物学样品中的蛋白质，因此或是在进行显色反应之前除去蛋白质，或是通过向混合液中添加适当增溶剂而使蛋白质保留在溶液中。根据我们最新的知识，后者是最新式的比色法之一。采用这种方法时，测定所需样品甚至能够降至几十微升，而测定的精度能够得到相当大的提高。下列论文及其引用的参考文献等详细描述了依据上述原理的5’-核苷酸酶活性测定：J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，7：18-25，1969；13：453-459，1975；15：715-718，1977；18：781-788，1980；Clin.Chem.，23：2311-2323，1977；27：464-465，1981；Adv.Clin.Chem.，11：277-332，1968。
以前为了诊断或一般实验目的而根据上述原理测定5’-核苷酸酶活性的所有常规方法的共同特征是只在单一底物上测量酶活性。作为底物，最常用的是腺苷-5’-单磷酸(5’-AMP)，胞苷-5’-单磷酸(5’-CMP)或肌醇-5’-单磷酸或者(在血溶物中)尿苷-5’-单磷酸(5’-UMP)次之。
在我们进行的用于检测恶性过程和监测肿瘤治疗效果的实验中，在一份生物学样品中在六种不同底物即腺苷-5’-单磷酸(5’-AMP)、胞苷-5’-单磷酸(5’-CMP)、尿苷-5’-单磷酸(5’-UMP)、鸟苷-5’-单磷酸(5’-GMP)、肌醇-5’-单磷酸(5’-IMP)和胸苷-5’-单磷酸(5’-TMP)上平行测量5’-核苷酸酶活性。在β-甘油磷酸底物上测量该生物学样品中的非特异磷酸酶活性，并将此作为修正。我们发现，尽管在不同核苷酸戊糖单磷酸上测量得到的5’-核苷酸酶活性值彼此在数量上不同，然而对于健康个体而言在不同底物上测量得到的活性值之间存在严格的相关性。这是因为在生理条件下血清中存在核酸-核苷酸代谢过程的动态平衡状态，就像普通的代谢池。我们还发现，在健康和患病个体的血清中在上述六种底物上测量得到的5’-核苷酸酶活性值差异不能归于底物化学本质的差异，而是来自生理学过程。我们出乎意料的还发现，上述严格相关性在化疗后发生改变，而且根据治疗是否对嘌呤代谢、嘧啶代谢、或胸苷代谢发生影响而显示相当大的差异。因而，根据在上述六种不同底物上进行的活性测量的结果，可以确定采用的治疗是否有效，它对意欲影响的领域是否有效，和它是否诱导非期望细胞损伤。这种认识构成了本发明的基础。
我们还发现，在化疗后，甚至短时间(24小时)，在所有六种不同底物上呈现了5’-核苷酸酶活性的易见变化，因而能够在较短时间内、以较少不确定性作出关于维持、更改或终止治疗的很有根据的决定。出于比较的目的，我们在这里要提到，只有在治疗大约1周后才能够在大多数肿瘤标记中观察到可以作为决策依据的变化。
我们还发现，当在所有上述六种底物上平行测量5’-核苷酸酶活性并将结果相综合时，对于个体的条件、肝和骨过程的发生建立的诊断要比只在单一底物上进行的测量可靠得多。这可以为恶性过程的早期识别提供有价值的帮助。
最后，我们还发现，根据生化过程的因果互联，在上述六种底物上进行的5’-核苷酸酶活性测量能够取代在实验和临床实践中不常使用的酶活性测定，因为后者要复杂得多，而且根本难以作为常规测试进行。这些取代或替代可能如下：5’-CMP核苷酸酶→胞苷激酶→胞苷脱氨酶→胞苷三磷酸合酶；5’-GMP核苷酸酶→鸟苷脱氨酶；5’-IMP核苷酸酶→IMP脱氢酶；5’-TMP核苷酸酶→胸苷激酶←→胸苷合酶。
因此，一方面，本发明涉及测定5’-核苷酸酶活性的方法，其中：以本身已知的方式、在本身已知的条件下将生物学样品与作为底物的核苷酸戊糖单磷酸一起保温，用钼酸铵和还原剂处理释放的无机磷酸而将其转变成有色复合物，通过已知方法测量颜色强度，并使用已知计算方法和/或借助校准曲线，由测量值计算5’-核苷酸酶活性或单位时间内释放的无机磷酸的量(该数值与5’-核苷酸酶活性成正比)。依照本发明，将5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5’-IMP和5’-TMP用作核苷酸戊糖单磷酸，在所有这六种底物上进行测量。
