CN104812914B

CN104812914B - 诊断受试者中的肝癌的方法及诊断肝癌的试剂盒

Info

Publication number: CN104812914B
Application number: CN201380060446.7A
Authority: CN
Inventors: 许锦文
Original assignee: Singapore Health Services Pte Ltd
Current assignee: Xu Jinwen
Priority date: 2012-09-21
Filing date: 2013-09-23
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2033-09-23
Also published as: WO2014046623A1; US20150232943A1; EP2898099A1; SG11201502089QA; KR20150058465A; EP2898099A4; JP2015530094A; CN104812914A

Abstract

本发明公开了诊断受试者中肝癌的方法，以及评定具有慢性肝炎和肝硬化的受试者发展成肝癌的风险。本发明还公开了用于诊断肝癌的试剂盒。

Description

诊断受试者中的肝癌的方法及诊断肝癌的试剂盒

相关申请的交叉引用

本发明要求于2012年9月21日递交的美国临时专利申请61/704,425，名称为“诊断受试者中的肝癌的方法及诊断肝癌的试剂盒(METHODS OF DIAGNOSING LIVER CANCER INA SUBJECT AND A KIT FOR DIAGNOSING LIVER CANCER)”的优先权的权益，该专利申请的全部公开通过整体引用并入本文中以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及诊断受试者中的肝癌的方法，以及评定具有肝硬化的受试者发展成肝癌的风险的方法。本发明还涉及诊断肝癌的试剂盒。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是全球最常见的癌症之一并且是癌症死亡的第三位最常见的原因，同时具有全球高于50万例的年发病率(Kamangar et al (2006).J Clin Oncol,24,2137-50；Boyle P.(2008).Annals of Oncology,19:605-606)。由于诊断晚，HCC患者的结局仍然很差。目前，血清α-胎蛋白(AFP)水平和超声波检查法通常用于HCC的筛查和诊断。但是，这种途径的临床用途因为多种原因而受限。首先，AFP不是在所有HCC患者中都是升高的，并且AFP可能因为慢性肝病而升高，从而产生令人不满意的敏感度和特异性。在20ng/ml的截断值(cut-off value)处，不同研究均报道了敏感度的范围为41％～64％，并且特异性的范围为80％～91％(Daniele et al,(2004)Gastroenterology.2004Nov；127(5Suppl1):S108-12)。根据2005年出版的美国肝病研究学会(AASLD)的实践指南，推荐200ng/ml是诊断的截断点，同时敏感度为22％且特异性高于99％(Trevisani et al,J Hepatol.(2001)Apr；34(4):570-5,Lok et al.,Gastroenterology(2010)Feb；138(2):493-502)。在2010年，基于最近研究的结果，用于HCC监控的2010AASLD指南推荐超声单独用于监视，并且不再包括用于监视和诊断的AFP(Bruix&Sherman,Hepatology(2011)Mar；53(3):1020-22)。另一方面，超声具有它自己的局限，难以在具有大块畸形物的肝硬化的肝脏中检测肿瘤。此外，超声的性能高度依赖于操作者的经验和设备的精密性，并且生活在不发达地区中的人可能无法使用。由于这些原因，已经投入了大量精力以寻找用于HCC筛查和诊断的更可靠的标记物。

HCC的理想的标记物应当是特异性且敏感的，并且来自容易获取的样本。随着高密度微阵列和蛋白质组学的发展，近几年已经鉴定出了很多新的标记物。一种最初的探索途径是寻找HCC肿瘤组织中的线索，诸如磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)和高尔基体蛋白73(GP73)(Liu et al.,World J Gastroenterol.(2010)Sep 21；16(35):4410-5,Capurro et al,Gastroenterology.(2003)Jul；125(1):89-97)，并且通过ELISA或蛋白印迹(Westernblot)验证它们存在于外周血中。一些研究使用质谱绘制血浆中的蛋白图谱，以鉴定出蛋白标记物，诸如骨桥蛋白(OPN)(Shang et al,Hepatology.(2012)Feb；55(2):483-90)。其它研究利用微阵列绘制来自血浆或血清的核酸的图谱，以鉴定出基因标记物或微RNA(microRNA)标记物(Zhou et al,J Clin Oncol.2011Dec 20；29(36):4781-8.)。在HCC的新的标记物中，得到最广泛研究的标记物是脱-γ-羧基凝血酶原(DCP)和糖型AFP(AFP-L3)。尽管，报道称DCP的敏感度相对较好(74％)，但是它的特异性并不令人满意(70％～86％)(Marerro et al,Gastroenterology.(2009)Jul；137(1):110-8,Lok et al,上述)。得到的结论是，AFP和DCP都不是在检测早期HCC中补足超声的最佳方式(Lok et al,上述)。

因此，需要找到适于HCC早期检测的新的标记物。

发明内容

本发明提供了一种诊断受试者中的肝癌的方法。该方法包括确定获自受试者的样品中至少一种标记物基因的基因表达水平，该至少一种标记物基因选自由肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(TNFAIP3)的基因、双调蛋白(AREG)的基因和GTP酶IMAP家族成员5(GIMAP5)的基因组成的组。

本发明还提供了一种评定具有肝硬化的受试者发展成肝癌的风险的方法。该方法包括确定获自受试者的样品中至少一种标记物基因的基因表达水平，该至少一种标记物基因选自由肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(TNFAIP3)的基因、双调蛋白(AREG)的基因和GTP酶IMAP家族成员5(GIMAP5)的基因组成的组。

本发明进一步提供了一种诊断受试者中的肝癌的方法。该方法包括：确定获自受试者的样品中的至少一种标记物蛋白的存在或量，该至少一种标记物蛋白选自由肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(TNFAIP3，SwissProt登记号：P21580)、双调蛋白(AREG，SwissProt登记号：P15514)和GTP酶IMAP家族成员5(GIMAP5，SwissProt登记号：Q96F15)组成的组。

