JP2015530094A - 対象の肝臓癌を診断する方法及び肝臓癌を診断するためのキット - Google Patents

Abstract

対象の肝臓癌を診断する方法並びに慢性肝炎及び肝硬変を有する対象が肝臓癌を発症する危険性を評価する方法を開示する。肝臓癌を診断するためのキットも開示する。

Description

（関連出願の相互参照）
本発明は、「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＤＩＡＧＮＯＳＩＮＧ ＬＩＶＥＲ ＣＡＮＣＥＲ ＩＮ Ａ ＳＵＢＪＥＣＴ ＡＮＤ Ａ ＫＩＴ ＦＯＲ ＤＩＡＧＮＯＳＩＮＧ ＬＩＶＥＲ ＣＡＮＣＥＲ」と題された２０１２年９月２１日に出願された米国特許仮出願第６１／７０４，４２５号明細書の優先権の利益を主張し、すべての目的のために、その全開示を参照により本明細書に完全に組み込む。

本発明の主張は、対象の肝臓癌を診断する方法及び肝硬変を有する対象が肝臓癌を発症する危険性を評価する方法に関する。本発明は、肝臓癌を診断するためのキットにも関する。

肝細胞癌（ＨＣＣ）は世界的に最も一般的な癌の１つであり、癌死の３番目によくある原因であり、年間発生率は世界的に５０万症例を超える（例えば、非特許文献１および２参照）。診断が遅れる結果、ＨＣＣ患者の転帰は悪いままである。現在、血清α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベル及び超音波検査が、ＨＣＣのスクリーニング及び診断に一般に使用されている。しかし、このアプローチの臨床的有用性は、いくつかの理由により限られている。第一に、ＡＦＰはすべてのＨＣＣ患者で高まるわけではなく、慢性の肝臓疾患によって高まる可能性があり、これによって、感度及び特異性が不十分になる。２０ｎｇ／ｍｌのカットオフ値では、感度は、様々な研究によって報告されたように４１％から６４％までの幅があり、特異性は８０％から９１％までの幅がある（例えば、非特許文献３参照）。２００５年に出版された米国肝臓病学会（ＡＡＳＬＤ）診療ガイドラインによると、感度が２２％であり、特異性が９９％を超える２００ｎｇ／ｍｌが診断上のカットオフポイントであることが推奨された（例えば、非特許文献４、非特許文献５参照）。２０１０年には、最近の研究の結果に基づいて、ＨＣＣ管理に関する２０１０ＡＡＳＬＤガイドラインが、サーベイランスに関して超音波のみを推奨しており、サーベイランス及び診断の両方に関しては、ＡＦＰはもはや含まれない（例えば非特許文献６）。一方では、超音波それ自体に制限がある。大きな異常を有する硬変性肝臓の腫瘍を検出するのは困難である。さらに、その成果は、操作者の機器の経験及び知識に高く依存しており、低開発地域に住む人には利用できない可能性がある。これらの理由から、ＨＣＣのスクリーニング及び診断のためのより信頼できるマーカーを探索するために、多くの労力がつぎ込まれた。

ＨＣＣの理想的なマーカーは、特異的且つ高感度であるべきであり、簡単に入手できる検体に由来する。高密度マイクロアレイ及びプロテオミクスが発達するにつれて、近年、多くの新規なマーカーが同定されている。最初の探索的アプローチの１つは、ＨＣＣ腫瘍組織でのリード物、例えばグリピカン３（ＧＰＣ３）及びゴルジタンパク質７３（ＧＰ７３）を探すこと（例えば、非特許文献７、非特許文献８参照）、及び末梢血におけるその存在をＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットによって検証することである。ある種の研究は、質量分析を使用して血漿中のタンパク質をプロファイリングし、それによってオステオポンチン（ＯＰＮ）などのタンパク質マーカーを同定する（例えば、非特許文献９参照）。他の研究は、マイクロアレイを利用して血漿又は血清由来の核酸をプロファイリングし、それによって遺伝子マーカー又はマイクロＲＮＡマーカーを同定する（例えば、非特許文献１０）。ＨＣＣに対する新規なマーカーの中で、最も広く研究されているマーカーは、デス−γ−カルボキシプロトロンビン（ＤＣＰ）及びＡＦＰのグリコフォーム（ＡＦＰ−Ｌ３）である。ＤＣＰの感度は比較的優れている（７４％）と報告されたが、特異性は不十分である（７０〜８６％）（例えば、非特許文献１１、非特許文献５参照）。ＡＦＰもＤＣＰも、早期ＨＣＣの検出において超音波を補完するのに至適でないという結論に達した（例えば、非特許文献５参照）。

米国特許第６，１４３，５７６号明細書 米国特許第６，１１３，８５５号明細書 米国特許第６，０１９，９４４号明細書 米国特許第５，９８５，５７９号明細書 米国特許第５，９４７，１２４号明細書 米国特許第５，９３９，２７２号明細書 米国特許第５，９２２，６１５号明細書 米国特許第５，８８５，５２７号明細書 米国特許第５，８５１，７７６号明細書 米国特許第５，８２４，７９９号明細書 米国特許第５，６７９，５２６号明細書 米国特許第５，５２５，５２４号明細書 米国特許第５，４８０，７９２号明細書

Ｋａｍａｎｇａｒら（２００６），Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２４，２１３７−５０ Ｂｏｙｌｅ Ｐ．（２００８）．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９：６０５−６０６ Ｄａｎｉｅｌｅら，（２００４）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００４ Ｎｏｖ；１２７（５補遺１）：Ｓ１０８−１２ Ｔｒｅｖｉｓａｎｉら，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ．（２００１）Ａｐｒ；３４（４）：５７０−５ Ｌｏｋら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２０１０）Ｆｅｂ；１３８（２）：４９３−５０２ Ｂｒｕｉｘ＆Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２０１１）Ｍａｒ；５３（３）：１０２０−２２ Ｌｉｕら，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．（２０１０）Ｓｅｐ ２１；１６（３５）：４４１０−５ Ｃａｐｕｒｒｏら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．（２００３）Ｊｕｌ；１２５（１）：８９−９７ Ｓｈａｎｇら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．（２０１２）Ｆｅｂ；５５（２）：４８３−９０ Ｚｈｏｕら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１１ Ｄｅｃ ２０；２９（３６）：４７８１−８． Ｍａｒｅｒｒｏら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．（２００９）Ｊｕｌ；１３７（１）：１１０−８ Ｂｕｄｈｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２００６）Ａｕｇ；１０（２）：９９−１１１ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ編Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４ 「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌａｂｅｌｅｄ ＲＮＡ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｒａｙｓ」．Ａｎａ Ｅ．Ｖａｚｑｕｅｚ，Ｌｉｐｉｎｇ Ｎｉｅ及びＥｂｅｎｅｚｅｒ Ｎ．Ｙａｍｏａｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００９；４９３：２１ Ｗａｎｇ ＳＭ，Ｏｏｉ ＬＬ，Ｈｕｉ ＫＭ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ２００７；１３：６２７５−８３ Ｌｉｕ ＢＨ，Ｇｏｈ ＣＨ，Ｏｏｉ ＬＬ，Ｈｕｉ ＫＭ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００８ Ｊｕｌ ３；２７（２９）：４１２８−３６「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｑｕｅ ａｎｄ ｃｏｍｍｏｎ ｌｏｗ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｔｕｍｏｕｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｂｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅ ａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ」 Ｓａｍｐｌｅ Ｓｉｚｅ Ｔａｂｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ，第３版，Ｄａｖｉｄ Ｍａｃｈｉｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓａｙ−ｅｎｇ Ｔａｎ，Ｓｚｅ−Ｈｕｅｙ Ｔａｎ，ＩＳＢＮ：９７８−１−４０５１−４６５０−０