在上文引用的文献和论文等中能够找到关于测量需要的反应物、反应条件和计算方法的详细资料。作为范例，我们在下文中给出了可用于测量而无需清除蛋白质的试剂系统的组成，经证明它是特别优选的，还描述了应当如何将它与计算方法一起用于在血清样品上进行的测量，但是并非将本发明的方法限于下文讨论的试剂系统和条件。
将要使用的试剂如下：
(1)缓冲剂/激活剂溶液：
75-400mM Tris、5.0-10.0mM MgCl2或2.0-5.0mM MnCl2、1.0-5.0mM KCl；用3-6M HCl水溶液将溶液的pH调至9-9.5。
(2)抑制剂：
只有在生物学样品包含干扰5’-核苷酸酶活性测定的物质时才使用抑制剂。对于血液和血清，这种物质是碱性磷酸酶，可以用含10-20g/L L-半胱氨酸或L-赖氨酸或等同量的L-半胱氨酸盐或L-赖氨酸盐或者50-250mg/L伴刀豆凝集素A的溶液(溶剂是上文所述缓冲液)进行抑制。当在溶酶体膜上进行测量时，将上述缓冲液中的5-50mML(+)-酒石酸(盐)溶液用于抑制存在的糖磷酸。
(3)底物：
使用5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5’-IMP和5’-TMP的1-10mM脱矿质水溶液作为底物。还应当在相同浓度的溶液中使用β-甘油磷酸或苯基磷酸二钠作为底物。后两种底物是测定非特异磷酸酶活性的两种已知底物；也应当测定此活性，以精确测定5’-核苷酸酶活性。
(4)蛋白质增溶剂：
最高纯度级的纯净的(浓缩的)甲酸或丙酸。
(5)稳定剂：
1∶9-4∶6v/v甘油与水的混合液，或0.5-5％(w/w)山梨醇水溶液，或0.25-2.5％(w/w)甘露醇水溶液，或1∶2-1∶1v/v正丙醇与水的混合液。
将少量(0.001-0.01％w/w)叠氮化钠溶于稳定剂以提高其耐贮性是明智的。
(6)显色剂：
5-10g/L钼酸铵的脱矿质水溶液。
(7)还原液：
溶于1M氢氯酸水溶液的1-5g/L SnCl2溶液，或1-5g/L抗坏血酸的脱矿质水溶液。
(8)磷标准液：
1.61mM无机磷酸溶液，系列稀释。
如下进行测量：
通过以下列v/v比率混合蛋白质增溶剂来制备用于测定无机磷酸量的测定剂：-4∶1-1∶1(甘油水溶液)，或-3∶1-1∶1(山梨醇水溶液)，或-5∶1-1∶2(甘露醇水溶液)，或-7∶1-4∶1(正丙醇水溶液)，并向生成的混合液中加入15-25％体积(相对于最终混合液的总体积)的显色剂。
以表1所示比率混合表1前五行所列成分，并将生成的混合液于37℃保温60分钟。然后向混合液中加入表1所列其它成分，搅动生成的混合液，静置15分钟，并测量溶液在620-720nm的吸光率。表1中以“5’-ND+ALP”为标题的那列表示一起测量5’-核苷酸酶活性与碱性磷酸酶活性(即未使用抑制剂)的测量值，而以“5’-ND”为标题的那列表示在存在碱性磷酸酶抑制剂时的测量时。在两种测量的结果中都出现了非特异磷酸酶活性。分别在存在抑制剂时在β-甘油磷酸底物上测定非特异磷酸酶活性；分别由先前获得的5’-核苷酸酶+碱性磷酸酶活性或5’-核苷酸酶活性减去得到的数值。
如下进行计算：
(1)计算消光差值(ΔE值)：β-甘油磷酸：E样品-E盲试＝ΔEβ-甘油磷酸其它底物：E样品-E样品盲试＝ΔE5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5-TMP、5’-IMP标准：E标准-E试剂盲试＝ΔE标准
(2)根据上文ΔE值计算酶活性：其中K是由如下公式计算得到的常数：
保温总体积(ml)×1000----------------------------------------------保温时间(min)×样品体积(ml)×比色杯厚度