本发明还提供了一种通过确定至少一种标记物基因的表达水平诊断肝癌的试剂盒，该至少一种标记物基因选自由肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(TNFAIP3)的基因、双调蛋白(AREG)的基因和GTP酶IMAP家族成员5(GIMAP5)的基因组成的组。该试剂盒包括与所述标记物基因的核酸分子的至少一种互补的一个或多个寡核苷酸。

附图说明

当与非限制性的实施例和附图结合考虑时，参考详细描述将能更好地理解本发明，其中：

图1示出了在本发明中使用的研究设计。在中山大学肿瘤防治中心(Sun Yat-senUniversity Cancer Center)、广州第八人民医院(中国)征集的一组28位个体用于初始发现的组中。这28位患者包括10位被诊断患有HCC的患者，12位被诊断患有慢性肝炎的患者和6位健康患者。使用高密度基因微阵列绘制从HCC患者和慢性肝炎患者及健康个体分离的白血球(WBC)中的基因表达图谱。在初始基因筛选之后，在中山大学肿瘤防治中心、广州第八人民医院还征集了一组50位被诊断患有HCC的患者、50位被诊断患有慢性肝炎的患者，这些患者用于建立练习群并且用于开发3-基因逻辑模型。这一模型在60位被诊断患有HBV和HCC的患者及90位患有慢性肝炎的患者(CHB患者)的独立队列中得到了证实，这些患者在新加坡中央医院和新加坡国立癌症中心及中山大学肿瘤防治中心征集。在该研究中总共包含256位个体(250位患有HCC或CHB的患者、6位健康个体)。除了健康对照之外，所有患者对乙型肝炎病毒的表面抗原都是阳性的(HBsAg阳性)。

图2示出了研究参与者的临床特征，其中图2A在表1中示出了在广州中山大学肿瘤防治中心征集的患者的临床特征，并且图2A在表2b中示出了在新加坡中央医院和新加坡国立癌症中心征集的患者的临床特征。来自广州的75位患者被诊断患有HCC并且128位是慢性肝炎患者，而来自新加坡的35位患者被诊断患有HCC并且12位是慢性肝炎患者。

图3在表3(图3A)中示出了在本发明的练习组中鉴定出的9种显著性基因的差异性表达和诊断特性(表3)。该练习组(练习群)包含50位被诊断患有HCC的患者和50位被诊断患有慢性肝炎的患者。图3B示出了标记物TNFAIP3(曲线(a))、双调蛋白(AREG)基因(曲线(b))、NFKB1A(曲线(c))、NFKB1Z(曲线(d))和CD83(曲线(e))的曲线下面积(ROC)。图3C示出了标记物GTP酶IMAP家族成员6(GIMAP6)(曲线(a))、GTP酶IMAP家族成员4(GIMAP4)(曲线(b))、GTP酶IMAP家族成员5(GIMAP5)的基因(曲线(d))和GTP酶IMAP家族成员8(GIMAP8)(曲线(e))的ROC。图3A和图3B中的曲线下面积(AUC)以95％的置信区间示出。

图4示出了在练习组(图4A)和测试组(图4B)中的不同标记物模型的ROC(接受者工作特征)曲线分析。更详细地讲，示出了用于单独的肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(TNFAIP3)的基因(曲线(a))的ROC曲线分析，或用于TNFAIP3与双调蛋白(AREG)的基因和GTP酶IMAP家族成员5(GIMAP5)的基因组合(曲线(b))的ROC曲线分析。图4中的曲线下面积(AUC)以95％的置信区间示出。通过逐步逻辑回归(正演法(forward method))开发模型。由优势比计算是HCC的概率，并且以0至1范围内的得分给出该是HCC的概率。

图5示出了在不同的截止点(cutoff point)，来自练习组和测试组的用于单独的TNFAIP3基因或用于TNFAIP3基因与AREG基因和GIMAP5基因组合的ROC分析的敏感度(真阳性率(TPR))和特异性(1-假阳性率(FPR))在55％至92％之间。

图6示出了在104位HCC患者和108位CHB患者中，对单独的TNFAIP3基因(曲线(a))或TNFAIP3基因、AREG基因和GIMAP5基因的组合(曲线(b))，以及血清AFP(曲线(c))的ROC曲线分析。

图7示出了在14位已经被诊断患有巴塞罗那临床肝癌(BCLC)A期HCC的患者和140位CHB患者中，与血清AFP(曲线(c))的ROC曲线分析相比，单独的TNFAIP3基因(曲线(a))或TNFAIP3基因、AREG基因和GIMAP5基因的组合(曲线(b))的ROC曲线分析。

图8示出了三对比较的维恩图。候选基因标记物选自与CHB和健康受试者(阴影区域)相比，在HCC中差异性表达的那些基因。

图9示出了9种基因的差异性基因表达，这9种基因如基因微阵列分析鉴定的，在HCC和CHB中显著性表达。这些基因是TNFAIP3、AREG、GIMAP5、B细胞κ轻链多肽基因增强子核因子抑制因子α(NFKBIA)、B细胞κ轻链多肽基因增强子核因子抑制因子ζ(NFKBIZ)、CD83、GTP酶IMAP家族成员4(GIMAP4)、GTP酶IMAP家族成员6(GIMAP6)和GTP酶IMAP家族成员8(GIMAP8)。

图10示出了在练习群中，通过q-PCR证实的(HCC患者数n＝50；CHB患者数n＝50；健康患者数n＝6)9种WBC基因标记物(TNFAIP3、AREG、GIMAP6、NFKBIA、NFKBIZ、CD83、GIMAP4、GIMAP5和GIMAP8)的差异性表达。基因表达水平相对于CD45(作为参照基因)的表达水平进行标准化，并且表示为CD45表达水平的百分比。方框指25％和75％，同时线指示中间值。触须线(whisker)表示最小值和最大值。进行曼-惠特尼检验以确定显著性。

图11示出了引物，这些引物用于通过定量PCR证实鉴定出的9种基因标记物(TNFAIP3、AREG、GIMAP6、NFKBIA、NFKBIZ、CD83、GIMAP4、GIMAP5和GIMAP8)。