したがって、ＨＣＣの早期検出に適した新規なマーカーを見つける必要がある。

本発明は、対象の肝臓癌を診断する方法を提供する。この方法は、腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）遺伝子及びＧＴＰアーゼ、ＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５）遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の遺伝子発現レベルを、対象から得られたサンプルにおいて決定することを含む。

本発明はまた、肝硬変を有する対象が肝臓癌を発症する危険性を評価する方法を提供する。この方法は、腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）遺伝子及びＧＴＰアーゼ、ＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５）遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の遺伝子発現レベルを、対象から得られたサンプルにおいて決定することを含む。

本発明はさらに、対象の肝臓癌を診断する方法を提供する。この方法は、腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号：Ｐ２１５８０）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１５５１４）及びＧＴＰアーゼ、ＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９６Ｆ１５）からなる群から選択される少なくとも１つのマーカータンパク質の存在又は量を、対象から得られたサンプルにおいて決定することを含む。

本発明はまた、腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）遺伝子及びＧＴＰアーゼ、ＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５）遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現レベルを決定することによって肝臓癌を診断するためのキットを提供する。このキットは、マーカー遺伝子核酸分子の少なくとも１つに相補的な、１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを含む。

本発明は、非限定例及び添付の図面と併せて考慮する場合、詳細な説明を参照してより良く理解されるであろう。

本発明で使用する研究デザインを示す図である。中山大学癌センター、広州第八人民病院（中国）で動員した一群の２８個体を、最初の発見セットで使用した。これらの２８人の患者は、ＨＣＣと診断された１０人の患者、慢性肝炎と診断された１２人の患者及び６人の健康な患者からなっていた。高密度遺伝子マイクロアレイを使用して、ＨＣＣ患者及び慢性肝炎患者並びに健康な個体から単離した白血球細胞（ＷＢＣ）での遺伝子発現をプロファイリングした。最初の遺伝子スクリーニングの後、同様に中山大学癌センター、広州第八人民病院で動員した、一群のＨＣＣと診断された５０人の患者、慢性肝炎と診断された５０人の患者に基づいて、トレーニングセットを確立し、３遺伝子ロジスティックモデルを開発した。シンガポール総合病院及びシンガポール国立癌センター並びに中山大学癌センターで動員した、ＨＢＶとＨＣＣの両方が診断された６０人の患者及び９０人の慢性肝炎患者（ＣＨＢ患者）の独立したコホートで、このモデルを検証した。全体で２５６個体（ＨＣＣ又はＣＨＢに罹患している２５０人の患者、６人の健康な個体）が、本研究に含まれていた。健康対照者を除いては、すべての患者は、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原に対して陽性であった（ＨＢｓＡｇ陽性）。 研究参加者の臨床特性を示す表である。図２Ａは、表１で、中山大学癌センター、広州で動員した患者の臨床特性を示し、図２Ａは、表２で、シンガポール総合病院及びシンガポール国立癌センターで動員した患者の臨床特性を示す。広州からの７５人の患者はＨＣＣと診断され、１２８人は慢性肝炎患者であり、一方で、シンガポールからの３５人の患者はＨＣＣと診断され、１２人は慢性肝炎患者であった。 表３（図３Ａ）は、本発明のトレーニング群で同定された９つの重要な遺伝子の差次的発現及び診断上の成果を示す表である（表３）。トレーニング群（トレーニングセット）は、ＨＣＣと診断された５０人の患者及び慢性肝炎と診断された５０人の患者を含む。図３Ｂは、マーカーのＴＮＦＡＩＰ３（曲線（ａ））、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）遺伝子（曲線（ｂ））、ＮＦＫＢ１Ａ（曲線（ｃ））、ＮＦＫＢ１Ｚ（曲線（ｄ））及びＣＤ８３（曲線（ｅ））に対する曲線（ＲＯＣ）下面積を示す。図３Ｃは、マーカーのＧＴＰアーゼ、ＩＭＡＰファミリーメンバー６（ＧＩＭＡＰ６）（曲線（ａ））、ＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー４（ＧＩＭＡＰ４）（曲線（ｂ））、ＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５）遺伝子（曲線（ｄ））及びＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー８（ＧＩＭＡＰ８）（曲線（ｅ））に対するＲＯＣを示す。図３Ａ及び３Ｂの曲線下面積（ＡＵＣ）は、９５％信頼区間で示される。 トレーニング群（図４Ａ）及び試験群（図４Ｂ）における異なるマーカーモデルのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線分析を示す図である。より詳細には、腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子単独（曲線（ａ））又はＴＮＦＡＩＰ３とアンフィレグリン（ＡＲＥＧ）遺伝子及びＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５）遺伝子）との組み合わせ（曲線（ｂ））のいずれかに対するＲＯＣ曲線分析を示す。図４の曲線下面積（ＡＵＣ）は、９５％信頼区間で示される。モデルは、段階的ロジスティック回帰分析（前向き方法）によって開発した。ＨＣＣである確率はオッズ比から計算され、０から１までのスコアとして与えられた。 ５５から９２％の間の様々なカットオフポイントでの、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子単独又はＡＲＥＧ遺伝子及びＧＩＭＡＰ５遺伝子とのＴＮＦＡＩＰ３遺伝子の組み合わせに対するトレーニング群及び試験群のＲＯＣ解析からの感度（有病正診率（ＴＰＲ））及び特異性（１−無病誤診率（ＦＰＲ））を示す表である。 １０４人のＨＣＣ患者及び１０８人のＣＨＢ患者における、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子単独（曲線（ａ））又はＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＡＲＥＧ遺伝子、ＧＩＭＡＰ５遺伝子の組み合わせ（曲線（ｂ））及び血清ＡＦＰ（曲線（ｃ））のＲＯＣ曲線分析を示す図である。 ＲＯＣ曲線分析を示す図である。ＲＯＣ曲線分析は、バルセロナクリニック肝臓癌（ＢＣＬＣ）ステージＡのＨＣＣ患者であると診断された１４人の患者及び１４０人のＣＨＢ患者において、血清ＡＦＰ（曲線（ｃ））と比較して、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子単独（曲線（ａ））又はＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＡＲＥＧ遺伝子及びＧＩＭＡＰ５遺伝子の組み合わせ（曲線（ｂ））を解析する。 ３ペアワイズ比較に対するベン図である。候補遺伝子マーカーを、ＣＨＢの対象及び健康な対象と比較してＨＣＣで差次的に発現している遺伝子（陰影領域）から選択した。 遺伝子マイクロアレイ解析から同定された、ＨＣＣ及びＣＨＢで著しく発現している９遺伝子の差次的遺伝子発現を示す表である。これらの遺伝子は、ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＲＥＧ、ＧＩＭＡＰ５、Ｂ細胞におけるカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核内因子インヒビターアルファ（ＮＦＫＢＩＡ）、Ｂ細胞におけるカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核内因子インヒビターゼータ（ＮＦＫＢＩＺ）、ＣＤ８３、ＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー４（ＧＩＭＡＰ４）、ＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー６（ＧＩＭＡＰ６）及びＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー８（ＧＩＭＡＰ８）である。 ｑ−ＰＣＲ（ＨＣＣ患者数ｎ＝５０；ＣＨＢ患者数ｎ＝５０；健康な患者数ｎ＝６）によって検証した、トレーニングセット中の９つのＷＢＣ遺伝子マーカー（ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＲＥＧ、ＧＩＭＡＰ６、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＦＫＢＩＺ、ＣＤ８３、ＧＩＭＡＰ４、ＧＩＭＡＰ５及びＧＩＭＡＰ８）の差次的発現を示す図である。遺伝子発現レベルは（基準遺伝子としての）ＣＤ４５の発現に対して標準化し、ＣＤ４５発現レベルのパーセンテージとして示した。ボックスは、第２５及び第７５パーセンタイルを指し、ラインは中央値を示す。ウィスカーは最小値及び最大値を表す。マン・ホイットニー検定を実施して、有意性を判定した。 定量的ＰＣＲによる、同定した９つの遺伝子マーカー（ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＲＥＧ、ＧＩＭＡＰ６、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＦＫＢＩＺ、ＣＤ８３、ＧＩＭＡＰ４、ＧＩＭＡＰ５及びＧＩＭＡＰ８）の検証に使用したプライマーを示す図である。

