JPH11225795A - 細胞障害マーカー - Google Patents
細胞障害マーカーInfo
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- JPH11225795A JPH11225795A JP10046349A JP4634998A JPH11225795A JP H11225795 A JPH11225795 A JP H11225795A JP 10046349 A JP10046349 A JP 10046349A JP 4634998 A JP4634998 A JP 4634998A JP H11225795 A JPH11225795 A JP H11225795A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ＮＡ
ＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼを含有する試薬を用いて、
細胞培養液中のホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡ
Ｍ）濃度を測定する。 【効果】 各種細胞の障害マーカー及び／又は細胞毒性
マーカーとして有用である。
ＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼを含有する試薬を用いて、
細胞培養液中のホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡ
Ｍ）濃度を測定する。 【効果】 各種細胞の障害マーカー及び／又は細胞毒性
マーカーとして有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞障害及び／又
は細胞毒性の測定システムに関するものであって、例え
ば虚血障害等による細胞障害の判断や測定に利用するこ
とができる。
は細胞毒性の測定システムに関するものであって、例え
ば虚血障害等による細胞障害の判断や測定に利用するこ
とができる。
【０００２】
【従来の技術】ホスホグリセリン酸ムターゼ（Phosphog
lyceric acid mutase）（ＰＧＡＭということもある：
ＥＣ５．４．２．１）は、解糖系酵素の一つで、２，３
−ビスホスホグリセリン酸（2,3-bisphosphoglycerate
: Glycerate-2,3-P2）の存在下、２−ホスホグリセリ
ン酸（2-phosphoglycerate : Glycerate-2-P）と３−ホ
スホグリセリン酸（3-phosphoglycerate : Glycerate-3
-P）の相互交換を触媒する。
lyceric acid mutase）（ＰＧＡＭということもある：
ＥＣ５．４．２．１）は、解糖系酵素の一つで、２，３
−ビスホスホグリセリン酸（2,3-bisphosphoglycerate
: Glycerate-2,3-P2）の存在下、２−ホスホグリセリ
ン酸（2-phosphoglycerate : Glycerate-2-P）と３−ホ
スホグリセリン酸（3-phosphoglycerate : Glycerate-3
-P）の相互交換を触媒する。
【０００３】哺乳動物にはＰＧＡＭをコードする遺伝子
が二つ存在する。Ｍサブユニット（分子量約３万）の遺
伝子は成人の骨格筋、心筋で発現され、これらの組織で
はＭＭホモダイマー（Ｍ型ＰＧＡＭ、Ｍ−ＰＧＡＭ、Ｐ
ＧＡＭ−ＭＭ、ＰＧＡＭ−Ｍ又はＭ型アイソザイムとも
いう）が存在する。Ｂサブユニット（分子量約３万）の
遺伝子は成人の脳、肝、腎および赤血球で発現され、こ
れらの組織ではＢＢホモダイマー（Ｂ型ＰＧＡＭ、Ｂ−
ＰＧＡＭ、ＰＧＡＭ−ＢＢ、ＰＧＡＭ−Ｂ又はＢ型アイ
ソザイムともいう）が存在する。従って、Ｍ型ＰＧＡＭ
は筋肉特異的アイソザイムに、またＢ型ＰＧＡＭは非筋
肉型あるいは脳型アイソザイムに分類される。Ｍおよび
Ｂの両サブユニットの遺伝子は心筋で特異的に発現され
ており、この組織ではＢ型およびＭ型ＰＧＡＭに加えて
ＭＢヘテロダイマー（ＭＢ型ＰＧＡＭ、ＭＢ−ＰＧＡ
Ｍ、ＰＧＡＭ−ＭＢ又はＭＢ型アイソザイムともいう）
も存在する。
が二つ存在する。Ｍサブユニット（分子量約３万）の遺
伝子は成人の骨格筋、心筋で発現され、これらの組織で
はＭＭホモダイマー（Ｍ型ＰＧＡＭ、Ｍ−ＰＧＡＭ、Ｐ
ＧＡＭ−ＭＭ、ＰＧＡＭ−Ｍ又はＭ型アイソザイムとも
いう）が存在する。Ｂサブユニット（分子量約３万）の
遺伝子は成人の脳、肝、腎および赤血球で発現され、こ
れらの組織ではＢＢホモダイマー（Ｂ型ＰＧＡＭ、Ｂ−
ＰＧＡＭ、ＰＧＡＭ−ＢＢ、ＰＧＡＭ−Ｂ又はＢ型アイ
ソザイムともいう）が存在する。従って、Ｍ型ＰＧＡＭ
は筋肉特異的アイソザイムに、またＢ型ＰＧＡＭは非筋
肉型あるいは脳型アイソザイムに分類される。Ｍおよび
Ｂの両サブユニットの遺伝子は心筋で特異的に発現され
ており、この組織ではＢ型およびＭ型ＰＧＡＭに加えて
ＭＢヘテロダイマー（ＭＢ型ＰＧＡＭ、ＭＢ−ＰＧＡ
Ｍ、ＰＧＡＭ−ＭＢ又はＭＢ型アイソザイムともいう）
も存在する。
【０００４】YatesらはＰＧＡＭアイソザイムを分別定
量できるisoelectric focusingを使って、正常血漿中の
ＰＧＡＭ活性が専らＢ型アイソザイムに由来することを
示した。また、Markertは正常ヒト胎児および成人の脳
では、主にＰＧＡＭのＢ型アイソザイムが存在するが、
脳腫瘍組織ではＭＢ型およびＭ型アイソザイムが認めら
れ、発現レベルが腫瘍の悪性度と相関すること、それに
対して筋肉特異的酵素であるクレアチンキナーゼ（Crea
tine kinase:CK）ではそのような変化は認められないこ
とを示した。しかし、これまで、ＰＧＡＭやそのアイソ
ザイムの利用についてはあまり研究が進行しておらず、
本発明者らが先に特許出願したＢ型ＰＧＡＭの脳卒中マ