具体实施方式

本发明提供了一种敏感而且还具有特异性的方法，该方法在患者没有表现出HCC的任何症状的时间点，进行肝癌(诸如肝细胞癌(HCC))的早期诊断。因此，本申请还提供了一种方法，该方法能够更准确地评定具有肝癌(诸如HCC)的疾病发生或复发的不同风险的患者，并对这些患者进行归类。此外，本发明提供了一种评定具有肝硬化的受试者发展成肝癌(诸如HCC)的风险的方法，并且因此提供了比目前使用的方法(诸如超声或血清α-胎蛋白(AFP)水平的确定)更显著的临床益处。因此，本发明的方法非常有利于HCC的临床管理，包括对具有发展成严重HCC的风险或具有发展成严重HCC的诱因的患者进行风险管理和监控。

本发明基于如下的发现：免疫系统在肿瘤发展的不同时期都起到重要作用，并且肿瘤的显现可能在白细胞/白血球(WBC)中产生可检测的基因表达图谱的变化。已经在HCC患者的非肿瘤肝组织中鉴定出了与免疫应答相关的基因标志(gene signature)，以预测转移(Budhu et al,Cancer Cell(2006)Aug；10(2):99-111)。在本发明中，发明人使用了高密度基因微阵列，以绘制从感染有乙型肝炎(HBV)且患有HCC的患者(HBV+HCC患者)、患有慢性乙型肝炎的患者((CHB)患者)和健康个体分离的WBC中的基因表达图谱。

在第一方面，本发明涉及一种诊断受试者中的肝癌的方法。该方法包括确定获自受试者的样品中的至少一种标记物基因的基因表达水平，该至少一种标记物基因选自由肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(TNFAIP3)的基因、双调蛋白的基因和GTP酶IMAP家族成员5(GIMAP5)的基因组成的组。

肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3的基因、双调蛋白的基因和GTP酶IMAP家族成员5的缩写TNFAIP3、AREG和GIMAP5是HUGO基因命名委员会(HGNC)数据库认可的符号，并且因此以它们在本领域内所接受且理解的含义用于本文中。

在本发明中使用的TNFAIP3基因的HGNC数据库标识符是11896，Entrez基因数据库标识符是7128。在本文中提到的TNFAIP3基因被鉴定为其表达被肿瘤坏死因子(TNF)快速诱导的基因。由该基因编码的蛋白是长度为790个氨基酸的锌指蛋白(UniProtKB登录号：TNAP3_HUMAN，瑞士蛋白质序列数据库(Swiss Prot)登录号：P21580，SEQ ID NO:19)，并且已经示出抑制NF-κB的活化以及TNF介导的凋亡。对小鼠中的类似基因的敲除研究表明，该基因在通过终止TNF诱导的NF-κB应答来限制炎症中起到关键作用。

如在本发明中使用的AREG基因的HGNC数据库标识符是651，Entrez基因数据库标识符是7128。还已知由AREG基因编码的蛋白为表皮生长因子家族的成员，该长度为252个氨基酸的蛋白(UniProtKB:AREG_HUMAN,Swiss Prot登录号P15514,SEQ ID NO:20)是星形胶质细胞、施旺细胞(Schwann cell)和成纤维细胞的自分泌生长因子以及促分裂原。它与表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGF-α)有关。该蛋白与EGF/TGF-α受体相互作用，以促进正常表皮细胞的生长并且抑制特定的有侵略性的癌细胞系的生长。该编码的蛋白与牛皮癣样皮肤表型相关联。

在本发明中使用的GIMAP5基因的HGNC数据库标识符为18005，Entrez基因数据库标识符是55340。GIMAP5基因编码长度为408个氨基酸的蛋白(UniProtKB:Q96F15,SwissProt登录号:Q96F15,SEQ ID NO:21)，该长度为408个氨基酸的蛋白属于GTP结合超家族，并且属于核苷酸结合蛋白的免疫相关核苷酸(IAN)超家族。在人类中，IAN超家族基因位于7q36.1处的基因簇中。已经发现了该基因的两种转录变体，一种为编码蛋白的转录变体(Q96F15-1)，而另一种可能为非编码蛋白的转录变体(Q96F15-2)。两种转录本(基因变体)的应用都在本发明的范围内。

该检测肝癌的方法的一个实施方式包括同时确定选自由TNFAIP3基因、AREG基因和GIMAP5基因组成的组中的标记物基因中的至少两种的表达水平，这意味着以下基因的表达水平：a)TNFAIP3基因和AREG基因，或b)TNFAIP3基因和GIMAP5基因，或c)AREG基因和GIMAP5基因。在进一步的实施方式中，该方法包括确定TNFAIP3基因、AREG基因和GIMAP5基因中的全部三种基因的表达水平。

除了这三种标记物基因之外，检测肝癌的方法可以包括检测以下六种标记物中的一种或多种：B细胞κ轻链多肽基因增强子核因子抑制因子α(NFKBIA)、B细胞κ轻链多肽基因增强子核因子抑制因子ζ(NFKBIZ)、CD83、GTP酶IMAP家族成员4(GIMAP4)、GTP酶IMAP家族成员6(GIMAP6)和GTP酶IMAP家族成员8(GIMAP8)。在这些实施方式中，TNFAIP3基因、AREG基因和GIMAP5基因中的一种、两种或全部三种可以与选自NFKBIA、NFKBIZ、CD83、GIMAP4、GIMAP5和GIMAP8的组中的一种、两种、三种、四种、五种或全部六种标记物基因一起使用。在这一方面，应注意本发明还涵盖将选自由B细胞κ轻链多肽基因增强子核因子抑制因子α(NFKBIA)、B细胞κ轻链多肽基因增强子核因子抑制因子ζ(NFKBIZ)、CD83、GTP酶IMAP家族成员4(GIMAP4)、GTP酶IMAP家族成员6(GIMAP6)和GTP酶IMAP家族成员8(GIMAP8)组成的组中的任何标记物基因单独用于诊断肝癌(诸如HCC等)。