本発明は、患者がＨＣＣのいかなる症状も示さない時点で肝細胞癌（ＨＣＣ）などの肝臓癌を早期診断する、高感度且つさらに特異的な方法を提供する。したがって本出願はまた、ＨＣＣなどの肝臓癌の疾患発生又は再発の様々な危険性を有する患者をより正確に評価及び層別化することができる方法を提供する。さらに本発明は、肝硬変を有する対象がＨＣＣなどの肝臓癌を発症する危険性を評価する方法を提供し、それにより、超音波又は血清α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルの決定などの現在使用されている方法と比較して、著しい臨床的有用性を提供する。したがって本発明の方法は、進行性ＨＣＣを発症する危険性がある又は進行性ＨＣＣを発症する素因を有する患者の危険管理及びモニタリングを含めた、ＨＣＣの臨床的管理に非常に有益である。

本発明は、腫瘍発生の様々なステージで免疫系が重要な役割を果たすという知見、及び腫瘍の出現は、白血球／白血球細胞（ＷＢＣ）における遺伝子発現パターンの検出可能な変化をもたらし得るという知見に基づく。免疫反応関連遺伝子シグネチャーは、転移を予測するために、ＨＣＣ患者の非腫瘍性肝臓組織において特定されている（例えば、非特許文献１２参照）。本発明では、本発明者らは、高密度遺伝子マイクロアレイを使用して、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）に感染しＨＣＣを有する患者（ＨＢＶ＋ＨＣＣ患者）、Ｂ型慢性肝炎を有する患者（（ＣＨＢ）患者）及び健康な個体から単離したＷＢＣにおける遺伝子発現をプロファイリングした。

第１の態様では、本発明は対象の肝臓癌を診断する方法を対象とする。この方法は、腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子、アンフィレグリン遺伝子及びＧＴＰアーゼ、ＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５）遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の遺伝子発現レベルを、対象から得られたサンプルにおいて決定することを含む。

腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３遺伝子、アンフィレグリン遺伝子及びＧＴＰアーゼ、ＩＭＡＰファミリーメンバー５に対する省略形ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＲＥＧ及びＧＩＭＡＰ５は、ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会（ＨＧＮＣ）のデータベースで承認されたシンボルであり、したがって、当技術分野で受け入れられ且つ理解される意味の範囲内で、本明細書で使用される。

本発明で使用されるＴＮＦＡＩＰ３遺伝子に関するＨＧＮＣデータベース識別子は１１８９６であり、Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベース識別子は７１２８である。本明細書で言及するＴＮＦＡＩＰ３遺伝子は、その発現が腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）によって急速に誘導される遺伝子として同定された。この遺伝子がコードするタンパク質は、７９０アミノ酸長のジンクフィンガータンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号：ＴＮＡＰ３＿ＨＵＭＡＮ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ２１５８０、配列番号：１９）であり、ＮＦ−カッパＢの活性化及びＴＮＦ媒介性アポトーシスを阻害することが示されている。マウスにおける類似遺伝子のノックアウト研究によって、この遺伝子が、ＴＮＦ誘導性ＮＦ−カッパＢ応答を終わらせることによって炎症を抑制するのに重要であることが示唆された。

本発明で使用されるＡＲＥＧ遺伝子に関するＨＧＮＣデータベース識別子は６５１であり、Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベース識別子は７１２８である。ＡＲＥＧ遺伝子がコードするタンパク質は、上皮増殖因子ファミリーのメンバーとしても知られる。２５２アミノ酸長のこのタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＲＥＧ＿ＨＵＭＡＮ、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１５５１４、配列番号：２０）は、自己分泌増殖因子でもあり、星状細胞、シュワン細胞及び線維芽細胞に対するマイトジェンでもある。このタンパク質は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）及びトランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−アルファ）と関連している。このタンパク質は、ＥＧＦ／ＴＧＦ−アルファ受容体と相互作用して、正常な上皮細胞の増殖を促進し、特定の侵襲性カルチノーマ細胞系統の増殖を阻害する。このコードされたタンパク質は、乾せん様の皮膚表現型と関係がある。

本発明で使用されるＧＩＭＡＰ５遺伝子に関するＨＧＮＣデータベース識別子は１８００５であり、Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベース識別子は５５３４０である。ＧＩＭＡＰ５遺伝子は、４０８アミノ酸長のタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６Ｆ１５、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９６Ｆ１５、配列番号：２１）をコードし、ＧＴＰ結合スーパーファミリー、及びヌクレオチド結合タンパク質の免疫関連ヌクレオチド（ＩＡＮ）サブファミリーに属する。ヒトでは、ＩＡＮサブファミリー遺伝子は、７ｑ３６．１でのクラスターに位置する。この遺伝子について、一方がタンパク質をコードし（Ｑ９６Ｆ１５−１）、他方がおそらくタンパク質をコードしない（Ｑ９６Ｆ１５−２）、２つの転写産物変異体が見つかっている。両転写産物（遺伝子変異体）の使用は本発明の範囲内である。

この肝臓癌検出方法の一実施形態は、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＡＲＥＧ遺伝子及びＧＩＭＡＰ５遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子の少なくとも２つの発現レベル、すなわち、ａ）ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子及びＡＲＥＧ遺伝子、又はｂ）ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子及びＧＩＭＡＰ５遺伝子、又はｃ）ＡＲＥＧ遺伝子及びＧＩＭＡＰ５遺伝子の発現レベルを共に決定することを含む。さらなる実施形態では、方法は、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＡＲＥＧ遺伝子及びＧＩＭＡＰ５遺伝子の３つすべての発現レベルを決定することを含む。