ーカー（血清試料）としての利用が報告されている程度
である（特開平８−３２２５９５）。また、本発明のよ
うに細胞レベルにおける酸素量とＰＧＡＭとの関連につ
いての報告もなく、ましてや細胞障害や細胞毒性マーカ
ーとしての利用に至っては全く何も知られていない。
量できるisoelectric focusingを使って、正常血漿中の
ＰＧＡＭ活性が専らＢ型アイソザイムに由来することを
示した。また、Markertは正常ヒト胎児および成人の脳
では、主にＰＧＡＭのＢ型アイソザイムが存在するが、
脳腫瘍組織ではＭＢ型およびＭ型アイソザイムが認めら
れ、発現レベルが腫瘍の悪性度と相関すること、それに
対して筋肉特異的酵素であるクレアチンキナーゼ（Crea
tine kinase:CK）ではそのような変化は認められないこ
とを示した。しかし、これまで、ＰＧＡＭやそのアイソ
ザイムの利用についてはあまり研究が進行しておらず、
本発明者らが先に特許出願したＢ型ＰＧＡＭの脳卒中マ
ーカー（血清試料）としての利用が報告されている程度
である（特開平８−３２２５９５）。また、本発明のよ
うに細胞レベルにおける酸素量とＰＧＡＭとの関連につ
いての報告もなく、ましてや細胞障害や細胞毒性マーカ
ーとしての利用に至っては全く何も知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】虚血等低酸素状態にな
ったり、ｐＨや温度等の各種条件の変化によっても細胞
障害がひき起こされることが知られており、細胞障害や
細胞毒性を正確且つ迅速に測定するシステムの開発が強
く求められている。
ったり、ｐＨや温度等の各種条件の変化によっても細胞
障害がひき起こされることが知られており、細胞障害や
細胞毒性を正確且つ迅速に測定するシステムの開発が強
く求められている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記した当業
界の要望に応える目的でなされたものであって、各方面
から研究の結果、低酸素状態では細胞培養液中のＰＧＡ
Ｍ値が上昇することをはじめて見出し、また、そのＰＧ
ＡＭの測定にあたり、全ＰＧＡＭの測定のほか、そのア
イソザイムの測定によっても低酸素状態の測定が可能で
あって細胞の傷害度が判るだけでなく、各種条件の変化
による細胞の障害度が判るという新規にして有用な知見
を得、更に研究を行い、遂に完成されたものである。
界の要望に応える目的でなされたものであって、各方面
から研究の結果、低酸素状態では細胞培養液中のＰＧＡ
Ｍ値が上昇することをはじめて見出し、また、そのＰＧ
ＡＭの測定にあたり、全ＰＧＡＭの測定のほか、そのア
イソザイムの測定によっても低酸素状態の測定が可能で
あって細胞の傷害度が判るだけでなく、各種条件の変化
による細胞の障害度が判るという新規にして有用な知見
を得、更に研究を行い、遂に完成されたものである。
【０００７】すなわち、本発明者らは、ＰＧＡＭ（全Ｐ
ＧＡＭ、Ｂ型ＰＧＡＭ、Ｍ型ＰＧＡＭ）が細胞の傷害マ
ーカーや細胞の毒性マーカーとして有用であることをは
じめて明らかにしただけでなく、細胞や細胞培養液中の
ＰＧＡＭを測定することによって細胞の低酸素状態やそ
の他の条件の変化やそれによる傷害の程度を判定するこ
とができ、更に、ＰＧＡＭ、そのアイソザイムの測定方
法として、本発明者らが先に開発した方法（特開平８−
３２２５９５）が適用可能なことも確認して、本発明の
完成に至ったものである。
ＧＡＭ、Ｂ型ＰＧＡＭ、Ｍ型ＰＧＡＭ）が細胞の傷害マ
ーカーや細胞の毒性マーカーとして有用であることをは
じめて明らかにしただけでなく、細胞や細胞培養液中の
ＰＧＡＭを測定することによって細胞の低酸素状態やそ
の他の条件の変化やそれによる傷害の程度を判定するこ
とができ、更に、ＰＧＡＭ、そのアイソザイムの測定方
法として、本発明者らが先に開発した方法（特開平８−
３２２５９５）が適用可能なことも確認して、本発明の
完成に至ったものである。
【０００８】以下、本発明を詳しく説明するが、本発明
において、酸素、ｐＨ、温度、各種薬物等の各因子の変
化によって細胞が障害を受ける場合、これらの因子を細
胞毒性と総称する。したがって、細胞障害マーカーは間
接的に細胞毒性マーカーとなるものであって、両者は表
裏一体をなすものである。なお、本発明において、酸素
とは大気中の酸素含量未満〜無酸素の状態を指すもので
ある。
において、酸素、ｐＨ、温度、各種薬物等の各因子の変
化によって細胞が障害を受ける場合、これらの因子を細
胞毒性と総称する。したがって、細胞障害マーカーは間
接的に細胞毒性マーカーとなるものであって、両者は表
裏一体をなすものである。なお、本発明において、酸素
とは大気中の酸素含量未満〜無酸素の状態を指すもので
ある。
【０００９】本発明に係るＰＧＡＭの測定方法を、先
ず、Ｂ型アイソザイムについて述べる。Ｂ型ＰＧＡＭを
測定する方法は、サンプルをＰＧＡＭ阻害剤によって処
理し、特定のアイソザイムを失活せしめた後、残存のＰ
ＧＡＭ活性を測定することからなるものである。例えば
ＰＧＡＭ阻害剤として四チオン酸を用いた場合、Ｍ型ア
イソザイムはほぼ１００％失活し、ＭＢ型は約５０％失
活し、Ｂ型はほとんど失活しない。したがって、血清に
四チオン酸を添加してＭ型アイソザイムを失活させた
後、残存のＰＧＡＭ活性を測定することにより、Ｂ型ア
イソザイムを分別定量することができるのである。
ず、Ｂ型アイソザイムについて述べる。Ｂ型ＰＧＡＭを
測定する方法は、サンプルをＰＧＡＭ阻害剤によって処
理し、特定のアイソザイムを失活せしめた後、残存のＰ
ＧＡＭ活性を測定することからなるものである。例えば
ＰＧＡＭ阻害剤として四チオン酸を用いた場合、Ｍ型ア
イソザイムはほぼ１００％失活し、ＭＢ型は約５０％失
活し、Ｂ型はほとんど失活しない。したがって、血清に
四チオン酸を添加してＭ型アイソザイムを失活させた