(3)由上文活性数据计算各种酶活性或联合活性：非特异磷酸酶活性＝在β-甘油磷酸上测量得到的活性在不同核苷酸戊糖单磷酸上测量得到的5’-核苷酸酶活性＝5’-ND活性-非特异磷酸酶活性5’-核苷酸酶+碱性磷酸酶活性＝5’-ND+ALP-非特异磷酸酶活性碱性磷酸酶活性＝5’-ND+ALP-5’-ND-非特异磷酸酶活性
若生物学样品不是血清，则以相同方式进行测量，只是有时不需要抑制剂，或使用其它抑制剂。同样如上所述进行计算。
表1溶液 5’-ND+ALP 5’-ND 样品盲试 标准 试剂盲试缓冲剂/激活剂 0.125ml 0.125ml 0.125ml - -脱矿质水 0.075ml 0.050ml 0.075ml - -抑制剂 - 0.025ml - - -样品(血清) 0.025ml 0.025ml - - -底物 0.025ml 0.025ml - - -测定剂 0.750ml 0.750ml 0.750ml 0.750ml 0.750ml脱矿质水 - - - 0.125ml 0.250ml样品(血清) - - 0.025ml - -底物 - - 0.025ml - -标准 - - - 0.125ml -还原液 0.125ml 0.125ml 0.125ml 0.125ml 0.125ml
根据在上文一系列测量中在各种底物上得到的5’-核苷酸酶活性值，可以得出如下结论：
关于状况的决策：
当六个测量活性值相加得到的数值高达54-65U/L、同时碱性磷酸酶活性为10-25U/L时，指示无疾病状态。若碱性磷酸酶活性超过50U/L、同时5’-核苷酸酶活性值的和为54-65U/L，则指示骨过程。若5’-核苷酸酶活性的和超过70U/L，则这是患病状态的可靠指示。若同时碱性磷酸酶活性超过35U/L，则这是存在肝损伤的可靠指示。对于恶性肝肿瘤，5’-核苷酸酶活性值的和及碱性磷酸酶活性都比正常值高4-10倍。
关于治疗的评估：
在5’-AMP、5’-GMP和5’-IMP底物上测量得到的活性变化指示肿瘤治疗干预了嘌呤代谢，而在5’-CMP、5’-UMP和5’-TMP底物上测量得到的活性变化指示对嘧啶代谢的干预。数值无变化指示治疗无效。活性降低总是指示治疗对过程产生了有益干预。在许多情况中，5’-核苷酸酶活性在进行化疗后显著降低，以至于在各种底物上分别测量的活性和这些活性的和都低于10U/L，甚至有时5’-核苷酸酶活性还能够获得负值。这是由于治疗攻击核苷酸代谢但不影响非特异磷酸酶活性值；在应当由较低5’-ND活性值减去较高非特异磷酸酶活性值时即获得负活性值。当5’-核苷酸酶活性值低于那些由健康对照获得的数值时，这已经指示对具有快速核苷酸代谢的健康细胞(主要是肠粘膜、骨髓和红细胞)的细胞毒性损伤，特别是当在所有六种底物上测量的所有5’-核苷酸酶活性都发生这种变化的时候。
根据又一方面，本发明涉及本发明方法用于诊断是否存在恶性过程和/或监测在恶性过程治疗中所采用疗法的效果的用途。
本发明还涉及可用于本发明方法的试剂盒，除了可通过形成无机磷酸、将生成的磷酸转变成有色复合物、并通过光度法测量颜色强度而用于测定5’-核苷酸酶活性的试剂盒的常规成分以外，它还包含5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5’-IMP和5’-TMP作为底物。
试剂盒的常规成分可以是那些例如上文引用的发表物中公开的已知方法所采用的试剂。优选试剂盒可包含下列常规成分：-缓冲剂-蛋白质增溶剂-稳定剂-显色剂-还原剂-磷标准还有(如果需要的话)-抑制剂，和/或-除了核苷酸戊糖单磷酸以外的其它底物(诸如β-甘油磷酸)。
上文本发明方法的例示性描述中所列的那些成分是上文常规成分的优选代表。试剂盒可以上述浓度的溶液的形式或使用前需要稀释的更浓的溶液的形式或纯净的化学品的形式包含常规成分。