これら３つのマーカー遺伝子のいずれかに加えて、肝臓癌を検出する方法は、以下の６マーカー：Ｂ細胞におけるカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核内因子インヒビターアルファ（ＮＦＫＢＩＡ）、Ｂ細胞におけるカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核内因子インヒビターゼータ（ＮＦＫＢＩＺ）、ＣＤ８３、ＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー４（ＧＩＭＡＰ４）、ＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー６（ＧＩＭＡＰ６）及びＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー８（ＧＩＭＡＰ８）の１つ又は複数の検出を含むことができる。これらの実施形態では、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＡＲＥＧ遺伝子及びＧＩＭＡＰ５遺伝子のいずれか１つ、２つ又は３つすべてを、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＦＫＢＩＺ、ＣＤ８３、ＧＩＭＡＰ４、ＧＩＭＡＰ５及びＧＩＭＡＰ８の群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はこれら６つすべてのマーカー遺伝子と共に使用することができる。この点において、本発明はまた、Ｂ細胞におけるカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核内因子インヒビターアルファ（ＮＦＫＢＩＡ）、Ｂ細胞におけるカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核内因子インヒビターゼータ（ＮＦＫＢＩＺ）、ＣＤ８３、ＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー４（ＧＩＭＡＰ４）、ＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー６（ＧＩＭＡＰ６）及びＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー８（ＧＩＭＡＰ８）からなる群から選択される、ＨＣＣなどの肝臓癌を診断するためのマーカー遺伝子のいずれかの単独使用を包含することに留意されたい。

この点において、目的の遺伝子の発現レベルが下方制御されても、上方制御されてもよいことに留意されたい。例えば本発明では、本発明で使用される５遺伝子（ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＲＥＧ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＦＫＢＩＺ、ＣＤ８３）は、対照の発現レベルよりも高い発現レベルをＨＣＣにおいて有するが、本発明で使用される、ＧＩＭＡＰファミリーに由来する４遺伝子（ＧＩＭＡＰ４、ＧＩＭＡＰ５、ＧＩＭＡＰ６及びＧＩＭＡＰ８）は、対照の発現レベルよりも低い発現レベルをＨＣＣにおいて有することが分かった。本明細書で使用する場合、用語「発現レベルを決定する」は、通常、対象から得られるサンプルにおいて目的の遺伝子のそれぞれのｍＲＮＡの量を決定することを指す。発現レベルは、当業者にとって利用可能且つ周知である任意の手法を使用して決定することができる。例えば、ｍＲＮＡを対象のサンプルから単離し、市販のキット、例えば限定はされないが、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用してｃＤＮＡに逆転写することができる。その結果、そのようにして得られたｃＤＮＡ（又はその一部）を、核酸増幅方法、少し例を挙げると、例えば限定はされないが、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、等温核酸増幅又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によってアッセイすることができる。

発現レベルの決定は、対象のサンプルで恒常的に発現している基準遺伝子の使用を含むことができる。この決定はまた、目的の遺伝子を発現している対照サンプルと発現レベルを比較することを含むことができる。発現レベルの決定は定性的に行うことができ、すなわち遺伝子産物の有無のみを決定することができ、又は定量的に、すなわち発現産物の総量を（対照サンプルと比較して）決定することができる。

本発明の方法は、肝臓に生じるいかなる形態の肝臓癌（肝癌）の診断にも使用することができる。「肝臓癌」は、肝臓の表面又は内部で増殖する悪性腫瘍を意味する。肝臓癌は、例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）でもよいし、その変異型（ＨＣＣと胆管細胞癌（胆管癌）の両方の構成要素からなる）でもよい。肝臓癌は、肉腫、肝芽腫又は間葉組織の癌でもよい。

本明細書で開示される診断方法は、任意の対象、一般的にはヒトを含めた任意の哺乳動物に適用することができる。本発明の方法の１つの重要な利点は、対象／ヒトがＨＣＣなどの肝臓癌の症候を示さない疾患発症の早期ステージでさえも、高感度且つ特異的であることである。したがって、本発明はまた、患者がまだ無症状である時に、一度に、患者のモニタリングさらには可能性のある治療を可能にするので、患者管理における重要な利点を構成する。したがって、本発明は、ＨＣＣを発症する危険性が高い患者、例えばＢ型慢性肝炎（ＣＨＢ）に罹患している患者又はＢ型慢性肝炎と肝硬変の両方に罹患している患者のモニタリングを可能にする。これまで早期ＨＣＣの手術が唯一の治療法であり、本出願はこのように、ＨＣＣの出現／発症を極めて早期ステージで認識することも可能にし、それにより、ＨＣＣ患者の生存率及び治癒率を高めることを可能にする。腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）遺伝子及びＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５）遺伝子の少なくとも１つの遺伝子発現レベルのいずれかを測定する方法、又はこれらの３つのタンパク質（ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＲＥＧ又はＧＩＭＡＰ５）の少なくとも１つの存在又は量を測定する方法（以下で詳細に説明する）も、ＨＣＣの再発を確認するために、外科的治療を受けた患者をモニターするのに使用することができる。

前述のように、本発明の方法では、対象から得られたサンプルにおいて決定された発現レベルを、対照サンプルと比較することができる。したがって、対照サンプルと比較して、目的の対象／患者のサンプルにおいて増大した発現レベルは、ＨＣＣなどの肝臓癌を発症する危険性を示し得る。

本発明の方法のさらなる利点は、ＨＣＣに罹患している又はＨＣＣを発症する危険性を有する対象を、Ｂ型慢性肝炎に罹患している対象と区別することを可能にすることである（実験セクションの図６及び７を参照されたい）。現在、この区別を行うのは非常に困難である。その際に区別されるＨＣＣは、バルセロナクリニック肝臓癌（ＢＣＬＣ）ステージＡのＨＣＣであり得る。本発明の方法はまた、肝硬変に罹患している患者のリスク評価又は診断を可能にし、それにより、肝硬変がＨＣＣなどの肝臓癌、又は例えばＢ型肝炎と関係があるかどうかを決定することを可能にする。これらの２つの患者群を区別する能力は、本発明の別の重要な利点である。

本明細書に記載の診断は、組織などの固体サンプル又は体液を含めた、患者からの任意の適切な体又は組織サンプルを用いて行うことができる。サンプルは、有利には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）などの血液細胞又は肝組織を含んでいてもよいし、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）などの血液細胞又は肝組織でもよい。血液細胞は、一般的には白血球である。

上記に従って、本発明は、肝硬変を有する対象が肝臓癌を発症する危険性を評価する方法も提供する。この方法は、腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）遺伝子及びＧＴＰアーゼ、ＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５）遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の遺伝子発現レベルを、対象から得られたサンプルにおいて決定することを含む。また、本態様では、肝臓癌は肝細胞癌（ＨＣＣ）でもよく、対象／患者は、試験時にＨＣＣの症候を示さなくてもよい。

対象の肝臓癌を診断するためのマーカーとして本明細書で同定された１つ又は複数の遺伝子の発現レベルを決定する代わりとして、本発明はまた、本明細書で同定された遺伝子の１つによってコードされる少なくとも１つのマーカータンパク質の存在又は量を、対象から得られたサンプルにおいて決定することを包含する。したがって、本発明はまた、腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号：Ｐ２１５８０）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１５５１４：）及びＧＴＰアーゼ、ＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９６Ｆ１５）からなる群から選択される少なくとも１つのマーカータンパク質の存在を決定することを対象とする。本方法の実施形態では、これら３つのうちの２つの存在又は量、又は３つすべてのタンパク質の存在又は量が決定される。本方法は、上述の肝臓癌のいずれかの診断に使用することができ、ＨＣＣが最も好ましい癌である。

