JP3073667B2 - 脳卒中の新規マーカー - Google Patents
脳卒中の新規マーカーInfo
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Description
テムに関するものである。
lyceric acid mutase)(PGAMということもある:E
C5.4.2.1)は、解糖系酵素の一つで、2,3−
ビスホスホグリセリン酸(2,3-bisphosphoglycerate:G
lycerate-2,3-P2)の存在下、2−ホスホグリセリン酸
(2-phosphoglycerate:Glycerate-2-P)と3−ホスホ
グリセリン酸(3-phosphoglycerate:Glycerate-3-P)
の相互交換を触媒する。
が二つ存在する。Mサブユニット(分子量約3万)の遺
伝子は成人の骨格筋、心筋で発現され、これらの組織で
はMMホモダイマー(M型PGAM、M−PGAM、P
GAM−MM、PGAM−M又はM型アイソザイムとも
いう)が存在する。Bサブユニット(分子量約3万)の
遺伝子は成人の脳、肝、腎および赤血球で発現され、こ
れらの組織ではBBホモダイマー(B型PGAM、B−
PGAM、PGAM−BB、PGAM−B又はB型アイ
ソザイムともいう)が存在する。従って、M型PGAM
は筋肉特異的アイソザイムに、またB型PGAMは非筋
肉型あるいは脳型アイソザイムに分類される。Mおよび
Bの両サブユニットの遺伝子は心筋で特異的に発現され
ており、この組織ではB型およびM型PGAMに加えて
MBヘテロダイマー(MB型PGAM、MB−PGA
M、PGAM−MB又はMB型アイソザイムともいう)
も存在する。
量できるisoelectric focusingを使って、正常血漿中の
PGAM活性が専らB型アイソザイムに由来することを
示した。また、Markertは正常ヒト胎児および成人の脳
では、主にPGAMのB型アイソザイムが存在するが、
脳腫瘍組織ではMB型およびM型アイソザイムが認めら
れ、発現レベルが腫瘍の悪性度と相関すること、それに
対して筋肉特異的酵素であるクレアチンキナーゼ(Crea
tine kinase:CK)ではそのような変化は認めらないこと
を示した。しかし、これまで、血清中のPGAMアイソ
ザイムの変動と各種病態との関連はほとんど調べられて
いない。また、脳疾患に関するマーカーもほとんど知ら
れていない。
期診断が不可欠であるが、特に脳卒中等脳疾患において
は、早期にこれを発見し、正確に診断することが強く求
められている。
中の迅速且つ正確な診断システムの新規開発が急務であ
るという当業界の要望に応える目的でなされたものであ
り、更に詳細には、上記した技術背景に鑑み、本発明
は、血清中のPGAMアイソザイム活性、特に脳に特異
的に局在するB型アイソザイムを簡便に測定する方法を
開発し、脳卒中の新規マーカーとしてPGAMアイソザ
イムが有用であることを明らかにする目的でなされたも
のである。
れたものであって、各方面から研究した結果、次のよう
な方法を用いることにより、PGAMのB型アイソザイ
ムが脳卒中の新規マーカーとして有用であることをはじ
めて明らかにした。また、血液サンプル中のB型アイソ
ザイムを直接測定できる方法の開発にも成功し、脳卒中
の診断、測定のための総合システムを完成するに至っ
た。以下、本発明を詳しく説明する。
ンプルをPGAM阻害剤によって処理し、特定のアイソ
ザイムを失活せしめた後、残存のPGAM活性を測定す
ることからなるものである。例えばPGAM阻害剤とし
て四チオン酸を用いた場合、M型アイソザイムはほぼ1
00%失活し、MB型は約50%失活し、B型はほとん
ど失活しない。したがって、血清に四チオン酸を添加し
てM型アイソザイムを失活させた後、残存のPGAM活
性を測定することにより、B型アイソザイムを分別定量
することができるものである。
た阻害実験によれば、四チオン酸処理によってMB型は
50%しか失活せず、50%は活性が残存するが、現実
において、正常血清及び脳組織のPGAM活性のほとん