在这一方面，应注意，感兴趣的基因的表达水平可以是被下调的或被上调的。例如，在本发明中已经发现：在本发明中使用的五种基因(TNFAIP3、AREG、NFKBIA、NFKBIZ、CD83)在HCC中的表达水平高于对照中的表达水平，而本发明使用的来自GIMAP家族的四种基因(GIMAP4、GIMAP5、GIMAP6和GIMAP8)在HCC中的表达水平低于对照的表达水平。如在本文中使用的，术语“确定表达水平”通常指确定在获自受试者的样品中感兴趣的基因的各mRNA的量。可以使用本领域技术人员可用且公知的任何方法确定表达水平。例如，可以从受试者的样品中分离mRNA，并且使用市场上可买到的试剂盒将分离的mRNA反转录成cDNA，其中市场上可买到的试剂盒诸如但并不限于

III第一链合成系统(Invitrogen,USA)。因此，可以通过核酸扩增的方法检验如此获得的cDNA(或其一部分)，其中核酸扩增的方法诸如但并不限于实时PCR、定量PCR、恒温核酸扩增或连接酶链式反应(LCR)，这仅列举了很少的几种。

确定表达水平可包括使用在受试者样品中组成性表达的参照基因。该确定还可包括将表达水平与表达感兴趣的基因的对照样品进行对比。可以定性地进行表达水平的确定，这意味着可以仅确定基因产物的存在或不存在；或者可以定量地进行表达水平的确定，这意味着可以确定表达产物(相对于对照样品)的总量。

本发明的方法可以用于诊断起源于肝脏的任何形式的肝癌(肝脏癌症(hepaticcancer))。“肝癌”指在肝脏表面或内部生长的恶性肿瘤。肝癌例如可以是肝细胞癌(HCC)，或其由HCC和胆管癌(胆道癌)组分组成的变体形式。肝癌还可以是肉瘤、肝母细胞瘤或间叶组织癌。

本文公开的诊断方法可以应用于任何受试者，典型地应用于包括人类的任何哺乳动物。本发明的方法的一个显著优点在于：即使是在受试者/人类没有表现出肝癌(诸如HCC)症状时的疾病发展早期，它也是敏感且特异性的。相应地，本发明还在患者管理中构成显著性优势，因为本发明允许在患者还没有症状(asymptotic)时就对患者进行监控，并且还可能对患者进行治疗。因此，本发明允许对具有发展成HCC的高风险的患者进行监控，该患者诸如为患有慢性乙型肝炎(CHB)的患者或者同时患有慢性乙型肝炎和肝硬化的患者。因为早期HCC的远距离手术(far surgery)是仅有的治疗方法，所以本申请还允许在非常早的时期就识别出HCC的发生/发展，并且因此增加了HCC患者的存活率和治愈率。测量肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(TNFAIP3)的基因、双调蛋白(AREG)的基因和GTP酶IMAP家族成员5(GIMAP5)的基因中的至少一种的基因表达水平的方法，或者测量这三种蛋白(TNFAIP3、AREG或GIMAP5)中的至少一种的存在或量的方法还能够用于监控已经经历了手术治疗的患者，以检查HCC的复发。

如上所述，在本发明的方法中，获自受试者的样品中的已确定的表达水平可以与对照样品进行对比。因此，相对于对照样品，在感兴趣的受试者/患者的样品中增加的表达水平指示具有发展成肝癌(诸如HCC)的风险。

本发明的方法的又一优点在于，它允许将患有HCC或具有发展成HCC的风险的受试者与患有慢性乙型肝炎的受试者区分开(参见实验部分，图6和图7)。目前，很难进行这种区分。在当时区分的HCC可能是巴塞罗那临床肝癌(BCLC)A期的HCC。本发明的方法还允许对患有肝硬化的患者进行风险评定或诊断，并且因此允许确定该肝硬化是否与肝癌(诸如HCC)或例如乙型肝炎相关。区分这两类患者群的能力是本发明的另一显著优点。

如本文所述的诊断能够使用来自患者的任何适当的躯体或组织样品进行，包括实体样品(诸如组织)或体液。样品可以有利地包括，或者是血细胞(诸如外周血单核细胞(PBMC))或肝脏组织。血细胞典型地是白细胞。

与上述一致的是，本发明还提供了一种评定具有肝硬化的受试者发展成肝癌的风险的方法。该方法包括确定获自受试者的样品中的至少一种标记物基因的基因表达水平，该至少一种标记物基因选自由肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(TNFAIP3)的基因、双调蛋白(AREG)的基因和GTP酶IMAP家族成员5(GIMAP5)的基因组成的组。在这一方面，肝癌还可以是肝细胞癌(HCC)，并且受试者/患者在测试时可以还没有表现出HCC的症状。

作为确定一种或多种基因的表达水平的选择之一，该一种或多种基因已经在本文被鉴定为诊断受试者中的肝癌的标记物，本发明还涵盖了：在获自受试者的样品中，确定由本文所鉴定的基因中的一种所编码的至少一种标记物蛋白的存在或量。因此，本发明还涉及确定选自由肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(TNFAIP3，SwissProt登记号：P21580)、双调蛋白(AREG，SwissProt登记号：P15514)和GTP酶IMAP家族成员5(GIMAP5，SwissProt登记号：Q96F15)组成的组中的至少一种标记物蛋白的存在。在该方法的实施方式中，确定这三种蛋白中的两种蛋白的存在或量，或者确定所有三种蛋白的存在或量。该方法能够用于诊断上面提到的任何肝癌，其中HCC是最优选的癌症。