肝臓癌を診断する本方法の他の実施形態は、以下の６マーカータンパク質：Ｂ細胞におけるカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核内因子インヒビターアルファ（ＮＦＫＢＩＡ）、Ｂ細胞におけるカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核内因子インヒビターゼータ（ＮＦＫＢＩＺ）、ＣＤ８３、ＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー４（ＧＩＭＡＰ４）、ＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー６（ＧＩＭＡＰ６）及びＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー８（ＧＩＭＡＰ８）の１つ又は複数の存在又は量の決定を含むことができる。これらの実施形態では、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＡＲＥＧ遺伝子及びＧＩＭＡＰ５遺伝子のいずれか１つ、２つ又は３つすべてを、ＮＦＫＢＩＡ、（ＮＦＫＢＩＺ）、ＣＤ８３、ＧＩＭＡＰ４、ＧＩＭＡＰ６及びＧＩＭＡＰ８の群から選択される、１つ、２つ、３つ、４つ又はこれら５つのマーカー遺伝子すべてと共に使用することができる。この点において、本発明はまた、Ｂ細胞におけるカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核内因子インヒビターアルファ（ＮＦＫＢＩＡ）、Ｂ細胞におけるカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核内因子インヒビターゼータ（ＮＦＫＢＩＺ）、ＣＤ８３、ＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー４（ＧＩＭＡＰ４）、ＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー６（ＧＩＭＡＰ６）及びＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー８（ＧＩＭＡＰ８）からなる群から選択される、ＨＣＣなどの肝臓癌を診断するためのマーカー遺伝子のいずれかの単独使用を包含することに留意されたい。

本発明は、アルファ誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）遺伝子及びＧＴＰアーゼ、ＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５）遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現レベルを決定することによって肝臓癌を診断するためのキットも対象とする。本キットは、マーカー遺伝子核酸分子の少なくとも１つに相補的な１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを含む。本キットは、２種類の１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを含むことができ、それぞれの種類のオリゴヌクレオチドは、マーカー遺伝子核酸分子の少なくとも２つのうちの１つに相補的である。本キットはまた、３種類の１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを含むことができ、それぞれの種類のオリゴヌクレオチドは、マーカー遺伝子核酸分子の少なくとも３つのうちの１つに相補的である（本明細書で同定された９遺伝子マーカーの増幅及び定量化に適切なオリゴヌクレオチドを示す、実験セクション又は図１１を参照されたい）。オリゴヌクレオチドは通常、例えば検査される対象のサンプルから単離した全ｍＲＮＡを転写した後に、それぞれのマーカー遺伝子を増幅するのに使用することができる増幅プライマー／プローブなどのオリゴヌクレオチドプローブである。したがって、そうした増幅プライマーは、増幅ステップでマーカー核酸分子を増幅するのに適する。本発明で同定されたマーカー遺伝子は公知であるので、適切な増幅プライマーの設計は、当業者の知識の範囲内である。本キットで使用するオリゴヌクレオチドは、任意の長さでよく、例えば、約３０、約６０又は約１００ヌクレオチドまでの長さでもよい。これらのオリゴヌクレオチド（プローブ）は、例えば、目的のマーカー遺伝子のリアルタイムＰＣＲ又は定量化を可能にするように標識することもできる。標識は、例えば、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、（例えば異種性のアッセイ形式においてオリゴヌクレオチドを固相に固定化するための）親和性標識又は酵素標識でもよい。親和性標識は、核酸検出で一般に使用されている試薬でもよい。そうした試薬の例としては、これらに限定されないが、ビオチン又はジゴキシゲニンが挙げられる。遺伝子発現（レベル）は、利用可能な任意の適切な手法によって決定することができ、例えば、疾患バイオマーカーの試験、検証及び定量化に一般に使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｐｌｅｘ２．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）などの市販のシステムを使用して行うことができる。そうしたアッセイを用いて、現在、多重化によって、３から８０個のマーカー遺伝子の遺伝子発現を同時に解析することが可能である。手短に述べると、そうしたアッセイでは、組織又は体のサンプル（例えばＰＢＭＣ）を溶解して、ＲＮＡを遊離させ、目的の遺伝子に特異的なプローブのパネルが固定化された磁気ビーズなどの固体支持体に接触させる。精製したＲＮＡサンプルを、適切な期間、例えば２４時間にわたってインキュベートして、それぞれのプローブを目的のマーカー遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズさせる。標的ハイブリダイゼーション後に、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）技術を使用してシグナルを増幅させる（詳細については、例えば、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｐｌｅｘ２．０の製品説明を参照されたい）。最後に、サンプル中に存在する標的ＲＮＡの量と比例するシグナルを発生する検出化合物を添加し、発光又は蛍光読み取り装置などのそれぞれの読み取り装置を使用して、光学的シグナルを読み取る。

本明細書で同定されたマーカータンパク質の１つ又は複数の存在又は量が決定されることになる場合は、決定は、対象から得られた組織又は体液サンプルなどのサンプルにおいて１つ又は複数のタンパク質を検出してアッセイ結果を提供するように設定された、任意のアッセイ方法によって行われる。アッセイは、（目的のタンパク質、例えばＴＮＦＡＩＰ３、アンフィレグリンＡＲＥＧ及びＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５）に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用することができる）ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイでもよい。一般に、イムノアッセイは、目的のタンパク質（マーカー）を含む、又はこれを含むことが疑われるサンプルを、タンパク質（マーカー）に特異的に結合する少なくとも１つの抗体と接触させることを含む。次いで、サンプル中のポリペプチドが抗体に結合することによって形成される複合体の存在又は量を示すシグナルが発生する。そして、このシグナルは、サンプル中のバイオマーカーの存在又は量と関係している。バイオマーカーを検出及び解析するための多数の方法及び装置が当業者に周知である。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２及び特許文献１３並びに非特許文献１３を参照されたい（すべての表、図及び請求項を含めて、これらのそれぞれは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

当技術分野で既知のアッセイ装置及び方法は、様々なサンドイッチ、競合的又は非競合的アッセイ形式において標識分子を利用して、目的のタンパク質、すなわち本明細書ではＴＮＦＡＩＰ３、ＡＲＥＧ及びＧＩＭＡＰ５の少なくとも１つの存在又は量と関連しているシグナルを発生することができる。ＴＮＦＡＩＰ３、アンフィレグリンＡＲＥＧ及びＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５）に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方は、様々な供給源から市販されている。単に例示的な例である、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）のポリクローナルＴＮＦＡＩＰ３ウサギ抗体カタログ番号：２３４５６−１−ＡＰ、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）のアンフィレグリンポリクローナル抗体カタログ番号ＰＡ５−１６６１６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）のモノクローナルマウスＧＩＭＡＰ５抗体（Ｅ−１１）、カタログ番号ｓｃ−３７７３０７を参照されたい。あるいはそうした抗体は、免疫化によって、又はファージディスプレイなどの組換え抗体工学法（進化的方法）を使用する人工抗体ライブラリーから、得ることができる。