下文给出了在血清样品上进行的5’-核苷酸酶活性测量的结果作为范例，以及可由此得出的结论。各种底物的量和测定条件始终如表1中所示。测量中所用各种试剂的准确组成如下：(1)缓冲剂/激活剂溶液：75.0mM Tris·HCl、5.0mM MgCl2、5.0mM KCl；pH9.3。(2)抑制剂：将0.29g L-半胱氨酸·HCl溶于20.0ml缓冲剂/激活剂溶液。(3)底物：8.0mM 5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5’-IMP、5’-TMP和β-甘油磷酸的脱矿质水溶液。(4)蛋白质增溶剂：最高分析纯级的纯净的(浓缩的)甲酸。(5)稳定剂：300ml最高分析纯级的甘油+700ml脱矿质水+0.05gNaN3。(6)显色剂：8.0g/L钼酸铵的脱矿质水溶液。(7)还原液：将0.20g SnCl2溶于100ml 1.0M氢氯酸水溶液。(8)磷标准液：浓度为1.61mM的“Dyalab”型无机磷酸盐溶液(用于进一步的千倍稀释)。测定剂：将200ml成分(4)与200ml成分(5)和100ml成分(6)混合。
对下列情况进行测量：-健康个体和临床诊断患有肿瘤的治疗前个体。结果列于表2。-监测乳腺肿瘤患者手术后的CMF(环磷酰胺-氨甲蝶呤-5-氟尿嘧啶)治疗。结果列于表4和5。-监测骨肉瘤患者的氨甲蝶呤(叶酸拮抗剂)治疗。结果列于表7。
出于简化目的，在表2和所有后面的表格中，只给出了各种底物的符号；但是这些符号始终表示在指定底物上测量得到的5’-核苷酸酶活性值。
根据表2的数据，对于患有验讫恶性瘤的患者，在六种底物上测量得到的5’-核苷酸酶活性值与健康对照值相比显著升高，除了淋巴瘤+骨表现是例外。对于肺肿瘤和/或偶联肝表现的淋巴瘤，5’-核苷酸酶活性值的和(∑5’-ND)显示最突出的升高。对于偶联骨表现的淋巴瘤，碱性磷酸酶活性的升高与5’-核苷酸酶活性的变化相比是最突出的。
表2
酶活性±标准偏差(U/L)测试组 5′-AMP 5′-CMP 5′-UMP 5′-GMP 5′-IMP 5′-TMP ∑5′-ND 碱性磷酸酶健康对照 6.5 10.1 8.4 4.1 3.3 8.5 40.9 13.2n＝157 ±1.2 ±2.2 ±1.6 ±1.1 ±0.9 ±1.6 ±1.43 ±4.4乳癌 23.45 50.92 34.8 13.76 10.6 27.87 161.4 45.7n＝341 ±4.1 ±9.8 ±4.7 ±4.3 ±3.3 ±5.8 ±5.33 ±7.8卵巢癌 47.56 95.87 67.1 33.2 13.7 30.4 287.8 65.5n＝189 ±7.8 ±9.1 ±6.9 ±4.4 ±3.5 ±6.1 ±6.3 ±11.2甲状腺癌 34.66 70.3 45.4 22.3 17.8 45.1 235.56 57.6n＝76 ±7.2 ±9.7 ±5.9 ±4.4 ±5.2 ±9.5 ±6.98 ±12.3非何杰金氏淋巴瘤 23.5 46.8 34.5 11.6 9.11 18.6 144.11 23.4n＝45 ±5.6 ±8.4 ±5.1 ±6.3 ±2.2 ±3.2 ±5.13 ±4.4何杰金氏病 34.6 80.6 57.5 21.2 10.7 15.5 220.1 43.3n＝36 ±3.9 ±12.7 ±7.4 ±5.2 ±1.9 ±3.2 ±5.71 ±6.2恶性黑素瘤 10.8 23.7 15.8 5.7 8.8 23.2 88.01 41.3n＝1567 ±2.3 ±3.8 ±2.9 ±0.89 ±1.5 ±4.3 ±2.61 ±6.8肺瘤 67.7 123.4 78.3 34 23 34 360.4 62.2n＝76 ±13.4 ±19.4 ±13.5 ±5.9 ±3.9 ±4.5 ±10.15 ±11.2(表2)
酶活性±标准偏差(U/L)测试组 5′-AMP 5′-CMP 5′-UMP 5′-GMP 5′-IMP 5′-TMP ∑5′-ND 碱性磷酸酶淋巴瘤+骨表现 9.2 10.8 8.2 5.4 3.3 9.8 45.8 167.6n＝23 ±2.3 ±1.7 ±1.1 ±0.9 ±0.2 ±1.8 ±1.33 ±23淋巴瘤+肝表现 89.7 189.7 102.6 45.8 34.9 34.6 497.3 56.7n＝76 ±19 ±23 ±31 ±12 ±8.9 ±4.6 ±16.41 ±11.2