这种诊断肝癌的方法的其它实施方式可以包括确定以下六种标记物蛋白中的一种或多种的存在或量：B细胞κ轻链多肽基因增强子核因子抑制因子α(NFKBIA)、B细胞κ轻链多肽基因增强子核因子抑制因子ζ(NFKBIZ)、CD83、GTP酶IMAP家族成员4(GIMAP4)、GTP酶IMAP家族成员6(GIMAP6)和GTP酶IMAP家族成员8(GIMAP8)。在这些实施方式中，TNFAIP3基因、AREG基因和GIMAP5基因中的一种、两种或全部三种可以与选自NFKBIA、(NFKBIZ)、CD83、GIMAP4、GIMAP6和GIMAP8组中的一种、两种、三种、四种或全部这五种标记物基因一起使用。在这一方面，应注意，本发明还涵盖选自由B细胞κ轻链多肽基因增强子核因子抑制因子α(NFKBIA)、B细胞κ轻链多肽基因增强子核因子抑制因子ζ(NFKBIZ)、CD83、GTP酶IMAP家族成员4(GIMAP4)、GTP酶IMAP家族成员6(GIMAP6)和GTP酶IMAP家族成员8(GIMAP8)组成的组中的任何标记物基因在诊断肝癌(诸如HCC)中的单独应用。

本发明还涉及一种通过确定至少一种标记物基因的表达水平诊断肝癌的试剂盒，该至少一种标记物基因选自由肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(TNFAIP3)的基因、双调蛋白(AREG)的基因和GTP酶IMAP家族成员5(GIMAP5)的基因组成的组。该试剂盒包括与所述标记物基因核酸分子的至少一种互补的一个或多个寡核苷酸。该试剂盒可以包括两种类型的一个或多个寡核苷酸，其中，每一种类型的寡核苷酸都与至少两种标记物基因核酸分子中的一种互补。试剂盒还可以包括三种类型的一个或多个寡核苷酸，其中，每一种类型的寡核苷酸都与三种标记物基因核酸分子中的一种互补(参考实验部分，或示出用于扩增和量化本文鉴定出的九种基因标记物的适当寡核苷酸的图11)。上述寡核苷酸通常是寡核苷酸探针(诸如扩增引物/探针)，该寡核苷酸探针例如能够用于在从要进行检查的受试者样品分离的总mRNA转录之后，扩增各标记物基因。因此，这样的扩增引物适于在扩增步骤中扩增标记物的核酸分子。因为，已知在本发明鉴定出的标记物基因为标记物基因，因此设计适当的扩增引物在本领域技术人员的知识范围内。试剂盒中使用的寡核苷酸能够具有任何长度，例如长度能够为至多约30个、约60个或约100个核苷酸。这些寡核苷酸(探针)还能够是添加有标签的，例如以允许对感兴趣的标记物基因进行实时PCR或定量。标签例如可以是放射性标签、荧光标签、化学发光标签、亲和标签(例如，用于将寡核苷酸固定在多相检验模式的固相上)或酶标签。亲和标签可以是在检测核酸中通常使用的试剂。这样的试剂的实例包括但并不限于生物素或地高辛。基因表达(水平)能够通过任何适当的可用的方法来确定，并且例如能够使用市场上可买到的系统来进行，诸如通常用于测试、验证和量化疾病生物标记物的Affymetrix QuantiGene Plex 2.0(Affymetrix,圣克拉拉(Santa Clara),CA,USA)。使用这样的检验，通过倍增同时分析3种至80种标记物基因的基因表达目前都是可能的。简单来讲，在这样的检验中，将组织或躯体样品(例如PBMC)裂解以释放RNA，并且与固体载体(诸如磁珠)接触，在该固体载体上固定有对感兴趣的基因具有特异性的一组探针。经纯化的RNA样品孵育适当的时间段(诸如24小时)，以使各探针与感兴趣的标记物基因的RNA杂交。在目标杂交之后，使用分支DNA(bDNA)技术实现信号扩增(详情例如参见QuantiGene Plex2.0的产品说明)。最后，添加检测化合物，该检测化合物产生与样品中存在的目标RNA的量成比例的信号，并且使用各种读出器(诸如冷光读出器或荧光读出器)读出光学信号。

如果要确定本文鉴定出的标记物蛋白的一种或多种的存在或量，则使用任何检验方法进行该确定，其中上述检验方法被设置用于检测获自受试者的样品中(诸如组织或体液样品)的一种或多种蛋白，以提供检验结果。该检验可以是免疫检验(诸如ELISA)，该免疫检验能够使用针对感兴趣的蛋白，例如TNFAIP3、双调蛋白AREG和GTP酶IMAP家族成员5(GIMAP5)的多克隆抗体或单克隆抗体。通常，免疫检验包括使含有或被怀疑含有感兴趣的蛋白(标记物)的样品与特异性结合该蛋白(标记物)的至少一种抗体接触。然后产生信号，该信号指示通过样品中的多肽与抗体结合形成的复合物的存在或量。然后，该信号与样品中的生物标记物的存在或量相关。对于技术人员来说，用于生物标记物的检测和分析的很多方法和装置是公知的。例如参见美国专利6,143,576、6,113,855、6,019,944、5,985,579、5,947,124、5,939,272、5,922,615、5,885,527、5,851,776、5,824,799、5,679,526、5,525,524和5,480,792，以及免疫检验手册(David Wild,编辑，斯托克顿出版社(StocktonPress),纽约,1994)，其中的每一份参考文件都通过引用整体(包括所有的表格、图和权利要求)并入本文中。

在本领域已知的检验装置和方法能够在各种三明治、竞争或非竞争的检验模式中利用添加有标签的分子，以产生与感兴趣的蛋白的存在或量相关的信号，该感兴趣的蛋白在此意味着TNFAIP3、AREG和GIMAP5中的至少一种。针对TNFAIP3、双调蛋白AREG和GTP酶IMAP家族成员5(GIMAP5)的单克隆抗体和多克隆抗体是可以从多种来源购买得到。参见仅为例示的实例：蛋白科技集团有限公司(Proteintech Group,Inc.，芝加哥,IL,USA)多克隆TNFAIP3兔抗体(货号：23456-1-AP)，Pierce(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific),罗克兰(Rockland),IL,USA)双调蛋白多克隆抗体(货号PA5-16616)，SantaCruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz,CA,USA)单克隆小鼠GIMAP5抗体(E-11)(货号sc-377307)。可选择地，这些抗体能够通过免疫获得，或来自使用重组抗体工程技术(演化法)(诸如噬菌体展示)获得的人工抗体库。