目的のタンパク質の存在又は量は、タンパク質測定（例えば、ドットブロット、ウェスタンブロット、クロマトグラフィー法、質量分析など）を含めた、イムノアッセイ以外の手段によって決定することもできる。

材料及び方法
患者
原発性ＨＣＣを有する患者を、シンガポール国立癌センター（ＮＣＣＳ）での診断において動員した。中山大学癌センター肝胆道腫瘍科で、いくらかのＨＣＣ血液サンプルも収集した。慢性肝炎及び肝硬変（ＣＨＢ）並びにＨＣＣを有する患者の血液サンプルも、シンガポール総合病院消化器科の診療所に患者が訪れている間の様々な時に補充した。すべてのサンプルを、それぞれの機関審査委員会によって承認されたプロトコールに従って収集し、血液サンプルを収集する前に、インフォームドコンセントをすべての対象から得た。すべての健康な参加者は、肝臓疾患の病歴、ウイルス性肝炎及び悪性疾患がないＮＣＣＳの職員であり、口頭のインフォームドコンセントの後に血液サンプルを収集した。合計で１０ｍｌの血液をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｋ２ ＥＤＴＡチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に収集した。

ＨＣＣに関する診断は、ＡＡＳＬＤガイドライン（例えば、非特許文献６参照）に従って、組織学的評価又は２つのダイナミック造影検査のいずれかで行った。いかなる治療も施す前に、血液サンプルを収集した。いかなる合併性を有する患者も除外した。

Ｂ型慢性肝炎（ＣＨＢ）患者に関しては、ＡＡＳＬＤ診療ガイドラインを組み入れ基準として使用し、これは、ＨＢｓＡｇ陽性＞６か月；ＨＢＶ ＤＮＡ＞１０３コピー／ｍｌ（ＨＢｅＡｇ陰性の場合は１０４〜１０５コピー／ｍｌ）、及び血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ／アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＡＳＴ）の持続的又は断続的な上昇を含む。いかなる合併性を有する患者も除外した。

肝硬変の診断は画像検査のエビデンスに基づき、登録する前の少なくとも３か月間は肝腫瘤のエビデンスがなかった。

肝臓サンプル
癌性及び対応する遠位非癌性の肝組織を、ＨＣＣの根治治療として部分肝切除を受けた患者から得た。研究される癌性組織のすべては、少なくとも７０％癌性であった。本研究で用いる組織サンプルのすべては、シンガポール国立癌センター組織保管機関（ＮＣＣＳ）の倫理委員会の方針に従って、この機関によって承認され、提供された。インフォームドコンセントを関与する患者すべてから得、研究者に提供される臨床的及び病理組織学的データのすべては、無名で与えられた。

白血球細胞の単離
収集６時間以内に、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する密度勾配遠心によって血液を処理した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳは、密度１．０７７＋０．００１ｇ／ｍｌの水溶液であり、１００ｍｌ毎に、０．０２３１ｇのカルシウム二ナトリウムエチレンジアミン四酢酸と共に５．７ｇのＦｉｃｏｌｌ４００及び９ｇのジアトリゾ酸ナトリウムを含む。残留する赤血球を１ｍｌのＲＢＣ溶解バッファー（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に５分間溶解し、次いで１０ｍｌのリン酸緩衝食塩水で洗浄した。単離したＰＢＭＣを、試験するまで−８０℃で保管した。ＰＢＭＣサンプルが研究された患者の臨床特性を表１及び２にまとめる。

ＲＮＡ抽出及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘジーンチップ解析
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用してＷＢＣから抽出し、ＮＤ−１０００ Ｎａｎｏ−ｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）によって定量化した。ＲＮＡの完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）によって評価した。非特許文献１４に以前に記載されているように、ＲＮＡ完全性数（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）（ＲＩＮ）が６．７を超えるＲＮＡサンプルのみを遺伝子マイクロアレイに使用した。以前に記載されているように（例えば、非特許文献１５、非特許文献１６参照）、得られた最終的なｃＲＮＡを、ジーンチップ・ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＵＳＡ）にハイブリダイズさせた。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ・スイート・バージョン５．０によってｃｅｌファイル型式で生成されたすべてのデータを、Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃｓスイート・ソフトウェア・パッケージ（Ｐａｒｔｅｋ、ＵＳＡ）を使用して洗練した。

定量的ＰＣＲ及び多重遺伝子発現解析
定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）を行って、遺伝子マイクロアレイから同定された９つの候補遺伝子を検証した。同定した遺伝子を増幅するのに使用するプライマーを図１１に表し、以下の表にも示す。

５００ナノグラムの全ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用してｃＤＮＡに逆転写し、続いて、このｃＤＮＡの４０分の１を、ＳｓｏＦａｓｔ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を使用するリアルタイムＰＣＲによってアッセイした。比較サイクル閾値（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｃｔ）法を使用し、候補遺伝子の発現レベルをＣＤ４５の発現レベルに対して標準化し、−ΔΔＣｔを引き続く解析に使用した。候補遺伝子及び基準遺伝子に関するＰＲＣ反応の効率は、＞９０％であることが試験された。

統計的分析
血清ＡＦＰは、ＨＣＣのスクリーニング及び診断に最も一般的に使用される血清学的マーカーであり、全体的な感度は５２％であり、特異性は８０％である（例えば、非特許文献３参照）。５０人のＨＣＣ及び５０人のＣＨＢ患者という小集団を使用したトレーニングセットでは、同定した遺伝子マーカーは、９２％を超える感度及び９６％を超える特異性を示した。したがって、トレーニングセット／研究は、同定した遺伝子マーカーの感度をＡＦＰの感度と比較して、ＣＨＢ患者からＨＣＣを区別するように設計した。片側検定の第１種過誤５％で９０％検出力を達成するためには、１０９人の患者（５０人のＨＣＣ及び５９人のＣＨＢ）というサンプルサイズが必要であった（例えば、非特許文献１７参照）。ソフトウェア「Ｓａｍｐｌｅ Ｓｉｚｅ Ｔａｂｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓソフトウェアプログラム・バージョン１．０」を解析に使用した。

定量的ＰＣＲ法によってトレーニングサンプルセットから得られたデータを使用して、段階的前向き法ロジスティック回帰分析を用いてモデルを構築した。ＨＣＣである確率は、ロジスティック回帰分析モデルを使用して計算し、０から１までのスコアとして与えられた。ＨＣＣ確率スコアを使用して、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した。曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。様々なカットオフポイントでの感度及び特異性を、トレーニングサンプルセットに由来するＲＯＣ曲線から選択した。

ＰＡＳＷ（登録商標）Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ１８プログラム（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して、ＲＯＣ曲線の作成、ロジスティック回帰分析及び統計的分析を行った。スチューデントのｔ検定又はマン・ホイットニーのＵ検定を使用して連続変数を比較し、カテゴリー変数にはカイ二乗検定を使用した。ＡＵＣ、感度及び特異性について、９５％の信頼区間を得た。