どは、B型アイソザイムによるものであるので、MB型
アイソザイムの残存活性は、生体サンプルにおける脳卒
中を診断する場合においては、これを無視することがで
き、ここにきわめて簡便にして現実的な測定が単なる理
論を越えてはじめて可能となったのである。
薬等PGAM又はそのアイソザイムの活性を選択的に阻
害しうる物質がすべて使用できる。その非限定例として
は、ポリチオン酸及び/又はその誘導体が挙げられる。
ポリチオン酸は、三〜六チオン酸がいずれも使用可能で
あって、その誘導体としてはカリウム塩、ナトリウム塩
等が使用可能であり、好適例のひとつとして、四チオン
酸カリウムが例示される。
料に四チオン酸カリウム等の阻害剤を作用させてPGA
M−Mを失活させ(PGAM−MBの活性は上記したよ
うに本生体測定系においては無視できる)、残存のPG
AM−Bを測定試薬を用いて測定するものである。
に、M型PGAMアイソザイムの阻害剤である四チオン
酸カリウムを用いてM型アイソザイムを失活せしめた
後、次のようにして活性測定を行うことからなるもので
ある。すなわち、2,3−ビスホスホグリセリン酸(Gl
ycerate-2,3-P2)の存在下、PGAM−Bによって、3
−ホスホグリセリン酸(Glycerate-3-P)を2−ホスホ
グリセリン酸(Glycerate-2-P)とし、これをエノラー
ゼによりPEPとH2Oとする。次いでPEPを、AD
Pの存在下ピルビン酸キナーゼ(PK)によりピルビン
酸(Pyruvate)とATPとにし、得られたピルビン酸
に、NADHの存在下、乳酸デヒドロゲナーゼ(LD
H)を作用させ、NADHの減少をレートアッセイ(ra
te assay)するものである。
容易に測定することができ、PGAM−Bが正確に且つ
迅速に測定できる。しかも後記する実施例からも明らか
なように、脳卒中患者由来の血清サンプル中のPGAM
−B値はきわめて高く、そのうえ発作2時間以内という
きわめて短時間にB型活性の高値が認められた。したが
って、PGAM−Bの測定は、脳卒中の診断にきわめて
有効であることが判明し、PGAM−Bは脳卒中のマー
カーとしてきわめて好適であることも実証された。PG
AM−Bが脳卒中のマーカーとして使用できることは従
来全く知られておらず、PGAM−Bは脳卒中の新規マ
ーカーと認められる。
ン酸キナーゼ(PK)、NADH、乳酸デヒドロゲナー
ゼ(LDH)、PGAM阻害剤(四チオン酸カリウム)
を含有し、更に必要に応じて基質、緩衝液を含有したP
GAM−B測定試薬を提供することができ、これは脳卒
中診断剤として利用することができる。本試薬は、後記
実施例に例示したように、試薬1及び試薬2としてキッ
トとして市販することも可能である。
が、正確性はPGAM−Bよりも多少低下するものの、
全PGAM(単にPGAM又はT−PGAMということ
もある)も、B型アイソザイムと同じ行動を示し、脳卒
中患者由来の血清サンプル中できわめて高い値を示し、
しかも発作2時間以内にそれが認められた。したがっ
て、T−PGAMも脳卒中の新規マーカーとして非常に
有用である。
しないだけで、他はB型アイソザイムの場合と全く同一
であって(その測定原理も、表1に示した測定原理の
内、阻害剤を使用する(1)を除き、そして(2)のP
GAM−BをT−PGAMに代えた点を除き、全く同一
である)、NADHの減少をレートアッセイ法で測定す
ればよく、B型アイソザイムの場合と同様に、T−PG
AMの測定も脳卒中の診断に利用することができる。T
−PGAMの測定精度は必らずしもB型アイソザイムの
測定精度ほど高くはないが、阻害剤を使用することなく
測定することができるので、この方法も脳卒中の診断に
おいて有効性が高いものである。
いても、阻害剤を使用する点を除き、B型アイソザイム
の場合と全く同一であり、上記した理由と同じ理由によ
り、これ(ら)も脳卒中診断剤としてきわめて有効に利
用することができる。
GAM−Mに対する影響を自動分析法によって検討し
た。試料としては、B型及びM型の標準品(いずれもプ