根据表3的数据，对于患有验迄恶性瘤的治疗前患者和健康对照二者，可以在针对各种底物的5’-核苷酸酶活性值之间找到严格相关性，在5’-AMP上测量得到的活性与在β-甘油磷酸上测量得到的活性(它指示非特异磷酸酶活性)之间也存在严格相关性。
表3相关性配对 相关性5′-AMP 5′-CMP 0.99435′-AMP 5′-UMP 0.97285′-AMP 5′-GMP 0.92345′-AMP 5′-IMP 0.96565′-AMP 5′-TMP 0.98785′-CMP 5′-UMP 0.94565′-CMP 5′-GMP 0.96785′-CMP 5′-IMP 0.94895′-CMP 5′-TMP 0.89785′-UMP 5′-GMP 0.89895′-UMP 5′-IMP 0.93235′-UMP 5′-TMP 0.95625′-GMP 5′-IMP 0.89785′-GMP 5′-TMP 0.95455′-AMP β-甘油磷酸 0.8978
表4和5给出了为了对进行乳瘤切除术然后进行化疗的患者监测治疗而进行的测量的结果。表4概述了成功的病例的数据，而表5概述了耐受CMF疗法的病例的数据。表5还给出了改变治疗后获得的数据。在治疗改变中，对患者进行顺铂治疗，并在第一次治疗后第一天(*)和终止治疗后第一天(料)测量5’-核苷酸酶活性。在所有其它病例中，在现行化疗24小时后进行测量。出于比较目的，还给出了在健康对照上测量得到的数值。
表4
5’-核苷酸酶活性±标准偏差(U/L)
5′-AMP 5′-CMP 5′-UMP 5′-GMP 5′-IMP 5′-TMP 5′-ND健康对照 6.5 10.1 8.4 4.1 3.3 8.5 40.9
±1.2 ±2.2 ±1.6 ±1.1 ±0.9 ±1.6 ±1.43患病，CMF前 29.4 34.7 11.8 7.9 7.6 19.8 112.2
±3.7 ±7.8 ±3.4 ±1.8 ±1.1 ±3.7 ±3.51组CMF后 11.6 3.4 4.6 2.3 3.2 4.5 29.6
±2.1 ±0.9 ±1.2 ±0.8 ±0.9 ±1.4 ±1.23组CMF后 3.4 2.3 2.1 -2.4 -2.8 1.1 1.28
±1.1 ±0.9 ±0.9 ±0.1 ±0.8 ±0.03 ±0.636组CMF后 0.7 -1.7 2.2 -3.3 1.1 -3.4 -4.4
±0.04 ±0.3 ±0.7 ±0.8 ±0.1 ±0.7 ±0.44
根据上述数据可以得出以下结论：在5’-CMP、5’-GMP、5’-IMP和5’-TMP底物上测量得到的5’-核苷酸酶活性早在第一组CMF治疗后就显著降低。在第三组CMF治疗后，可以在以5’-AMP、5’-GMP和5’-IMP底物测量得到的5’-核苷酸酶活性中观察到相当大的降低。在第六组CMF治疗后，在以5’-AMP、5’-CMP、5’-GMP和5’-IMP底物测量得到的5’-核苷酸酶活性中出现显著降低。关于药物组合，由于各种成分的攻击点不同，因此难以确定在攻击点发挥的作用。因而，在这种情况中，与治疗前的状况进行比较可以作为指导。测量数据显示，所用药物组合通过对嘌呤和嘧啶代谢过程发挥影响而以两个阶段发挥其治疗作用。
表5
5’-核苷酸酶活性±标准偏差(U/L)
5′-AMP 5′-CMP 5′-UMP 5′-GMP 5′-IMP 5′-TMP ∑5’-ND健康对照 6.5 10.1 8.4 4.1 3.3 8.5 40.9
±1.2 ±2.2 ±1.6 ±1.1 ±0.9 ±1.6 ±1.43患病，CMF前 39.6 72.4 45.8 23.7 18.9 24.7 225.11