結果 患者特性
ＨＣＣ又はＣＨＢを有する患者を４つの異なる病院で動員した。これらの患者の特性情報を（表１及び２）に列挙する。

遺伝子マイクロアレイを使用した候補ＷＢＣ遺伝子マーカーの選択
高密度Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘジーンチップ・ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０アレイを使用して、潜在的遺伝子マーカーを末梢血ＷＢＣからスクリーニングした。２８サンプル（１０人のＨＣＣ、１２人のＣＨＢ及び６人の健康な患者）由来の全ＲＮＡ抽出物を、この初期スクリーニングステップで使用した（図１を参照されたい）。候補遺伝子マーカーを、ＣＨＢ及び健康な対象と比較してＨＣＣで差次的に発現している遺伝子から選択した（図１０）。候補遺伝子マーカーを選択する際にいくつかの因子を考慮し、倍率変化（上方制御される遺伝子については＞１．５、下方制御される遺伝子については＜−１．５）、Ｐ値（＜０．０００３）を考慮した。これらの判断基準に従って９遺伝子を最終的に選択して、さらに定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって検証した。

ｑ−ＰＣＲによる候補ＷＢＣ遺伝子の発現の検証
１７候補遺伝子の発現レベルを、マイクロアレイスクリーニングで使用した２６サンプル及びさらなる３０サンプル（１５人のＨＣＣ及び１５人のＣＨＢ）を含む５６サンプルからなる群において、ｑ−ＰＣＲによって評価した。１７候補遺伝子の中で９遺伝子が、ＣＨＢ及び健康な対象と比較して、ＨＣＣにおいて有意に差がある発現レベルを示した（図１０）。５つの上方制御された遺伝子及び４つの下方制御された遺伝子のＲＯＣ曲線分析を表２に示す。１０個すべての予測因子が０．７を超えるＡＵＣを有しているが、ＴＮＦＡＩＰ３が最も強力な予測因子（ＡＵＣが０．９４３）である。５遺伝子（ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＲＥＧ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＦＫＢＩＺ、ＣＤ８３）は、ＨＣＣにおいて、対照の発現レベルより高い発現レベルを有し、２．８から８．２に及ぶ倍率変化を伴う。ＧＩＭＡＰファミリーの４遺伝子（ＧＩＭＡＰ４、ＧＩＭＡＰ５、ＧＩＭＡＰ６及びＧＩＭＡＰ８）は、ＨＣＣにおいて、対照の発現レベルより低い発現レベルを有し、より程度の小さい１．９から２．４に及ぶ倍率変化を伴う（図９）。この群におけるこれら９つの重要な遺伝子のｑＰＣＲデータをトレーニングデータセットとして使用して、個々の遺伝子の判別力を組み合わせるためのモデルを開発した。

モデル開発及びＷＢＣ遺伝子マーカーの選択
重要な遺伝子のいくつかは同じシグナル伝達経路又は同じ遺伝子ファミリーにあるので、これらの遺伝子発現は互いに相関する可能性がある。したがって、多重共線性検定を適用してから、遺伝子発現データをモデル開発に使用した。この検定は、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ及びＮＦＫＢＩＺの分散拡大要因指数（ＶＩＦ）が５を超えることを示し、これは、多重共線性が存在することを示す。ＴＮＦＡＩＰ３が最も強力な予測因子であるので、ＮＦＫＢＩＡ及びＮＦＫＢＩＺをパネルから除去した。多重共線性検定を再び適用し、ＶＩＦが５未満の残りの８予測因子において多重共線性は検出されなかった。前向き方法を使用して、段階的ロジスティック回帰分析モデルを開発した：
Ｌｏｇ（ｐ／（１＋ｐ））＝３．４６２＋０．８９７×ＡＲＥＧ＋１．５７０×ＴＮＦＡＩＰ３−１．７６９×ＧＩＭＡＰ５

ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＲＥＧ及びＧＩＭＡＰ５を独立予測因子としてモデルに含め、一方で他の５遺伝子は重複していると思われた。本モデルに従って、特定の対象でのＨＣＣである確率を計算した。同様に、比較として、単一の予測因子ＴＮＦＡＩＰ３に基づいてロジスティック回帰分析を行い（Ｌｏｇ（ｐ／（１＋ｐ））＝２．８１２＋２．４０３×ＴＮＦＡＩＰ３）、確率スコアを計算した。

両モデルからの確率スコアを使用して、トレーニング群についてＲＯＣ曲線を作成した（図３Ａ）。単一遺伝子及び３遺伝子の両モデルは優れた予測因子であるが（ＡＵＣ＞０．９）、３遺伝子モデルは、ＡＵＣを０．９７７にさらに増大した。

ＷＢＣ遺伝子マーカーパネルの検証
トレーニング群で開発したモデルを、６０人のＨＣＣ及び９０人のＣＨＢ患者からなる独立のサンプル群において検証した。ＲＯＣ曲線を図４Ｂに示す。トレーニング群のものと比較して、試験群のＡＵＣは、単一遺伝子について０．８９１及び３遺伝子モデルについて０．９０９まで、わずかに低下した。

したがって、様々なカットオフポイントにおける、トレーニング群及び試験群の両方の感度及び特異性を表４（図５）に列挙する。同じカットオフポイントでは、単一遺伝子モデルと３遺伝子モデルの両方について、トレーニング群の感度と特異性の合計は試験群のものよりも高い。ＨＣＣ確率スコアの低カットオフポイント（５５から７０に及ぶ）では、２つのモデルはＣＨＢからＨＣＣを同様に区別する。しかし、約９０の高カットオフポイントでは、５８％の感度を与える単一遺伝子モデルのものより高い７２％という高感度が３遺伝子モデルによって達成され、一方、両モデルについて特異性は１００％である。

さらに、血清ＡＦＰは、ＨＣＣを診断及びスクリーニングするために最も一般に使用される血清学的マーカーであるので、ＣＨＢからＨＣＣを検出する血清ＡＦＰの能力を、本発明のＷＢＣ遺伝子マーカーであるＴＮＦＡＩＰ３、ＡＲＥＧ及びＧＩＭＡＰ５の能力と比較した。利用可能なＡＦＰデータを有する、合計で１０４人のＨＣＣ患者及び１０８人のＣＨＢ患者を、この比較で使用した。ＲＯＣ曲線分析は、単一遺伝子モデルと３遺伝子モデルの両方が、ＡＦＰよりも著しく良く機能することを示す（図６）。ＡＦＰに対するＡＵＣが０．６９７であるのに対して、ＷＢＣ遺伝子マーカーに対するＡＵＣは両方とも０．９４を超える。臨床的診断用の２００ｎｇ／ｍｌ ＡＦＰのカットオフポイント（例えば、非特許文献６参照）では、感度は４３％であり、特異性は９５％である。これに対して、３遺伝子モデルについては、感度は７４％であり、特異性は９９％であり、単一遺伝子モデルについてはわずかに低い（感度５７％、特異性９８％）。

さらに、ＡＦＰと本発明の遺伝子マーカーであるＴＮＦＡＩＰ３、ＡＲＥＧ及びＧＩＭＡＰ５の両方を、バルセロナクリニック肝臓癌（ＢＣＬＣ）ステージＡのＨＣＣ（３ｃｍ以下の単一小結節、血管侵入無し）を有する患者をＣＨＢ患者から区別するのに適用した。すべてのＨＣＣ患者群からの結果と同じように、本発明の遺伝子マーカーは、ＡＦＰよりも良く機能し、ＡＵＣは０．９６を超える（図７）。

