KR20170021234A - 간암의 비-침습성 진단을 위한 특이적 바이오마커 세트 - Google Patents

간암의 비-침습성 진단을 위한 특이적 바이오마커 세트 Download PDF

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Abstract

간 종양 덩어리 내 세포는 종양에 병치된 정상 간 조직 상피세포와 비교하여 단백질/종양 항원의 고유한 세트를 포함한다. 종양 항원의 존재는 이 종양 항원에 대한 자가 항체의 생산과 결부되어 있다. 본 발명은 간암 진단 및 예상을 위한 새로운 마커 세트로서 역할을 수행할 수 있는 단백질 세트의 식별 및 명시에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 간암 환자의 혈청 내 자가 항체의 진단적 및 예후적 측정을 가능하게 하는 키트에 관한 것이다. 본 발명은 통상적인 진단 방법을 보완하기 위해, Bmi-1, VCC1, SUMO-4, RhoA, TXN, ET-1, UBE2C, HDGF2, FGF21, LECT2, SOD1, STMN4, Midkine, IL-17A 또는 IL26을 포함하는, 인증된 간암 단백질/종양 항원의 세트를 평가함으로써 비-침습성이고, 특이적이며, 민감하고, 비용 효율적인 검출 및 정량화 방법을 제공한다.

Description

간암의 비-침습성 진단을 위한 특이적 바이오마커 세트{SPECIFIC BIOMARKER SET FOR NON-INVASIVE DIAGNOSIS OF LIVER CANCER}
저작권 공고/허가
본 특허 문서의 개시물 중 일부는 저작권 보호를 받는다. 저작권자는 특허 문서 또는 특허 개시물 중 어느 것이 특허청 특허 파일 또는 기록에 나타나기 때문에 특허 문서 또는 특허 개시물 중 어느 것의 복제에 대한 이의를 제기할 수는 없지만, 모든 저작권 권리를 소유한다. 다음 공고는 하기 및 본원에 첨부된 도면에서 기술된 과정, 실험, 및 데이터에 적용된다: Copyright ⓒ 2014, Vision Global Holdings Limited, All Rights Reserved.
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2014년 7월 2일에 출원된 미국 비-가특허 출원 일련 번호 14/321,867 및 2014년 7월 2일에 출원된 미국 비-가특허 출원 일련 번호 14/321,870의 우선권을 주장하며, 이것의 개시물은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 간암 환자의 혈청 내 자가 항체의 측정에 의한, 특이적이고 새로운 간세포 암종(Hepatocellular Carcinoma; HCC) 종양 바이오마커의 나열을 위한 검출 및 정량화 방법을 기술한다. 바이오마커의 세트는 Bmil, VCC1, SUMO-4, RhoA, TXN, ET-1, UBE2C, HDGF2, FGF21, LECT2, SOD1, STMN4, Midkine, IL-17A 및 IL26을 포함한다. 더 구체적으로, 본 발명은 바이오마커 세트로부터 선택된 바이오마커 중 적어도 하나에 대한 자가 항체를 측정함으로써 초기에 및 비-침습성 방식으로 간암을 검출하기 위해 환자의 말초 혈청 샘플을 채취하는데 쉽게 이용 가능한 대용량 및 민감성 테스트 키트의 디자인을 추가로 기술한다. 본 발명은 단계화를 위한 특징적인 바이오마커 패턴의 식별, 뿐만 아니라 화학요법 치료 후 모니터링 동안 재발의 검출을 가능하게 한다. 본 발명은 자동화 데이터 분석을 지지할 것이다.