感兴趣的蛋白的存在或量还可以通过除了免疫检验之外的其它手段来确定，该其它手段包括蛋白测量(诸如斑点印迹、蛋白印迹(western blot)、色谱法、质谱法等)。

实施例

材料和方法

患者

在新加坡国立癌症中心(NCCS)征集具有初级HCC的患者进行诊断。在中山大学肿瘤防治中心肝胆肿瘤科也收集了一些HCC血液样品。还在具有慢性肝炎和肝硬化(CHB)和HCC的患者拜访新加坡中央医院肠胃科诊所的过程中的不同时间，征集了他们的血液样品。所有样品都是通过各机构审查委员会认可的方案收集的，并且在收集血液样品之前从所有受试者都获得了知情同意书。所有健康的参与者都是NCCS的没有肝病史、没有病毒性肝炎且没有恶性疾病的职员，并且在口头知情同意之后收集了血液样品。将总共10ml的血液收集到BD

加塑料(Plus Plastic)K2EDTA管(Becton-Dickinson)中。

根据AASLD准则(Bruix&Sherman,2011,上述)，通过组织学评价或双动态成像检验，进行HCC的诊断。在进行任何治疗之前都收集血液样品。排除具有任何伴随疾病的患者。

对于慢性乙型肝炎(CHB)患者，AASLD实践准则用作入选标准，包括HBsAg阳性>6个月；HBV DNA>10³个拷贝/ml(对于HBeAg阴性的情况为10⁴～10⁵个拷贝/ml)，并且血清中存在天冬氨酸转氨酶/丙氨酸转氨酶(ALT/AST)的持续或间歇性升高。排除具有任何伴随疾病的患者。

肝硬化的诊断基于成像证据，并且在登记之前至少3个月没有肝脏肿块的证据。

肝脏样品

从经历了作为HCC的治愈性治疗的部分肝切除术的患者，获得癌性肝脏组织和对应的远侧非癌性肝脏组织。研究的所有癌性组织至少70％是癌性的。在本研究中使用的所有组织样品都是经新加坡国立癌症中心(NCCS)的组织储存库按照它的伦理委员会的政策认可并提供的。从所有参与的患者都获得了知情同意书，并且提供给研究者的所有临床和组织病理学数据都是匿名给予的。

白血球的分离

在收集6小时内，使用Ficoll-Paque PLUS(GE健康(GE Healthcare))进行密度梯度离心来处理血液。Ficoll-Paque PLUS是每100ml含有5.7g Ficoll 400和9g泛影钠(sodium diatrizoate)与0.0231g乙二胺四乙酸二钠钙、密度为1.077+0.001g/ml的水溶液。剩余的红血球在1ml RBC裂解缓冲液(BioLegend)中裂解5min，然后使用10ml磷酸盐缓冲盐水进行冲洗。在进行测试之前，将分离的PBMC储存在-80℃。对其PBMC样品进行研究的患者的临床特征总结在表1和表2中。

RNA提取和昂飞(Affymetrix)基因芯片分析

使用TRIzol试剂(Invitrogen,USA)从WBC提取总的RNA，并且在ND-1000Nano-drop分光光度计(Thermo Scientific,USA)上对提取的总的RNA进行定量。通过Agilent 2100生物分析仪(Agilent,USA)对RNA的完整性进行评定。仅RNA完整性指数(RIN)大于6.7的那些RNA样品用于之前在“用于使用寡核苷酸阵列进行基因表达测量的生物素标记的RNA的合成”中描述的基因微阵列(Ana E.Vázquez,Liping Nie,and Ebenezer N.Yamoah.MethodsMol.Biol.2009；493:21)。如之前所述(Wang SM,Ooi LL,Hui KM.Identification andvalidation of a novel gene signature associated with the recurrence of humanhepatocellular carcinoma.Clin Cancer Res 2007；13:6275-83,,Liu BH,Goh CH,OoiLL,Hui KM.Oncogene.2008Jul 3；27(29):4128-36“Identification of unique andcommon low abundance tumour-specific transcripts by suppression subtractivehybridization and oligonucleotide probe array analysis”)，获得的最终cRNA与基因芯片人类基因组U133加(GeneChip Human Genome U133Plus)2.0阵列(Affymetrix,USA)杂交。使用Partek基因组学套件(Partek Genomics Suite)软件包(Partek,USA)改善由Affymetrix微阵列套件版本5.0生成的cel文件格式的所有数据。

定量PCR和多样的基因表达分析

进行定量PCR(q-PCR)，以验证从基因微阵列鉴定出的9种候选基因。在图11中描述了用于扩增鉴定出的基因的引物，并且还示于下表中。

使用

III第一链合成系统(Invitrogen,USA)将500ng总RNA反转录成cDNA，并且使用SsoFast EvaGreen Supermix(Bio-Rad,USA)通过实时PCR对四十分之一的cDNA进行后续检验。使用比较循环阈值(Ct)方法，并且将候选基因的表达水平相对于CD45的表达水平进行了标准化，并且在后续的分析中使用-ΔΔCt。测试候选基因和参照基因的PRC反应效率为>90％。

统计学分析

血清AFP是HCC筛选和诊断最常使用的血清学标记物，具有52％的总敏感度和80％的特异性(Daniele et al,Gastroenterology.2004,上述)。在使用50位HCC患者和50位CHB患者的较小组的练习群中，鉴定出的基因标记物表现出大于92％的敏感度和大于96％的特异性。因此，设计练习群/研究，以使鉴定出的基因标记物的敏感度与AFP的敏感度进行对比，以使HCC患者与CHB患者区分开。需要109位患者(50位HCC和59位CHB)的样品量，以实现具有5％的单侧一型误差的90％的功效(参考《用于临床研究的样品量的表(Sample SizeTables for Clinical Studies)》,第三版,David Machin,Michael J.Campbell,Say-engTan,Sze-Huey Tan,ISBN:978-1-4051-4650-0.)。使用软件“用于临床研究的样品量的表软件程序版本1.0(Sample Size Tables for Clinical Studies Software ProgramVersion 1.0)”进行分析。

