JP2008026290A - 腫瘍マーカ、腫瘍診断キットおよび腫瘍マーカの測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明の腫瘍マーカは、下記(A)の腫瘍マーカおよび下記(B)の腫瘍マーカの少なくとも一方を含む腫瘍マーカである。
(A)ヒト由来PGAM、抗ヒト由来PGAM抗体、ヒト由来PGAM遺伝子およびヒト由来PGAMmRNAからなる群から選択される少なくとも一つを含む腫瘍マーカ。
(B)ヒト由来TPI、抗ヒト由来TPI抗体、ヒト由来TPI遺伝子およびヒト由来TPImRNAからなる群から選択される少なくとも一つを含む腫瘍マーカ。
例えば、組換えPGAM1を抗原として、被験者の血清中の自己抗体をCLEIA法により測定すれば、図1のグラフに示すように、高感度かつ高特異性で癌を判定できる。
【選択図】 図1
Description
(A)ヒト由来PGAM、抗ヒト由来PGAM抗体、ヒト由来PGAM遺伝子およびヒト由来PGAMmRNAからなる群から選択される少なくとも一つを含む腫瘍マーカ。
(B)ヒト由来TPI、抗ヒト由来TPI抗体、ヒト由来TPI遺伝子およびヒト由来TPImRNAからなる群から選択される少なくとも一つを含む腫瘍マーカ。
PGAMには、下記に示すように3種類のアイソザイムがある。これらの中でも、B型(脳型)のPGAMが好ましく、より好ましくはB型のPGAM1である。
M型(MM homodimer):成人の骨格筋(一般に筋型)
B型(BB homodimer):脳、肝臓、腎臓(一般に脳型)
MB型(MB heterodimer):心筋
TPIは、下記に示すように、2種類のアイソザイムが存在するが、ヒトでの報告はTPI1のみである。
1型(TPI1):解糖系酵素
2型(TPI2):機能不明
(A1)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(A2)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ヒトPGAM1としての機能を有するタンパク質。
(B1)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B2)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ヒトTPI1としての機能を有するタンパク質。
血清は、57例の悪性疾患患者(癌患者)、14例の良性疾患患者、17例の健常者より、全て同意を得た上で採血し、至適条件にて遠心分離した後、血清のみを採取し解析に用いた。癌患者(malignant)の内訳は、胃癌(Gastric ca.):7例、大腸癌(Colo−rectal ca.):17例(結腸癌:9例、直腸癌:8例)、乳癌(Breast ca.):7例、膵癌(Pancreas ca.):13例、肝・胆道系癌(Bile duct ca. & HCC):3例(肝細胞癌:1例、胆管癌:2例)、口腔扁平上皮癌(OC.SCC):10例であり、男女比29(男):28(女)、平均年齢68.5歳(38〜85歳)である。良性疾患患者(benign)の内訳は、慢性膵炎:1例、胆石症:4例、口腔良性疾患:9例であり、男女比6(男):8(女)、平均年齢54.4歳(24〜70歳)である。健常者(control)は、男女比11(男):6(女)、平均年齢46.9歳(23〜80歳)である。なお、自己抗体の存在を確認するために用いたのは、前記悪性疾患患者(癌患者:57例)である。また、癌患者は、初発または再発を問わない。
細胞株として、ヒト膵臓癌細胞株MIAPaCa IIを用いた。ヒト膵癌細胞株MIAPaCa IIを、10%牛胎児血清含有RPMI medium 1640(Invitrogen社)を用いて、5%CO2インキュベータにて培養した。
培養したヒトMIAPaCa II細胞を回収し、可溶化バッファー(8M Urea、4%CHAPS、60mM DTT、2%IPG Buffer(pI:3−10)、0.002%Bromophenol blue)と混和し、超音波破砕処理をした後、遠心分離(12000rpm/4℃/12min)し、上清を泳動用サンプルとした。また、リン酸化を促進させタンパク質の抗原性を高めたモデルでは、培養液中にPMA(Phorbol 12−myristate13−acetate)を加え一晩培養し、その後同様の条件でサンプル調製した。
まず、固定化pH勾配ゲル(商品名:Immobiline Drystrip,7cm,pH3−10/Amersham biosciences社)を使用し、等電点電気泳動を行った(商品名:Ettan IPGphor II/Amersham biosciences社)。次に、2次元目にポリアクリルアミドゲル(10% Real Gel plate / BIO CRAFT社)を使用しSDS−PAGEを行った。泳動後のゲルはCBB(Coomassie Brilliant Blue)にて染色した。