±8.67 ±11.3 ±10.9 ±7.8 ±3.5 ±6.2 ±8.051组CMF后 26.7 68.9 40.2 19.8 16.4 21.1 193.1
±5.3 ±10.2 ±9.9 ±6.9 ±4.6 ±5.2 ±7.01顺铂后(*) 20.3 43.2 26.5 4.2 2.3 8.9 115.4
±3.4 ±8.1 ±5.7 ±1.1 ±0.9 ±1.8 ±3.5顺铂后(**) 4.1 3.6 4.4 -1.6 1.1 1.2 12.8
±1.3 ±0.9 ±1.5 ±0.8 ±0.6 ±0.3 ±1.2
在无效的CMF治疗之后，未能在以各种底物测量得到的5’-核苷酸酶活性中观察到显著变化；因此用顺铂继续治疗。根据上述结果，我们观察到针对个别底物的5’-核苷酸酶活性的显著变化早在顺铂治疗的第一阶段就已经发生了(治疗后24小时；表中以*表示)；主要在参与嘌呤代谢的底物上能够观察到可观降低。在终止顺铂治疗后第一天测量得到的数值(表中以**表示)指示从时间上说嘌呤代谢的变化之后跟随着嘧啶代谢的变化，注意两种代谢过程的变化是叠加的。我们的测试早在诊断性肿瘤标记CA 15-3测量(它也指示无效)的5天前就已经揭示了CMF治疗的无效性，因而患者能够免去多余的5天CMF治疗。
成功且有效的治疗同样由在不同底物上测量得到的5’-核苷酸酶活性值之间的最初严格相关性发生变化的事实得到反映。下文表6列出了成功治疗后计算得到的相关值，还出于比较目的而给出了治疗前的数值。
表6
相关性相关性配对 化疗前 化疗后5′-AMP 5′-CMP 0.9856 0.67675′-AMP 5′-UMP 0.8997 0.45615′-AMP 5′-GMP 0.7845 0.32675′-AMP 5′-IMP 0.8967 0.45195′-AMP 5′-TMP 0.7897 0.46875′-CMP 5′-UMP 0.9897 0.56395′-CMP 5′-GMP 0.7868 0.23455′-CMP 5′-IMP 0.8887 0.26895′-CMP 5′-TMP 0.6767 0.11235′-UMP 5′-GMP 0.8978 0.34935′-UMP 5′-IMP 0.8889 0.05675′-UMP 5′-TMP 0.8992 0.36355′-GMP 5′-IMP 0.9981 0.46845′-GMP 5′-TMP 0.9767 0.47815′-IMP 5′-TMP 0.8898 0.4356
表6的数据显示了在不同底物上测量得到的5’-核苷酸酶活性之间的最初严格相关性停止了，这还反映了在不同底物上进行的测量使得我们能够分开检测并评估在治疗过程中进行的各种生物学过程。
当化疗对核苷酸代谢没有直接影响时，使用上述六种底物进行的5’-核苷酸酶活性测定同样为那些情况提供了不可替代的有用信息。这种情况的一个较好范例是骨肉瘤患者的氨甲蝶呤治疗。氨甲蝶呤是具有叶酸拮抗作用的物质，它对核苷酸代谢没有直接作用，因而氨甲蝶呤治疗后发生的每一种核苷酸代谢变化都指示从头核苷酸合成即健康细胞的损害。伴随治疗发生的任何损害总是具有严重后果；这种后果可能是例如细胞和体液免疫力降低，这还可能诱导次生肿瘤的形成。
表7概述了由用12.0g剂量的氨甲蝶呤进行治疗的骨肉瘤患者测量得到的5’-核苷酸酶活性变化。
根据表7的数据可以得出以下结论：在六种底物上进行的、用于检验嘧啶和嘌呤代谢变化的5’-核苷酸酶活性测定的结果显示，在第一阶段，治疗影响嘧啶代谢。两种代谢途径之间的差异在治疗后44小时特别突出。由表7的数据还可以看出，甚至在同一代谢途径中，也可以在各种底物之间观察到显著差异。这种现象毫无疑问是由于各种底物的生化功能之间的差异所致。在监测依照本发明方法的治疗后，有可能在检测的扰动将导致更严重变化即晚期后果之前就停止或改变治疗。
表7
5’-核苷酸酶活性(U/L)时间 嘧啶代谢 嘌呤代谢