从定量聚合酶链式反应确定的练习样品中获得的数据用于使用正演逐步法逻辑回归构建模型。使用逻辑回归模型计算为HCC的概率，并且给出从0至1范围内的得分。HCC概率得分用于生成受试者工作特征(ROC)曲线。计算曲线下的面积(AUC)。从来自练习样品组的ROC曲线选择在不同截止点处的敏感度和特异性。

使用程序

统计学18(SPSS Inc.,芝加哥,IL,USA)生成ROC曲线、逻辑回归和统计学分析。学生t检验或惠特尼U检验用于对比连续的变数，并且卡方检验用于分类变数。AUC、敏感度和特异性的置信区间为95％。

患者特征的结果

在四所不同医院中征集具有HCC或CHB的患者。将他们的特征信息列在表1和表2中。

使用基因微阵列选择候选WBC基因标记物

使用高密度Affymetrix GeneChip Human Genome U133Plus2.0阵列，从外周血WBC中筛选潜在的基因标记物。在该初始筛选步骤中使用来自28个样品(10位HCC，12位CHB和6位健康患者)的总的RNA提取物(参考图1)。在HCC的受试者中与CHB的受试者和健康的受试者相比差异性表达的那些基因中选择候选基因标记物(图10)。在选择获选基因标记物时考虑了几种因素：倍数变化(对于上调的基因>1.5，对于下调的基因<-1.5)，p-值(<0.0003)。根据这些标准，最终选择出9种基因用于通过定量PCR(qPCR)的进一步证实。

通过q-PCR证实候选WBC基因的表达

在由56份样品组成的组中，通过q-PCR评价17种候选基因的表达水平，该56份样品的组包括在微阵列筛选中使用的26份样品和额外的30份样品(15位HCC和15位CHB)。在17种候选基因中，在HCC的受试者中有9种基因示出了与CHB的受试者和健康的受试者相比具有显著不同的表达水平(图10)。在表2中示出了5种上调基因和4种下调基因的ROC曲线分析。10种预测因子(predictor)都具有大于0.7的AUC，而TNFAIP3是最强有力的预测因子(AUC0.943)。HCC中的五种基因(TNFAIP3、AREG、NFKBIA、NFKBIZ、CD83)具有比对照高的表达水平，具有从2.8至8.2的范围内的倍数变化。HCC中来自GIMAP家族的四种基因(GIMAP4、GIMAP5、GIMAP6和GIMAP8)具有比对照低的表达水平，具有从1.9至2.4范围内的程度较低的倍数变化(图9)。将该组中的这9种显著性基因的qPCR数据用作练习数据组，以开发联合个体基因的辨别力的模型。

模型开发和WBC基因标记物的选择

因为一些显著性基因在相同的信号传导通路中，或在相同的基因家族中，因此它们的基因表达可能彼此相关。所以在基因表达数据用于模型开发之前，应用多重共线性检验。该检验示出，TNFAIP3、NFKBIA和NFKBIZ的方差膨胀因子指数(VIF)大于5，这表明存在多重共线性，因为TNFAIP3是最强有力的预测因子，所以从研究组中去除了NFKBIA和NFKBIZ。再次应用多重共线性检验，并且剩余的8种预测因子的VIF小于5，没有检测到多重共线性。使用正演法开发了逐步法逻辑回归模型：

Log(p/(1+p))＝3.462+0.897×AREG+1.570×TNFAIP3-1.769×GIMAP5。

在模型中包括TNFAIP3、AREG和GIMAP5作为独立的预测因子，而另外五种基因似乎是多余的。根据模型，在某一受试者中计算为HCC的概率。类似地，作为对比，基于单一的预测因子TNFAIP3进行逻辑回归(Log(p/(1+p))＝2.812+2.403×TNFAIP3)，并且计算概率得分。

来自两种模型的概率得分都用于生成练习组的ROC曲线(图3A)。单基因模型和3-基因模型都是优异的预测因子(AUC>0.9)，而3-基因模型进一步使AUC增加至0.977。

WBC基因标记物组的证实

在60位HCC患者和90位CHB患者的独立样品组中，证实在练习组中开发的模型。图4B中示出了ROC曲线。与练习组中的AUC相比，测试组中的AUC对于单基因模型略减小至0.891并且对于3-基因模型略减小至0.909。

相应地，在表3中列出了，练习组和测试组中在不同截止点处的敏感度和特异性(图5)。对于单基因模型和3-基因模型，在相同的截止点处，练习组中的敏感度和特异性的总和高于测试组中的敏感度和特异性的总和。在HCC概率得分的较低截止点处(55至70的范围)，两种模型在区分HCC和CHB中表现出类似的效果。然而，在约90的较高截止点处，3-基因模型实现了比单基因模型高的72％的敏感度，其中单基因模型实现了58％的敏感度，而两种模型的特异性都是100％。

此外，因为血清AFP是最常使用的用于HCC诊断和筛选的血清学标记物，因此将血清AFP从CHB中检测HCC的能力与本发明的WBC基因标记物TNFAIP3、AREG和GIMAP5从CHB中检测HCC的能力进行了对比。具有可用AFP数据的总共104位HCC患者和108位CHB患者用于该对比中。ROC曲线分析示出单基因模型和3-基因模型表现出的效果都显著好于AFP(图6)。同时AFP的AUC是0.697，WBC基因标记物的AUC都高于0.94。在用于临床诊断的200ng/ml AFP的截止点(Bruix&Sherman,2011,上述)处，敏感度是43％并且特异性是95％。相比之下，3-基因模型的敏感度是74％并且特异性是99％，并且单基因模型稍微低一些(敏感度为57％，特异性为98％)。