後、残存のＰＧＡＭ活性を測定することにより、Ｂ型ア
イソザイムを分別定量することができるのである。
【００１０】なお、ＰＧＡＭの精製アイソザイムを用い
た阻害実験によれば、四チオン酸処理によってＭＢ型は
５０％しか失活せず、５０％は活性が残存するが、現実
において、正常血清及び脳組織のＰＧＡＭ活性のほとん
どは、Ｂ型アイソザイムによるものであるので、ＭＢ型
アイソザイムの残存活性は、生体サンプルにおいては、
これを無視することができる。
た阻害実験によれば、四チオン酸処理によってＭＢ型は
５０％しか失活せず、５０％は活性が残存するが、現実
において、正常血清及び脳組織のＰＧＡＭ活性のほとん
どは、Ｂ型アイソザイムによるものであるので、ＭＢ型
アイソザイムの残存活性は、生体サンプルにおいては、
これを無視することができる。
【００１１】ＰＧＡＭ阻害剤としては、酸化剤、ＳＨ試
薬等ＰＧＡＭ又はそのアイソザイムの活性を選択的に阻
害しうる物質がすべて使用できる。その非限定例として
は、ポリチオン酸及び／又はその誘導体が挙げられる。
ポリチオン酸は、三〜六チオン酸がいずれも使用可能で
あって、その誘導体としてはカリウム塩、ナトリウム塩
等が使用可能であり、好適例のひとつとして、四チオン
酸カリウムが例示される。
薬等ＰＧＡＭ又はそのアイソザイムの活性を選択的に阻
害しうる物質がすべて使用できる。その非限定例として
は、ポリチオン酸及び／又はその誘導体が挙げられる。
ポリチオン酸は、三〜六チオン酸がいずれも使用可能で
あって、その誘導体としてはカリウム塩、ナトリウム塩
等が使用可能であり、好適例のひとつとして、四チオン
酸カリウムが例示される。
【００１２】本発明に係る測定方法は、試料に四チオン
酸カリウム等の阻害剤を作用させてＰＧＡＭ−Ｍを失活
させ（ＰＧＡＭ−ＭＢの活性は上記したように本生体測
定系においては無視できる）、残存のＰＧＡＭ−Ｂを測
定試薬を用いて測定するものである。
酸カリウム等の阻害剤を作用させてＰＧＡＭ−Ｍを失活
させ（ＰＧＡＭ−ＭＢの活性は上記したように本生体測
定系においては無視できる）、残存のＰＧＡＭ−Ｂを測
定試薬を用いて測定するものである。
【００１３】その測定原理は、下記表１に記載したよう
に、Ｍ型ＰＧＡＭアイソザイムの阻害剤である四チオン
酸カリウムを用いてＭ型アイソザイムを失活せしめた
後、次のようにして活性測定を行うことからなるもので
ある。すなわち、２，３−ビスホスホグリセリン酸（Gl
ycerate-2,3-P2）の存在下、ＰＧＡＭ−Ｂによって、３
−ホスホグリセリン酸（Glycerate-3-P）を２−ホスホ
グリセリン酸（Glycerate-2-P）とし、これをエノラー
ゼによりＰＥＰとＨ2Ｏとする。次いでＰＥＰを、ＡＤ
Ｐの存在下ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）によりピルビン
酸（Pyruvate）とＡＴＰとにし、得られたピルビン酸
に、ＮＡＤＨの存在下、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ
Ｈ）を作用させ、ＮＡＤＨの減少をレートアッセイ（ra
te assay）するものである。
に、Ｍ型ＰＧＡＭアイソザイムの阻害剤である四チオン
酸カリウムを用いてＭ型アイソザイムを失活せしめた
後、次のようにして活性測定を行うことからなるもので
ある。すなわち、２，３−ビスホスホグリセリン酸（Gl
ycerate-2,3-P2）の存在下、ＰＧＡＭ−Ｂによって、３
−ホスホグリセリン酸（Glycerate-3-P）を２−ホスホ
グリセリン酸（Glycerate-2-P）とし、これをエノラー
ゼによりＰＥＰとＨ2Ｏとする。次いでＰＥＰを、ＡＤ
Ｐの存在下ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）によりピルビン
酸（Pyruvate）とＡＴＰとにし、得られたピルビン酸
に、ＮＡＤＨの存在下、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ
Ｈ）を作用させ、ＮＡＤＨの減少をレートアッセイ（ra
te assay）するものである。
【００１４】
【表１】
【００１５】ＮＡＤＨの減少は市販の測定機器によって
容易に測定することができ、ＰＧＡＭ−Ｂが正確に且つ
迅速に測定できる（全ＰＧＡＭも同様である）。しかも
後述する実施例からも明らかなように、細胞培養液サン
プル中のＰＧＡＭ値は、高酸素よりも低酸素状態で培養
した細胞の培養液の方が高く、しかもこの現象は各種細
胞において広範に認められ且つそれぞれの細胞において
測定しやすいＰＧＡＭ（全ＰＧＡＭ、Ｂ型ＰＧＡＭ、Ｍ
型ＰＧＡＭ又は他のアイソザイム）を選んでその値を測
定すればよいことから、ＰＧＡＭの測定によって細胞の
低酸素状態（虚血性等）の測定が可能であることが判明
し、ＰＧＡＭは細胞障害マーカー、特に、虚血障害ない
し低酸素障害を受けた細胞の障害マーカーとしてきわめ
て好適であることも実証された。このようなことは従来
全く知られておらず、ＰＧＡＭは新規な細胞障害マーカ
ーと認められる。また、本発明によれば、低酸素以外の
各種細胞毒性に起因する細胞障害も測定できるので、極
めて広範な細胞障害マーカーとして利用できるし、この
マーカーは、換言すれば、細胞毒性マーカーとしても利
用できる。
容易に測定することができ、ＰＧＡＭ−Ｂが正確に且つ
迅速に測定できる（全ＰＧＡＭも同様である）。しかも
後述する実施例からも明らかなように、細胞培養液サン
プル中のＰＧＡＭ値は、高酸素よりも低酸素状態で培養
した細胞の培養液の方が高く、しかもこの現象は各種細
胞において広範に認められ且つそれぞれの細胞において
測定しやすいＰＧＡＭ（全ＰＧＡＭ、Ｂ型ＰＧＡＭ、Ｍ
型ＰＧＡＭ又は他のアイソザイム）を選んでその値を測
定すればよいことから、ＰＧＡＭの測定によって細胞の