5′-AMP 5′-CMP 5′-UMP 5′-GMP 5′-IMP 5′-TMP0分钟 -8.39 5.33 5.05 3.34 3.77 1.565分钟 -3.12 2.21 0.14 0.57 -0.2 -6.7530分钟 -11.87 -2.19 1.92 -2.19 2.98 -6.891小时 -5.05 2.41 1.2 -2.1 1.34 -1.012小时 -4.84 5.97 2.77 2.84 -3.49 -2.493小时 -0.5 8.6 4.05 7.61 5.68 2.414小时 -3.63 6.76 4.19 0.92 -0.28 -3.986小时 -10.32 -1.63 -1.85 -5.48 -2.7 -3.712小时 -1.71 -0.15 1.48 1.98 3.69 -4.4921小时 -2.56 6.04 5.83 -0.99 0.35 -4.8444小时 31.38 4.69 7.89 1.99 -12.95 -9.4669小时 7.96 18.42 14.93 13.16 13.01 8.690小时 6.83 13.09 15.16 3.49 10.1 3.63162小时 -12.6 6.97 29.53 -6.33 -1.99 -1.35186小时 1.41 7.53 12.16 14.94 6.54 0.35210小时 5.76 4.48 7.39 3.91 -3.91 0.92234小时 8.61 3.48 10.88 8.68 5.47 6.11258小时 3.99 2.42 2.64 0.22 0.43 -5.82330小时 9.25 7.47 2.99 8.46 10.53 -2.7358小时 9.67 5.47 4.9 5.97 -2.28 2.56402小时 5.18 8.03 9.59 8.24 6.04 5.4
尽管上文已经联系诊断用途而描述了依照本发明的方法和试剂盒，然而本发明的范围不限于这种用途。本发明的方法和试剂盒还可用于研究目的而具有极好结果，例如用于检测某些恶性过程的机制、测试已知或新型抗癌剂和检验它们的作用机制。
Claims (7)
1.用于测定5’-核苷酸酶活性的方法，其中以本身已知的方式、在本身已知的条件下将生物学样品与作为底物的核苷酸戊糖单磷酸一起保温，用钼酸铵和还原剂处理释放的无机磷酸而将其转变成有色复合物，通过已知方法测量颜色强度，并使用已知计算方法和/或借助校准曲线，由测量值计算5’-核苷酸酶活性或单位时间内释放的无机磷酸的量，该数值与5’-核苷酸酶活性成正比，其特征为使用核苷酸戊糖单磷酸5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5’-IMP和5’-TMP，并在所有这六种底物上进行测量。
2.权利要求1中所要求的方法，特征为将生物学样品与底物在任选存在抑制剂时在缓冲介质中一起保温，然后除了钼酸铵和还原剂还向保温的混合液中添加蛋白质增溶剂和稳定剂。
3.权利要求1或2中所要求的方法，特征为以1-10mM浓度水溶液的形式使用所述核苷酸戊糖单磷酸底物。
4.权利要求1-3之任一中所要求的方法，特征为将全血、血清或血溶物用作生物学样品，并且在存在和不存在碱性磷酸酶抑制剂的条件下与底物一起进行保温。
5.用于进行权利要求1-4之任一所要求的方法的试剂盒，它包含5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5’-IMP和5’-TMP作为底物，以及可用于通过形成无机磷酸、将生成的磷酸转变成有色复合物、并通过光度法测量颜色强度而测定5’-核苷酸酶活性的试剂盒的常规成分。
6.权利要求5中所要求的试剂盒，它包含缓冲剂、蛋白质增溶剂、稳定剂、显色剂、磷标准作为常规成分，任选的抑制剂和/或除了核苷酸戊糖单磷酸以外的其它底物。
7.权利要求1-4之任一中所要求的方法或权利要求5或6中所要求的试剂盒用于诊断是否存在恶性过程和/或监测恶性过程治疗中所采用疗法的效果的用途。
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