进一步地，应用AFP和本发明的基因标记物TNFAIP3、AREG和GIMAP5将具有巴塞罗那临床肝癌(BCLC)A期的HCC患者(单发结节≤3cm，没有脉管侵润)和CHB患者区分开。与从HCC患者组中得到的结果类似，本发明的基因标记物(AUC大于0.96)表现出的效果好于AFP的效果(图7)。

讨论

目前，AFP是HCC的最常使用的血清学标记物，但具有令人不满意的敏感度和特异性。由于AFP的准确性不够，在2010年出版的美国肝病研究学会(AASLD)实践指南不再推荐AFP作为HCC筛选和诊断的标记物(Bruix&Sherman 2011，如上)。

本发明的目标是从外周血中发现有效的新的标记物，以在早期检测HCC。根据美国国家癌症研究所的早期检测研究网络(EDRN)使用的5-阶段结构，这是用于临床检验开发和证实的第二阶段研究。征集患有慢性乙型肝炎的患者和患有HBV相关的HCC的患者，因为在亚洲，大部分HCC发生在HBV阳性人群中。通过使用综合性基因表达图谱微阵列，在来自HCC患者的WBC中鉴定出候选基因标记物。使用q-PCR证实了候选基因，并且随后用于测量临床样品中的基因表达水平，证实它的简单性和重复性。

在本发明中，通过q-PCR证实了来自17种候选基因中的9种基因，并且使用练习组开发出包括三种基因的逻辑模型。3-基因模型在练习和独立的测试组中都具有优异的诊断准确性(图7)。尽管TNFAIP3单独就能够实现80％的敏感度和88％的特异性，但是当期望高特异性时，3-基因模型能够微调准确性并且得到更高的敏感度(敏感度为85％，特异性为87％)。进一步地，本发明的基因标记物表现出显著好于血清AFP的效果，并且能够将BCLC A期的HCC患者与CHB患者区分开。

在本文中示例性描述的本发明可以适当地在不存在任一元素或任何元素、一种限制或多种限制的情况下实施，并不局限为本文公开的内容。因此，例如术语“包括”、“包含”、“含有”等应被理解为开放式，且没有限制。此外，本文中使用的术语和表述已经被用作说明书的术语且没有限制，并且在使用这样的术语或表述时不意于排除示出和描述的特征及其部分的任何等价物，但应认识到各种改变都可能在本发明要求保护的范围内。因此，应理解，尽管已经通过示例实施方式和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以得到本文中具体示出的本发明的改变和变化，并且这样的改变和变化都被考虑在本发明的范围内。

在此，已经概括性地并一般性地描述了本发明。落入本一般公开的每一种较小类型和亚基因分组也形成本发明的一部分。这包含本发明的一般描述，前提或消极限制是从种中去除任何主题，而不管是否在本文中具体记载了离体材料。

其它实施方式在下面的权利要求书的范围内。此外，当按照马库什组描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员应认识到，还按照马库什组的任何个体成员或成员的亚组描述了本发明。

Claims

1.试剂在制造用于诊断受试者中的肝癌的诊断组合物中的应用，该应用包括确定获自该受试者的样品中，选自由肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3的基因、双调蛋白的基因和GTP酶IMAP家族成员5的基因组成的组中的所有三种标记物基因的基因表达水平，其中所述样品是血细胞，且其中，所述应用进一步包括，

通过以下方式将所述三种标记物基因的基因表达水平与受试者中肝癌的存在相关联：

比较每种基因的表达水平与对应的阈值表达水平，其中，

当所述标记物基因是肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3的基因或双调蛋白的基因时，如果所述标记物基因的表达水平高于所述对应的阈值表达水平，则认为所述标记物基因对于肝癌是阳性的，

当所述标记物基因是GTP酶IMAP家族成员5的基因时，如果所述标记物基因的表达水平低于所述对应的阈值表达水平，则认为所述标记物基因对于肝癌是阳性的。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述肝癌是肝细胞癌。

3.根据前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述受试者是人类。

4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述人类没有表现出肝细胞癌的症状。

5.根据权利要求3所述的应用，包括将患有肝细胞癌的受试者与患有慢性乙型肝炎的受试者区分开。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述肝细胞癌是巴塞罗那临床肝癌A期的肝细胞癌。

7.根据权利要求3所述的应用，其中，所述人类具有肝硬化。

8.根据权利要求1所述的应用，其中，所述血细胞是白细胞。

9.根据权利要求1或2所述的应用，其中，确定所述基因表达水平使用核酸扩增测定来进行。

10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述扩增测定是定量PCR测定或实时PCR测定。

11.试剂在制造用于评定具有肝硬化的受试者发展成肝癌的风险的诊断组合物中的应用，该应用包括确定获自受试者的样品中，选自由肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3的基因、双调蛋白的基因和GTP酶IMAP家族成员5的基因组成的组中的所有三种标记物基因的基因表达水平，其中所述样品是血细胞，且其中，所述应用进一步包括，

比较每种基因的表达水平与对应的阈值表达水平，其中，

12.根据权利要求11所述的应用，其中，所述肝癌是肝细胞癌。

13.根据权利要求11或12所述的应用，其中，所述受试者是人类。

14.根据权利要求13所述的应用，其中，所述人类没有表现出肝细胞癌的症状。

15.试剂在制造用于诊断受试者中的肝癌的诊断组合物中的应用，该应用包括确定获自受试者的血液样品中，选自由SwissProt登录号为P21580的肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3、SwissProt登录号为P15514的双调蛋白和SwissProt登录号为Q96F15的GTP酶IMAP家族成员5组成的组中的所有三种标记物蛋白的存在或量，且其中，所述应用进一步包括，

通过以下方式将所述三种标记物蛋白的量与受试者中肝癌的存在相关联：

比较每种蛋白的量与对应的阈值水平，其中，

当所述标记物蛋白是肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3或双调蛋白时，如果所述标记物蛋白的量高于所述对应的阈值水平，则认为所述标记物蛋白对于肝癌是阳性的，

当所述标记物蛋白是GTP酶IMAP家族成员5时，如果所述标记物蛋白的量低于所述对应的阈值水平，则认为所述标记物蛋白对于肝癌是阳性的。