2次元電気泳動後のゲル上のタンパク質をSemi−dry blotterを用いて電気的にPVDF(poly vinilidene difluoride)膜(MILLIPORE社)に転写した。転写したPVDF膜をブロッキングバッファー(5% nonfat milk−PBS−0.1%Tween)を用いて室温1時間インキュベートした後、1次抗体として癌患者のヒト血清(1000倍希釈/5%BSA−PBS−0.1%Tween)を室温1時間反応させ、その後洗浄した。次に2次抗体として5%BSA−PBS−0.1%Tweenにて10000倍希釈したパーオキシダーゼ標識anti−Human IgG antibody(Santacruz社)を室温1時間反応させ、その後洗浄し、ECL(Amersham biosciences社)にて化学発光させ、X線フィルムに露光させた。
Western blottingにて観察される癌患者血清と反応を示すバンドと、CBB染色した2次元電気泳動ゲルを比較し、一致するタンパク質スポットをゲルより切り出した。そして、下記の条件により、ゲルの染色液の脱色、ゲルの脱水、ゲル内消化およびペプチド抽出の一連の操作を行い、ペプチドの質量解析を行った。その結果、前記癌患者血清と特異的に反応したタンパク質として、PGAM(PGAM1)が同定された。この質量解析の結果を図13に示す。
ヒトMIAPaCa II培養細胞株よりRNAを抽出し、商品名RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas社)を用いてcDNAを合成した。特異的プライマーを用いRT−nested PCR法にて目的DNAを増幅して回収した。このDNAをタンパク発現用ベクター(pGEX 6p2 vectorあるいはpMAL c2 vector)に組み込み、大腸菌発現系(competent cell:BL21)を用いて融合タンパク質を発現させた。組換えPGAM1はアフィニティーゲル(Amylose Resin)にて精製し、融合タンパク質MBP−PGAM1として溶出し回収した。組換えTPI1はアフィニティーゲル(Glutathione Sepharose 4B gel)にて精製し融合タンパク質GST−TPI1として回収した後、2%Prescision protease(Amersham biosciences社)にてGST部を切断分離し、遠心分離(2500rpm/room temp./5min)後の上清をTPI1として回収した。前記両組換えタンパク質は、いずれも10%PBSに対して透析をした後、組換えタンパク質溶液として回収した。得られた抗原タンパク質は、MBP−PGAM1およびTPI1である。なお、前記RT−nested PCR法の操作および条件は、下記のとおりである。
PGAM1およびTPI1のクローニングは、データベースよりそれぞれのタンパク質の全長cDNA配列を検索し、coding sequenceを基に配列を設計し、これに基づきカスタムプライマーを購入(Sigma Genosys社)し、使用した。プライマーの配列を下記に示す。括弧内はアニーリング温度を示す。反応液のDNAポリメラーゼは、商品名TaKaRa LA Taq(Takara bio 社)を使用し、下記に示すWF/WB primerを使用して1回目のPCRを行った後、そのPCR産物をテンプレートとし、下記に示すアダプターをつけたnested primerを用いて2回目のPCRを行い、全長のPGAM1およびTPI1をクローニングした。PCRのプログラムは、94℃×10sec、アニーリング(下記の括弧内の温度)×15secおよび72℃×120secの一連のサイクルを35サイクル行い、反応後は、4℃で保存した。
WF:5’−aatctgctaatcccagtcggtgcc−3’(配列番号3)
WB:5’−actcgcaaaaacccaagtcactac−3’(配列番号4)
(57℃)
F−BamH1:5’−cgcggatccatggccgcctacaaactg−3’(配列番号5)
B−EcoR1:5’−ccggaattctcacttcttggccttgcc−3’(配列番号6)
(65℃)
WF:5’−caagaagggggaacgtcgg−3’(配列番号7)
WB:5’−atatgcagggaaagggcagttac−3’(配列番号8)
(57℃)
F−BamH1:5’−cgcggatccatggcgccctccagg−3’(配列番号9)
B−Xho1:5’−ccctcgagtcattgtttggcattg−3’(配列番号10)
(57℃)
精製組換えタンパク質をCarbonate buffer(0.2M , pH:9.5)を用いて濃度調整し、96穴プレートに100ng/100μl/wellにて固相化(4℃ , over night)した。
MBP−PGAM1を用いたCLEIAの結果を、図1から図5に示す。