低酸素状態（虚血性等）の測定が可能であることが判明
し、ＰＧＡＭは細胞障害マーカー、特に、虚血障害ない
し低酸素障害を受けた細胞の障害マーカーとしてきわめ
て好適であることも実証された。このようなことは従来
全く知られておらず、ＰＧＡＭは新規な細胞障害マーカ
ーと認められる。また、本発明によれば、低酸素以外の
各種細胞毒性に起因する細胞障害も測定できるので、極
めて広範な細胞障害マーカーとして利用できるし、この
マーカーは、換言すれば、細胞毒性マーカーとしても利
用できる。
【００１６】また、本発明によれば、エノラーゼ、ピル
ビン酸キナーゼ（ＰＫ）、ＮＡＤＨ、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＬＤＨ）、ＰＧＡＭ阻害剤（四チオン酸カリウム
等：ＰＧＡＭ−Ｂ測定の場合のみ）を含有し、更に必要
に応じて、基質、緩衝液を含有したＰＧＡＭ−Ｂ測定試
薬を提供することができ、これは低酸素状態測定用試薬
として利用できるだけでなく、低酸素以外の各種細胞毒
性測定用試薬として利用することもできる。本試薬は、
後記実施例に例示したように試薬１及び試薬２としてキ
ットとして市販することも可能である。
ビン酸キナーゼ（ＰＫ）、ＮＡＤＨ、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＬＤＨ）、ＰＧＡＭ阻害剤（四チオン酸カリウム
等：ＰＧＡＭ−Ｂ測定の場合のみ）を含有し、更に必要
に応じて、基質、緩衝液を含有したＰＧＡＭ−Ｂ測定試
薬を提供することができ、これは低酸素状態測定用試薬
として利用できるだけでなく、低酸素以外の各種細胞毒
性測定用試薬として利用することもできる。本試薬は、
後記実施例に例示したように試薬１及び試薬２としてキ
ットとして市販することも可能である。
【００１７】以上、ＰＧＡＭ−Ｂの測定について述べた
が、全ＰＧＡＭ（単にＰＧＡＭ又はＴ−ＰＧＡＭという
こともある）も、Ｂ型アイソザイムと同じ行動を示し、
Ｔ−ＰＧＡＭやＰＧＡＭ−ＭもＰＧＡＭ−Ｂと全く同様
に低酸素状態の測定や、その他細胞に害作用を与える物
理的、化学的、生物的要因の測定（つまり細胞毒性の測
定）や、細胞障害及び／又は細胞毒性マーカーに利用す
ることができる。
が、全ＰＧＡＭ（単にＰＧＡＭ又はＴ−ＰＧＡＭという
こともある）も、Ｂ型アイソザイムと同じ行動を示し、
Ｔ−ＰＧＡＭやＰＧＡＭ−ＭもＰＧＡＭ−Ｂと全く同様
に低酸素状態の測定や、その他細胞に害作用を与える物
理的、化学的、生物的要因の測定（つまり細胞毒性の測
定）や、細胞障害及び／又は細胞毒性マーカーに利用す
ることができる。
【００１８】Ｔ−ＰＧＡＭの測定方法も、阻害剤を使用
しないだけで、他はＢ型アイソザイムの場合と全く同一
であって（その測定原理も、表１に示した測定原理の
内、阻害剤を使用する（１）を除き、そして（２）のＰ
ＧＡＭ−ＢをＴ−ＰＧＡＭに代えた点を除き、全く同一
である）、ＮＡＤＨの減少をレートアッセイ法で測定す
ればよく、Ｂ型アイソザイムの場合と同様に、Ｔ−ＰＧ
ＡＭの測定も細胞の低酸素状態その他細胞毒性の測定に
利用することができる。この場合は、阻害剤を使用する
ことなく測定することができる。またＭ型アイソザイム
については、Ｔ−ＰＧＡＭ値からＢ−ＰＧＡＭ値を差し
引けばその値を得ることができる。
しないだけで、他はＢ型アイソザイムの場合と全く同一
であって（その測定原理も、表１に示した測定原理の
内、阻害剤を使用する（１）を除き、そして（２）のＰ
ＧＡＭ−ＢをＴ−ＰＧＡＭに代えた点を除き、全く同一
である）、ＮＡＤＨの減少をレートアッセイ法で測定す
ればよく、Ｂ型アイソザイムの場合と同様に、Ｔ−ＰＧ
ＡＭの測定も細胞の低酸素状態その他細胞毒性の測定に
利用することができる。この場合は、阻害剤を使用する
ことなく測定することができる。またＭ型アイソザイム
については、Ｔ−ＰＧＡＭ値からＢ−ＰＧＡＭ値を差し
引けばその値を得ることができる。
【００１９】Ｔ−ＰＧＡＭの測定試薬及び同キットにつ
いても、阻害剤を使用する点を除き、Ｂ型アイソザイム
の場合と全く同一であり、上記理由と同じ理由により、
これ（ら）も低酸素状態ないし細胞障害（毒性）の測定
用試薬として極めて有効に利用することができる。Ｍ−
ＰＧＡＭの測定試薬及び同キットも同様である。
いても、阻害剤を使用する点を除き、Ｂ型アイソザイム
の場合と全く同一であり、上記理由と同じ理由により、
これ（ら）も低酸素状態ないし細胞障害（毒性）の測定
用試薬として極めて有効に利用することができる。Ｍ−
ＰＧＡＭの測定試薬及び同キットも同様である。
【００２０】本発明を実施するには、細胞培養液及び／
又は細胞粉砕物あるいはその分離液について、上記した
方法にしたがってＰＧＡＭを測定すればよく、例えば次
のとおりである。
又は細胞粉砕物あるいはその分離液について、上記した
方法にしたがってＰＧＡＭを測定すればよく、例えば次
のとおりである。
【００２１】（平滑筋細胞の培養）雄性８〜１０週齢Ｓ
ＨＲＳＰの胸部大動脈よりエクスプラント法（explant
method）により平滑筋細胞を採取し、１０％ウシ胎児血
清を含むＤＭＥＭ培地で培養する。 （アストロサイトの培養）胎生１５日齢ＳＨＲＳＰのラ
ット脳よりトリプシン消化法（trypsin digestion meth
od）により培養アストロサイトを採取し、１０％ウシ胎
児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養する。
ＨＲＳＰの胸部大動脈よりエクスプラント法（explant
method）により平滑筋細胞を採取し、１０％ウシ胎児血
清を含むＤＭＥＭ培地で培養する。 （アストロサイトの培養）胎生１５日齢ＳＨＲＳＰのラ
ット脳よりトリプシン消化法（trypsin digestion meth
od）により培養アストロサイトを採取し、１０％ウシ胎