ール血清ベース)を用い、生理食塩水で希釈して1/1
〜1/8のサンプルを用意した。これらのサンプルに各
種濃度の四チオン酸カリウムを添加し、5分間反応させ
た後、B型及びM型PGAM量を自動分析法を利用して
測定した。
てPGAM−B、PGAM−M量をそれぞれ測定し、下
記表2の結果を得た。その結果から明らかなように、四
チオン酸カリウムによってM型アイソザイムのみが特異
的に失活し、B型アイソザイムは全く影響されないこと
が判った。
卒中患者由来の血清試料(発作2時間以内、6〜12時
間後、1〜3日後)について、M型PGAMアイソザイ
ム阻害剤として四チオン酸カリウムを用いて、PGAM
活性の測定を行った。
1(R−1)、四チオン酸カリウム液、試薬2(R−
2)を用いた。
5mM(最終濃度1.9mM)となるように四チオン酸
カリウム(分子量302.4)を添加溶解し(R−1試
薬22mlに四チオン酸カリウムを15mg溶解)、M
型を失活させ、B型PGAM活性測定試薬を調製した。
添加溶解した液250μlと、血清サンプル5μlを混
合し、5分間放置した。その間に血清サンプル中のM型
(及びMB型)PGAMが失活、阻害されるので、以
下、試薬2(R−2)を用いてB型PGAMの活性を測
定した。
リン酸(基質)が含まれているので、試薬2を41μl
添加することによって反応を開始せしめた(基質スター
ト)。試薬2の添加から約1.5分後に測定を開始し
た。
い、アッセイコードをRATE−A:32−39、測定
温度を37℃に設定し、約1.5分NADHの減少によ
る吸光度A340nmの減少を測定した。なお、副波長
は405nmで測定を行った。
℃で1分当りに1μmolのNADHを減少させる酵素
量と定義した。実際の測定値は、レートアッセイ値に検
量係数(K FACTOR)を乗じて求めた。得られた
結果を図1に示した。
発症後2時間以内にB−PGAM活性値が特異的に高い
ことが示され、B−PGAMが脳卒中の好適なマーカー
であることが実証された。
試薬2のみを用いて、上記3種類の血清サンプルについ
てPGAM(阻害剤は使用しないため、全PGAMを測
定することとなる)の測定を、上記実施例と同様に行っ
たところ、B−PGAMと全く同様の測定傾向が得ら
れ、T−PGAMもB−PGAMと同様にすぐれた脳卒
中のマーカーであることが実証された。
用することによって、B型アイソザイムを迅速且つ正確
に測定することが可能となった。しかもPGAM−Bは
脳卒中の好適なマーカーであることも実証され、本発明
に係る測定方法によれば脳卒中の迅速、的確な診断が可
能となった。また、PGAM−Bの場合よりも多少正確
性は劣るものの、T−PGAMも脳卒中の新規マーカー
として有用であることも明らかにされた。
す。
Claims (7)
- 【請求項1】 ホスホグリセリン酸ムターゼ(PGA
M)又はそのB型アイソザイム測定試薬からなる脳卒中
測定試薬。 - 【請求項2】 PGAM測定試薬が、エノラーゼ、ピル
ビン酸キナーゼ、NADH、及び、乳酸デヒドロゲナー
ゼを含有するものであること、を特徴とする請求項1に
記載の測定試薬。 - 【請求項3】 B型アイソザイム測定試薬がPGAMの
M型アイソザイム阻害剤を含有すること、を特徴とする
請求項1に記載の測定試薬。 - 【請求項4】 PGAMのM型アイソザイム阻害剤が四
チオン酸のカリウム塩及び/又はナトリウム塩であるこ
と、を特徴とする請求項3に記載の測定試薬。 - 【請求項5】 請求項1又は2に記載の測定試薬を用い
て試料中のPGAMをレートアッセイ法によって測定す
ること、を特徴とする脳卒中患者由来のPGAMの測定
方法。 - 【請求項6】 PGAMのM型アイソザイム阻害剤を用
いて試料を処理した後、PGAMアイソザイムをレート
アッセイ法によって測定すること、を特徴とする脳卒中
患者由来のB型PGAMの測定方法。 - 【請求項7】 PGAM又はそのB型アイソザイムから
なる脳卒中マーカー。
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