TPI1を用いたCLEIAの結果を、図6から図10に示す。
図11および図12に従来の腫瘍マーカ(CA19−9、CEA)による癌の判別と本実施例による癌の判別を示す。CA19−9は、膵癌、胆道癌等の各種消化器癌で上昇する腫瘍マーカであり、単位は、「U/ml」であり、閾値(cut off 値)は37U/mlである。CEAは、消化器癌、乳癌、肺癌等で上昇する腫瘍マーカであり、単位は、「ng/ml」であり、閾値(cut off 値)は5.0ng/mlである。これら従来の腫瘍マーカでは、いずれも、血清中の前記マーカのタンパク質濃度が測定される。図11は、腫瘍マーカ「CA19−9」の病期別の判別の表と、本実施例のPGAM1およびTPI1の癌の判別の表とを示す。同図において、閾値は、前記第1の閾値および第2の閾値の双方を示す。同図に示すように、本実施例の前記二つ腫瘍マーカは、従来の腫瘍マーカ「CA19−9」と同等以上の確率で各種癌を判別できたことが分かる。図12は、膵臓癌の13例において、従来の腫瘍マーカである「CA19−9」と「CEA」と、本実施例のPGAM1とTPI1との癌の判別を示す表である。同図において、「patien」は癌患者を示し、癌患者13名ごとに、前記各種マーカのスコアを示している。同図に示すように、「CA19−9」の陽性率は、92.3%であり、「CEA」の陽性率は33.3%であった。これに対し、本実施例の2つの腫瘍マーカであるPGAM1とTPI1を合わせた陽性率は、100%であり、癌を完全に判別できた。なお、図11および図12の従来の腫瘍マーカの判別データは、「臨床検査ガイドライン 2005/2006」(日本臨床検査医学会)による。
Claims (13)
- 下記(A)の腫瘍マーカおよび下記(B)の腫瘍マーカの少なくとも一方を含む腫瘍マーカ。
(A)ヒト由来PGAM、抗ヒト由来PGAM抗体、ヒト由来PGAM遺伝子およびヒト由来PGAMmRNAからなる群から選択される少なくとも一つを含む腫瘍マーカ。
(B)ヒト由来TPI、抗ヒト由来TPI抗体、ヒト由来TPI遺伝子およびヒト由来TPImRNAからなる群から選択される少なくとも一つを含む腫瘍マーカ。 - 前記抗ヒト由来PGAM抗体および前記抗ヒト由来TPI抗体が、ヒト血清中の自己抗体である請求項1記載の腫瘍マーカ。
- 前記ヒト由来PGAMが、ヒト由来PGAM1であり、前記ヒト由来TPIが、ヒト由来TPI1である請求項1または2記載の腫瘍マーカ。
- 膵癌、肝臓癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、胃癌、乳癌および口腔癌からなる群から選択される少なくとも一つの癌の診断のための腫瘍マーカである請求項1から3のいずれか一項に記載の腫瘍マーカ。
- 血清ELISA法または血清CLEIA法を用いた腫瘍診断キットであって、ヒト由来PGAMおよびヒト由来TPIの少なくとも一方の腫瘍特異的抗原と、前記腫瘍特異的抗原に対する自己抗体を認識する標識二次抗体とを含む腫瘍診断キット。
- 前記ヒト由来PGAMが、ヒト由来PGAM1であり、前記ヒト由来TPIが、ヒト由来TPI1である請求項5記載の腫瘍診断キット。
- 前記ヒト由来PGAMおよび前記ヒト由来TPIが、組換タンパク質である請求項5または6に記載の腫瘍診断キット。
- 膵癌、肝臓癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、胃癌、乳癌および口腔癌からなる群から選択される少なくとも一つの癌の診断のためのキットである請求項5から7のいずれか一項に記載の腫瘍診断キット。
- 腫瘍マーカの測定方法であって、前記腫瘍マーカが、ヒト由来PGAMおよびヒト由来TPIの少なくとも一方のタンパク質に対するヒト血清中の自己抗体であり、前記ヒト由来PGAMおよび前記ヒト由来TPIの少なくとも一方のタンパク質に、前記タンパク質に対する前記自己抗体を結合させて複合体を形成させ、前記複合体を測定する腫瘍マーカの測定方法。
- 前記複合体の測定が、前記複合体の前記自己抗体に標識二次抗体を結合させ、前記二次抗体の前記標識を測定する方法である請求項9記載の腫瘍マーカの測定方法。
- 前記ヒト由来PGAMが、ヒト由来PGAM1であり、前記ヒト由来TPIが、ヒト由来TPI1である請求項9または10記載の腫瘍マーカの測定方法。
- 前記ヒト由来PGAMおよび前記ヒト由来TPIが、組換えタンパク質である請求項9から11のいずれか一項に記載の腫瘍マーカの測定方法。
- 前記腫瘍マーカが、膵癌、肝臓癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、胃癌、乳癌および口腔癌からなる群から選択される少なくとも一つの癌の診断のための腫瘍マーカである請求項9から12のいずれか一項に記載の腫瘍マーカの測定方法。
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