児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養する。
【００２２】（低酸素実験）これらの細胞は、０．０１
〜１％、好ましくは０．１％ウシ胎児血清にて１２〜６
０時間程度（細胞によって異なるが、通常は４８時間）
培養した後、各種酸素濃度雰囲気下で（例えば２０％酸
素又は１％酸素下）一定期間（例えば２、４、８日間）
培養して培養液を得る。これらの培養液について、ＰＧ
ＡＭの測定を行う。その場合、いずれの培養液について
も同一のＰＧＡＭを測定してもよいが、例えばアストロ
サイト培養液のように脳由来の細胞液の場合には、Ｂ型
アイソザイムを測定する等、それぞれの細胞に適したＰ
ＧＡＭ、そのアイソザイムの種類を選択してもよい。以
下、本発明の実施例について述べる。
〜１％、好ましくは０．１％ウシ胎児血清にて１２〜６
０時間程度（細胞によって異なるが、通常は４８時間）
培養した後、各種酸素濃度雰囲気下で（例えば２０％酸
素又は１％酸素下）一定期間（例えば２、４、８日間）
培養して培養液を得る。これらの培養液について、ＰＧ
ＡＭの測定を行う。その場合、いずれの培養液について
も同一のＰＧＡＭを測定してもよいが、例えばアストロ
サイト培養液のように脳由来の細胞液の場合には、Ｂ型
アイソザイムを測定する等、それぞれの細胞に適したＰ
ＧＡＭ、そのアイソザイムの種類を選択してもよい。以
下、本発明の実施例について述べる。
【００２３】
【実施例１】雄性８〜１０週齢ＳＨＲＳＰの胸部大動脈
よりエクスプラント法により平滑筋細胞を採取し、これ
を培養して培養平滑筋細胞を調製した。
よりエクスプラント法により平滑筋細胞を採取し、これ
を培養して培養平滑筋細胞を調製した。
【００２４】（エクスプラント手順） （１）クリーンベンチ内に解剖道具をおき、６０ｍｍペ
トリ皿にＰＢＳを分注した。 （２）ラットをペントバルビタール麻酔した後、腹部を
剃毛し、次いでＴＭＳシート上に仰向けにおいた。 （３）腹部大動脈から脱血（シリンジによる採血）後、
胸腔を開き、大動脈を横隔膜上から大動脈弓に向かって
採取し、ＰＢＳの入った６０ｍｍペトリ皿に移した。
トリ皿にＰＢＳを分注した。 （２）ラットをペントバルビタール麻酔した後、腹部を
剃毛し、次いでＴＭＳシート上に仰向けにおいた。 （３）腹部大動脈から脱血（シリンジによる採血）後、
胸腔を開き、大動脈を横隔膜上から大動脈弓に向かって
採取し、ＰＢＳの入った６０ｍｍペトリ皿に移した。
【００２５】（クリーンベンチ内手順） （４）大動脈外膜のルーズ結合組織をピンセットにて除
き、小ハサミで縦に大動脈を切開した。 （５）付着した血液等を洗い落とした後、コラーゲナー
ゼ（１ｍｇ／ｍｌ）液が５ｍｌ入った１５ｍｌ容試験管
に移してＣＯ2インキュベーター内で２０分間インキュ
ベートした（ＳＰ、ＳＲは２５分間、ＷＫＹは３５分間
程度）。 （６）インキュベート終了後、大動脈をＰＢＳの入った
ペトリ皿に移して軽く洗浄した。ペトリ皿の蓋の方に大
動脈を移し、内腔を上にして開いた。綿棒をＰＢＳに浸
して内膜面を軽くこすり、内皮の残りをとった。一端に
メスで軽く切れ目を入れ、切れ目より時計鉗子にて内中
膜を外膜から剥離した（この作業は、組織を乾燥させな
いよう、手早くする必要があった）。
き、小ハサミで縦に大動脈を切開した。 （５）付着した血液等を洗い落とした後、コラーゲナー
ゼ（１ｍｇ／ｍｌ）液が５ｍｌ入った１５ｍｌ容試験管
に移してＣＯ2インキュベーター内で２０分間インキュ
ベートした（ＳＰ、ＳＲは２５分間、ＷＫＹは３５分間
程度）。 （６）インキュベート終了後、大動脈をＰＢＳの入った
ペトリ皿に移して軽く洗浄した。ペトリ皿の蓋の方に大
動脈を移し、内腔を上にして開いた。綿棒をＰＢＳに浸
して内膜面を軽くこすり、内皮の残りをとった。一端に
メスで軽く切れ目を入れ、切れ目より時計鉗子にて内中
膜を外膜から剥離した（この作業は、組織を乾燥させな
いよう、手早くする必要があった）。
【００２６】（７）中膜組織をメスにて１ｍｍ角程度に
細切した（この作業も、組織を乾燥させないように、手
早くする必要があった。） （８）綿棒の先に２６Ｇ針で各組織片をひろい、２５ｃ
ｍ2フラスコの底にはりつけた。その際、１つのフラス
コに３０片程度に組織片をはりつけた（この作業も手早
く行った）。 （９）組織片に培地がかからないように５ｍｌのＤＭＥ
Ｍ−Ｆ（＋）培地を加えた。 （１０）フラスコにキャップをし、組織片をフラスコ面
に接着させるため立てた状態でＣＯ2インキュベーター
内においた。組織片が接着後（１０〜２０分後；組織片
の周囲のＰＢＳが少なくなったら可）、フラスコをゆっ
くり横にして組織片を培地につけた（組織片が乾燥しな
いように注意した）。 （１１）５〜７日間静置し、遊走状態を観察した。遊走
したものは培地を取りかえ、更に静置した。 （１２）充分量の細胞が遊走、繁殖したら継代培養（pa
ssage）を行った（組織片は可及的に除去するのが良い
が、残っていても構わない。）。
細切した（この作業も、組織を乾燥させないように、手
早くする必要があった。） （８）綿棒の先に２６Ｇ針で各組織片をひろい、２５ｃ
ｍ2フラスコの底にはりつけた。その際、１つのフラス
コに３０片程度に組織片をはりつけた（この作業も手早
く行った）。 （９）組織片に培地がかからないように５ｍｌのＤＭＥ
Ｍ−Ｆ（＋）培地を加えた。 （１０）フラスコにキャップをし、組織片をフラスコ面
に接着させるため立てた状態でＣＯ2インキュベーター
内においた。組織片が接着後（１０〜２０分後；組織片
の周囲のＰＢＳが少なくなったら可）、フラスコをゆっ
くり横にして組織片を培地につけた（組織片が乾燥しな
いように注意した）。 （１１）５〜７日間静置し、遊走状態を観察した。遊走
したものは培地を取りかえ、更に静置した。 （１２）充分量の細胞が遊走、繁殖したら継代培養（pa
ssage）を行った（組織片は可及的に除去するのが良い