考察
現在、ＡＦＰは最も一般に使用されるＨＣＣ用の血清学的マーカーであるが、感度及び特異性が不十分である。ＡＦＰの不十分な精度が原因で、２０１０年に出版された米国肝臓病学会（ＡＡＳＬＤ）診療ガイドラインでは、ＨＣＣをスクリーニング及び診断するためのマーカーとして、ＡＦＰをもはや推奨していなかった（例えば、非特許文献６参照）。

本発明は、早期ステージでＨＣＣを検出するための効果的な新規なマーカーを末梢血から発見することを目的とした。米国国立癌研究所の早期検出研究ネットワーク（ＥＤＲＮ）によって使用された５相構造によると、これは、臨床アッセイの開発及び検証の第２相研究である。アジアでは、大抵のＨＣＣはＨＢＶ陽性集団で発症するので、Ｂ型慢性肝炎を有する患者及びＨＢＶに関連するＨＣＣを有する患者を動員した。包括的な遺伝子発現プロファイリング・マイクロアレイを使用することによって、ＨＣＣ患者のＷＢＣにおいて候補遺伝子マーカーを同定した。その単純性及び再現性の理由で、ｑ−ＰＣＲを使用して候補遺伝子を検証し、続いて臨床サンプルで遺伝子発現レベルを測定した。

１７候補遺伝子からの９遺伝子をｑ−ＰＣＲによって本発明で検証し、トレーニング群を使用して３遺伝子を含むロジスティックモデルを開発した。この３遺伝子モデルは、トレーニング及び独立の試験群の両方で優れた診断精度を有する（図７）。ＴＮＦＡＩＰ３単独は８０％の感度及び８８％の特異性を達成することができるけれども、３遺伝子モデルは精度を微調整することができ、高い特異性が望まれる場合により高い感度をもたらす（感度８５％、特異性８７％）。さらに、本発明の遺伝子マーカーは血清ＡＦＰよりも著しく良く機能し、ＢＣＬＣステージＡのＨＣＣ患者をＣＨＢ患者から区別することができる。

例示的に本明細書に記載した本発明は、本明細書に具体的に開示されていない、いかなる要素又は複数の要素、限定又は複数の限定がない場合も適切に実施することができる。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、拡張的且つ限定せずに解釈されるものとする。さらに、本明細書で用いられる用語及び表現は、限定ではなく、説明の用語として使用されている。そのような用語及び表現の使用には、示した及び記載した特徴のいかなる均等物又はこれらの一部も排除する意図はないが、請求する本発明の範囲内で様々な改変が可能であることを認識されたい。したがって、例示的実施形態及び任意的な特徴により本発明を具体的に開示してきたが、本明細書に開示された中で具体化された本発明の改変及び変形は当業者によって行使することができ、そのような改変及び変形は、本発明の範囲内であるとみなされることを理解されたい。

本発明を、本明細書で広範且つ包括的に記載してきた。包括的な開示内にあるより狭い種概念及び半包括的分類のそれぞれも、本発明の一部を形成する。これは、削除されたものが具体的に本明細書で引用されるかどうかに関係なく、類概念から任意の内容を除く条件又は負の制限を伴う、本発明の包括的な説明を含む。

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュグループの点から記載される場合は、それによって、本発明が、マーカッシュグループの任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループの点からも記載されることを当業者なら認識するであろう。

Claims (31)

1. 腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）遺伝子及びＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５）遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の遺伝子発現レベルを、対象から得られたサンプルにおいて決定することを含む、対象の肝臓癌を診断する方法。
2. ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＡＲＥＧ遺伝子及びＧＩＭＡＰ５遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子の少なくとも２つの発現レベルを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
3. ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＡＲＥＧ遺伝子及びＧＩＭＡＰ５遺伝子の３つすべての発現レベルを決定することを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記肝臓癌が肝細胞癌（ＨＣＣ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記対象がヒトである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ヒトがＨＣＣの症候を示さない、請求項５に記載の方法。
7. 前記決定された発現レベルを対照サンプルと比較する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記対照サンプルと比較して前記対象の前記サンプルで増大した発現レベルが、ＨＣＣを発症する危険性を示す、請求項７に記載の方法。
9. Ｂ型慢性肝炎に罹患している対象からＨＣＣに罹患している対象を区別することを含む、請求項５から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ＨＣＣがバルセロナクリニック肝臓癌（ＢＣＬＣ）ステージＡのＨＣＣである、請求項９に記載の方法。
11. 前記ヒトが肝硬変を有する、請求項５から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記サンプルが血液細胞又は肝組織を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記血液細胞が白血球である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記遺伝子発現レベルの決定が核酸増幅アッセイを使用して行われる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記増幅アッセイが定量的ＰＣＲアッセイ又はリアルタイムＰＣＲアッセイである、請求項１４に記載の方法。
16. 肝硬変を有する対象が肝臓癌を発症する危険性を評価する方法であって、腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）遺伝子及びＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５）遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の遺伝子発現レベルを、前記対象から得られたサンプルにおいて決定することを含む方法。
17. 前記肝臓癌が肝細胞癌（ＨＣＣ）である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記対象がヒトである、請求項１６又は１７に記載の方法。
19. 前記ヒトがＨＣＣの症候を示さない、請求項１８に記載の方法。
20. 対照サンプルと比較して前記対象の前記サンプルで増大した発現レベルがＨＣＣを発症する危険性を示す、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 発現レベルが増大した場合に、前記ＨＣＣの発症について前記対象をモニタリングすることを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号：Ｐ２１５８０）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１５５１４）及びＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９６Ｆ１５）からなる群から選択される少なくとも１つのマーカータンパク質の存在又は量を、対象から得られたサンプルにおいて決定することを含む、対象の肝臓癌を診断する方法。
23. 腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）遺伝子及びＧＴＰアーゼ、ＩＭＡＰファミリーメンバー５（ＧＩＭＡＰ５）遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現レベルを決定することによって肝臓癌を診断するためのキットであって、前記マーカー遺伝子核酸分子の少なくとも１つに相補的な１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを含むキット。
24. ２種類の１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを含み、それぞれの種類のオリゴヌクレオチドが前記マーカー遺伝子核酸分子の少なくとも２つのうちの１つに相補的である、請求項２３に記載のキット。
25. ３種類の１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを含み、それぞれの種類のオリゴヌクレオチドが前記マーカー遺伝子核酸分子の少なくとも３つのうちの１つに相補的である、請求項２３又は２４に記載のキット。
26. 前記オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプローブである、請求項２３から２５のいずれか一項に記載のキット。
27. 前記オリゴヌクレオチドプローブが増幅プライマーである、請求項２６に記載のキット。
28. 前記増幅プライマーが増幅ステップでマーカー核酸分子を増幅するのに適する、請求項２７に記載のキット。
29. 前記オリゴヌクレオチドが、約３０、約６０又は約１００ヌクレオチドまでの長さである、請求項２３から２８のいずれか一項に記載のキット。
30. 前記オリゴヌクレオチドプローブが標識されている、請求項２６から２９のいずれか一項に記載のキット。
31. 前記標識が放射性、蛍光、化学発光、親和性又は酵素標識である、請求項３０に記載のキット。
    

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