が、残っていても構わない。）。
【００２７】
【実施例２】実施例１で調製した培養細胞（５〜１０代
継代した細胞）を０．１％ウシ胎児血清にて４８時間培
養した後、２０％酸素又は１％酸素雰囲気下で、２、
４、８日間培養し、それぞれ培養液を得、試料とした。
これらの試料（各群ともにｎ＝６）について、下記表２
の作業手順、条件にしたがい、全ＰＧＡＭ（Ｔ−ＰＧＡ
Ｍ）値を日立７１５０自動分析器を用いて測定した。
継代した細胞）を０．１％ウシ胎児血清にて４８時間培
養した後、２０％酸素又は１％酸素雰囲気下で、２、
４、８日間培養し、それぞれ培養液を得、試料とした。
これらの試料（各群ともにｎ＝６）について、下記表２
の作業手順、条件にしたがい、全ＰＧＡＭ（Ｔ−ＰＧＡ
Ｍ）値を日立７１５０自動分析器を用いて測定した。
【００２８】
【表２】
【００２９】測定試薬としては、下記組成を有する試薬
１（Ｒ−１）及び試薬２（Ｒ−２）を用いた。
１（Ｒ−１）及び試薬２（Ｒ−２）を用いた。
【００３０】 （試薬１）：Ｒ−１ （ｍｌ） ＴＥＡ緩衝液 （０．１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．６） ４０．３２ ＭｇＳＯ4 （０．１ｍｏｌ／ｌ） ０．５４ ＮＡＤＨ （１４ｍｍｏｌ／ｌ） ０．９０ ＡＤＰ （２１ｍｍｏｌ／ｌ） １．８０ Ｇ−２，３−Ｐ２ （７ｍｍｏｌ／ｌ） ０．９０ ＬＤＨ （５ｍｇ蛋白質／ｍｌ） ０．１８ ＰＫ （２ｍｇ蛋白質／ｍｌ） ０．１８ エノラーゼ （１０ｍｇ蛋白質／ｍｌ） ０．１８ （合計：４５．００ｍｌ）
【００３１】 （試薬２）：Ｒ−２ （ｍｌ） Ｇ−３−Ｐ （９５ｍｍｏｌ／ｌ） ３．００ ＴＥＡ緩衝液 （０．１ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ７．６） ５．２０ （合計：８．２０ｍｌ）
【００３２】試薬１（Ｒ−１）２５０μｌと、培養液サ
ンプル５μｌを混合し、５分間放置した。次いで試薬２
（Ｒ−２）を用いてＰＧＡＭの活性を測定した。試薬２
（Ｒ−２）にはグリセリン酸−３−リン酸（基質）が含
まれているので、試薬２を４１μｌ添加することによっ
て反応を開始せしめた（基質スタート）。試薬２の添加
から約１．５分後に測定を開始した。
ンプル５μｌを混合し、５分間放置した。次いで試薬２
（Ｒ−２）を用いてＰＧＡＭの活性を測定した。試薬２
（Ｒ−２）にはグリセリン酸−３−リン酸（基質）が含
まれているので、試薬２を４１μｌ添加することによっ
て反応を開始せしめた（基質スタート）。試薬２の添加
から約１．５分後に測定を開始した。
【００３３】測定には日立７１５０自動分析装置を用
い、アッセイコードをＲＡＴＥ−Ａ：３２−３９、測定
温度を３７℃に設定し、約１．５分ＮＡＤＨの減少によ
る吸光度Ａ３４０ｎｍの減少を測定した。なお、副波長
は４０５ｎｍで測定を行った。得られた結果を下記表３
に示す。なお、同時に、従来から知られている細胞障害
マーカーＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の値も併記し
た。
い、アッセイコードをＲＡＴＥ−Ａ：３２−３９、測定
温度を３７℃に設定し、約１．５分ＮＡＤＨの減少によ
る吸光度Ａ３４０ｎｍの減少を測定した。なお、副波長
は４０５ｎｍで測定を行った。得られた結果を下記表３
に示す。なお、同時に、従来から知られている細胞障害
マーカーＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の値も併記し
た。
【００３４】
【表３】
【００３５】上記したＳＨＲＳＰ由来培養平滑筋細胞を
用いた低酸素暴露における細胞障害試験の結果から明ら
かなように、低酸素暴露において全ＰＧＡＭ値（Ｕ／Ｌ
／ｍｇ蛋白質）は高酸素暴露の場合よりも高く、ＰＧＡ
Ｍは、細胞障害におけるマーカーとして利用できること
が明らかとなり、むしろＬＤＨよりも更に感度の高いマ
ーカーであることが確認された。
用いた低酸素暴露における細胞障害試験の結果から明ら
かなように、低酸素暴露において全ＰＧＡＭ値（Ｕ／Ｌ
／ｍｇ蛋白質）は高酸素暴露の場合よりも高く、ＰＧＡ
Ｍは、細胞障害におけるマーカーとして利用できること
が明らかとなり、むしろＬＤＨよりも更に感度の高いマ
ーカーであることが確認された。
【００３６】
【実施例３】胎生１５日齢ＳＨＲＳＰのラット脳よりト
リプシン消化法によって培養アストロサイトを採取し、
これを培養して培養アストロサイト細胞を調製した。
リプシン消化法によって培養アストロサイトを採取し、
これを培養して培養アストロサイト細胞を調製した。
【００３７】（アルコール消毒下） （１）胎生１５〜２２日齢ラットの脳を取り出した。 （２）ペトリ皿内のＰＢＳ（−）の中に入れた。
【００３８】（クリーンベンチ内処理） （３）硬膜をはがした。脳をきれいにした後、細切し
た。 （４）細切する過程でペトリ皿を３回程度取り換えてき
れいにした。 （５）抗生物質（ストレプトマイシン及びペニシリン）
を通常使用の１０倍程度添加して５分間放置した（２
回）。 （６）細切片を０．２５％トリプシン処理した（３７
℃、５〜７分）。 （７）パスツールピペットを用いて組織片が崩れる程度
に（１０〜２０回）ピペッティングをした。 （８）１２，０００ｒｐｍで５分間遠心処理して、ペレ
ットを採取した。
た。 （４）細切する過程でペトリ皿を３回程度取り換えてき
れいにした。 （５）抗生物質（ストレプトマイシン及びペニシリン）
を通常使用の１０倍程度添加して５分間放置した（２
回）。 （６）細切片を０．２５％トリプシン処理した（３７
℃、５〜７分）。 （７）パスツールピペットを用いて組織片が崩れる程度
に（１０〜２０回）ピペッティングをした。 （８）１２，０００ｒｐｍで５分間遠心処理して、ペレ
ットを採取した。
【００３９】（９）ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＣＳ培地を加
え、トリプシン反応を止めた。 （１０）１２，０００ｒｐｍで５分間遠心処理して、ペ
レットを採取した。 （１１）脳１個あたり６ｍｌ培地で２５ｃｍ2フラスコ
で培養した。
え、トリプシン反応を止めた。 （１０）１２，０００ｒｐｍで５分間遠心処理して、ペ
レットを採取した。 （１１）脳１個あたり６ｍｌ培地で２５ｃｍ2フラスコ
で培養した。
【００４０】
【実施例４】上記細胞培養液についてＢ−ＰＧＡＭの測
定を行うに先立ち、四チオン酸カリウムのＰＧＡＭ−Ｂ
及びＰＧＡＭ−Ｍに対する影響を自動分析法によって検
討した。試料としては、Ｂ型及びＭ型の標準品（いずれ
もプール血清ベース）を用い、生理食塩水で希釈して１
／１〜１／８のサンプルを用意した。これらのサンプル
に各種濃度の四チオン酸カリウムを添加し、５分間反応
させた後、Ｂ型及びＭ型ＰＧＡＭ量を自動分析法を利用
して測定した。
定を行うに先立ち、四チオン酸カリウムのＰＧＡＭ−Ｂ
及びＰＧＡＭ−Ｍに対する影響を自動分析法によって検
討した。試料としては、Ｂ型及びＭ型の標準品（いずれ
もプール血清ベース）を用い、生理食塩水で希釈して１
／１〜１／８のサンプルを用意した。これらのサンプル
に各種濃度の四チオン酸カリウムを添加し、５分間反応
させた後、Ｂ型及びＭ型ＰＧＡＭ量を自動分析法を利用
して測定した。
【００４１】実施例２の試薬を用い、自動分析法によっ
てＰＧＡＭ−Ｂ、ＰＧＡＭ−Ｍ量をそれぞれ測定し、下
記表４の結果を得た。その結果から明らかなように、四
チオン酸カリウムによってＭ型アイソザイムのみが特異
的に失活し、Ｂ型アイソザイムは全く影響されないこと
が判った。
てＰＧＡＭ−Ｂ、ＰＧＡＭ−Ｍ量をそれぞれ測定し、下
記表４の結果を得た。その結果から明らかなように、四
チオン酸カリウムによってＭ型アイソザイムのみが特異
的に失活し、Ｂ型アイソザイムは全く影響されないこと
が判った。
【００４２】
【表４】
【００４３】
【実施例５】実施例３で調製した培養細胞（５〜１０代
継代した細胞）を０．１％ウシ胎児血清にて４８時間培
養した後、２０％酸素又は１％酸素雰囲気下で、２、
４、８日間培養し、それぞれ培養液を得、試料とした。
継代した細胞）を０．１％ウシ胎児血清にて４８時間培
養した後、２０％酸素又は１％酸素雰囲気下で、２、
４、８日間培養し、それぞれ培養液を得、試料とした。
【００４４】この試料について、Ｍ型ＰＧＡＭアイソザ
イム阻害剤として四チオン酸カリウムを用いて、ＰＧＡ
Ｍ活性の測定を行った。測定試薬としては、実施例１で
使用したＰＧＡＭ活性測定試薬（Ｒ−１）に２．２５ｍ
Ｍ（最終濃度１．９ｍＭ）となるように四チオン酸カリ
ウム（分子量３０２．４）を添加溶解し（Ｒ−１）試薬
２２ｍｌに四チオン酸カリウムを１５ｍｇ溶解）、Ｍ型
を失活させ、Ｂ型ＰＧＡＭ活性測定試薬を調製した。
イム阻害剤として四チオン酸カリウムを用いて、ＰＧＡ
Ｍ活性の測定を行った。測定試薬としては、実施例１で
使用したＰＧＡＭ活性測定試薬（Ｒ−１）に２．２５ｍ
Ｍ（最終濃度１．９ｍＭ）となるように四チオン酸カリ
ウム（分子量３０２．４）を添加溶解し（Ｒ−１）試薬
２２ｍｌに四チオン酸カリウムを１５ｍｇ溶解）、Ｍ型
を失活させ、Ｂ型ＰＧＡＭ活性測定試薬を調製した。
【００４５】試薬１（Ｒ−１）に四チオン酸カリウムを
添加溶解した液２５０μｌと、サンプル５μｌを混合
し、５分間放置した。その間にサンプル中のＭ型（及び
ＭＢ型）ＰＧＡＭが失活、阻害されるので、以下、試薬
２（Ｒ−２）を用いてＢ型ＰＧＡＭ値（Ｕ／Ｌ／ｍｇ蛋
白質）を測定し、得られた結果を表５に示した。
添加溶解した液２５０μｌと、サンプル５μｌを混合
し、５分間放置した。その間にサンプル中のＭ型（及び
ＭＢ型）ＰＧＡＭが失活、阻害されるので、以下、試薬
２（Ｒ−２）を用いてＢ型ＰＧＡＭ値（Ｕ／Ｌ／ｍｇ蛋
白質）を測定し、得られた結果を表５に示した。
【００４６】
【表５】
【００４７】上記したＳＨＲＳＰ由来培養アストロサイ
ト細胞を用いた低酸素暴露における細胞障害試験の結果
から明らかなように、低酸素暴露においてＢ−ＰＧＡＭ
値は高酸素暴露の場合よりも高く、Ｂ−ＰＧＡＭも細胞
障害におけるマーカーとして利用できることが明らかと
なった。なお、ＬＤＨについても測定を試みたが、あま
りにも低値であってマーカーとしては使用できなかっ
た。
ト細胞を用いた低酸素暴露における細胞障害試験の結果
から明らかなように、低酸素暴露においてＢ−ＰＧＡＭ
値は高酸素暴露の場合よりも高く、Ｂ−ＰＧＡＭも細胞
障害におけるマーカーとして利用できることが明らかと
なった。なお、ＬＤＨについても測定を試みたが、あま
りにも低値であってマーカーとしては使用できなかっ
た。
【００４８】
【発明の効果】本発明により、ＰＧＡＭ（Ｔ−ＰＧＡ
Ｍ、Ｂ−ＰＧＡＭその他のアイソザイムも包含する）を
測定することによって、低酸素状態を測定することがで
き、もって、細胞の障害、特に虚血性障害等の低酸素に
よる障害を測定することができ、また、ＰＧＡＭは各種
細胞の障害マーカーとして広く利用することができる。
更に本発明によれば、低酸素以外の各種細胞毒性に起因
する細胞障害も広く測定でき、広範な細胞障害マーカー
（視点を変えれば、細胞毒性マーカー）として利用でき
る。
Ｍ、Ｂ−ＰＧＡＭその他のアイソザイムも包含する）を
測定することによって、低酸素状態を測定することがで
き、もって、細胞の障害、特に虚血性障害等の低酸素に
よる障害を測定することができ、また、ＰＧＡＭは各種
細胞の障害マーカーとして広く利用することができる。
更に本発明によれば、低酸素以外の各種細胞毒性に起因
する細胞障害も広く測定でき、広範な細胞障害マーカー
（視点を変えれば、細胞毒性マーカー）として利用でき
る。
フロントページの続き (72)発明者 谷口 嘉之 東京都板橋区小豆沢三丁目６番10号 オリ エンタル酵母工業株式会社内 (72)発明者 松尾 雄志 東京都板橋区小豆沢三丁目６番10号 オリ エンタル酵母工業株式会社内
Claims (10)
- 【請求項１】 ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡ
Ｍ）又はそのアイソザイム測定試薬からなる細胞障害及
び／又は細胞毒性測定用試薬。 - 【請求項２】 ＰＧＡＭのアイソザイムがＢ型アイソザ
イム又はＭ型アイソザイムであること、を特徴とする請
求項１に記載の試薬。 - 【請求項３】 ＰＧＡＭ測定試薬が、エノラーゼ、ピル
ビン酸キナーゼ、ＮＡＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼを含
有するものであること、を特徴とする請求項１又は２に
記載の試薬。 - 【請求項４】 Ｂ型アイソザイム測定試薬がＰＧＡＭ阻
害剤を含有すること、を特徴とする請求項１〜３のいず
れか１項に記載の試薬。 - 【請求項５】 ＰＧＡＭ阻害剤がポリチオン酸及び／又
はその誘導体であること、を特徴とする請求項４に記載
の試薬。 - 【請求項６】 ＰＧＡＭ阻害剤が四チオン酸のカリウム
塩及び／又はナトリウム塩であること、を特徴とする請
求項５に記載の試薬。 - 【請求項７】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の試
薬を用いて試料中のＰＧＡＭをレートアッセイ法によっ
て測定すること、を特徴とする細胞障害及び／又は細胞
毒性の測定方法。 - 【請求項８】 ＰＧＡＭ阻害剤を用いて材料を処理した
後、ＰＧＡＭアイソザイムをレートアッセイ法によって
測定すること、を特徴とする細胞障害及び／又は細胞毒
性の測定方法。 - 【請求項９】 ＰＧＡＭ又はそのアイソザイムからなる
細胞障害又は細胞毒性マーカー。 - 【請求項１０】 細胞障害が低酸素に起因する細胞障害
であること、を特徴とする請求項９に記載の細胞障害又
は細胞毒性マーカー。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10046349A JPH11225795A (ja) | 1998-02-13 | 1998-02-13 | 細胞障害マーカー |
| EP99102683A EP0937779A3 (en) | 1998-02-13 | 1999-02-12 | Cell damage marker |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10046349A JPH11225795A (ja) | 1998-02-13 | 1998-02-13 | 細胞障害マーカー |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11225795A true JPH11225795A (ja) | 1999-08-24 |
Family
ID=12744679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10046349A Pending JPH11225795A (ja) | 1998-02-13 | 1998-02-13 | 細胞障害マーカー |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0937779A3 (ja) |
| JP (1) | JPH11225795A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008026290A (ja) * | 2006-07-25 | 2008-02-07 | Ehime Univ | 腫瘍マーカ、腫瘍診断キットおよび腫瘍マーカの測定方法 |
| JP2009533056A (ja) * | 2006-04-10 | 2009-09-17 | ウィスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション | ヒト胚性幹細胞を使用して薬学的化合物および他の化学物質の毒性を評価するための試薬および方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3073667B2 (ja) * | 1995-06-01 | 2000-08-07 | オリエンタル酵母工業株式会社 | 脳卒中の新規マーカー |
-
1998
- 1998-02-13 JP JP10046349A patent/JPH11225795A/ja active Pending
-
1999
- 1999-02-12 EP EP99102683A patent/EP0937779A3/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009533056A (ja) * | 2006-04-10 | 2009-09-17 | ウィスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション | ヒト胚性幹細胞を使用して薬学的化合物および他の化学物質の毒性を評価するための試薬および方法 |
| JP2008026290A (ja) * | 2006-07-25 | 2008-02-07 | Ehime Univ | 腫瘍マーカ、腫瘍診断キットおよび腫瘍マーカの測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0937779A2 (en) | 1999-08-25 |
| EP0937779A3 (en) | 2000-05-17 |
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