간세포 암종(HCC)은 중국에서 두 번째로 흔한 암이며, 전체 인구의 5.7 %를 커버한다[1]. 대부분의 HCC 환자는 신속한 종양 진행이 일어나며 높은 사망률을 초래한다. 전체적인 생존률을 개선하기 위해서, 질환의 초기 진단이 필수적이다. 현재, 가장 일반적인 HCC 검출 방법은 HCC 종양 마커, 예를 들어, 알파 태아 단백질(alpha fetoprotein, AFP)의 수준을 측정하는 혈액 테스트이다. AFP는 일종의 혈청 알부민의 역할을 하는, 태아의 발달 중에 난황낭 및 간에 의해 생성되는 혈장 단백질이다. 정상 조건에서, AFP 수준은 생후 점점 감소하여 성체에서 낮은 수준으로 유지된다. 증가한 종양 마커의 수준은 간암의 가능성을 나타낸다. 하지만, AFP 테스트의 주요 문제점은 지나친 위 양성(false positive)이다. 이는 HCC가 AFP 수준 증가에 대한 유일한 원인이 아니라, 알코올성 간염(alcoholic hepatitis), 만성 간염(chronic hepatitis) 또는 간경화증(cirrhosis)이 또한 AFP의 증가와 관련되어 있기 때문이다.
간암 진단을 위해 AFP 테스트가 흔히 제안되지만, 그것의 결과는 확정적이지 않다. 의심되는 환자는 추가 확인을 위해 초음파 이미지화, CT 스캔 또는 대비 MRI 스캔을 거칠 필요가 있다. 종양이 양성 또는 악성인지 구별하기 위해 간 생검을 실시한다. 하지만, HCC의 통상적인 검출은 다음과 같은 여러 제약이 따른다: (a) 간암의 약 20%는 흔히 사용되는, 높아진 수준의 HCC 종양 마커를 생성하지 않는다[2]. (b) 바이러스성 간경화증은 혈액 테스트에서 위 양성 결과를 나타낸다[3]. (c) 초음파는 작은 종양을 검출할 수 없다[4]. (d) CT 스캔은 고 방사선량을 필요로 하고 1 cm 미만의 종양에 둔감하다[5]. (e) MRI 스캔은 비싸고, 진행에 많은 시간을 소모한다. 이 제약들로 인해, HCC의 초기 진단 및/또는 통상적인 방법을 보완하기 위해 HCC의 예후를 결정하기 위한 더 고민감성 및 특이성을 가진 새로운 바이오마커 스크린을 개발할 필요가 있다.
HCC 종양 세포는 종양에 병치된 정상 간 상피세포와 비교할 때 고유한 단백질 세트를 생산하는 경향이 있다. 인증된 HCC 종양 바이오마커의 평가는 HCC의 진단을 용이하게 할 큰 가능성을 갖는다. 하지만, 모든 바이오마커 자체가 편리한 진단을 위해 혈청 또는 오줌에서 발견되는 것은 아니다. 대안으로, 바이오마커에 특이적인 자가 항체는 바이오마커의 발현을 평가할 기회를 제공한다. 많은 암에서 종양 바이오마커의 존재가 이 종양 항원에 대한 자가 항체의 생산에 결부된다는 것이 입증되었다[6-8]. 환자 혈청의 자가 항체에 대한 검출은 발명자들이 바이오마커의 존재를 더 효율적으로 조사하게 할 것이다. 이상적으로는, 말초 혈액으로부터의 자가 항체의 조사는 초기에, 및 비-침습성 방식으로 간암을 검출하기 위한 증거일 것이다. 바이오마커의 임상적 사용을 방해하는 한 흔한 장애물은 그것들이 발견 후 인증되지 않았다는 점이다. 하지만 인증되면, 이러한 테스트는 비용 효율적이고 정확하다. 프로토타입(prototype)의 디자인은 대용량 스크리닝을 지원한다. 이것은 통상적인 간암 진단에 필요한 비용을 경감시킬 수 있다.
본 명세서에서 인용된 참고문헌의 목록이 첨부되었다. 이 참고문헌의 개시물은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
[1] Chen JG, Zhang SW. Liver cancer epidemic in China: past, present and future. Semin Cancer Biol. 201 1; 21(l):59-69 [2] Okuda K, Peters RL. Human alpha-1 fetoprotein. Hepatocellular Carcinoma. 1976:353-67 [3] Lok AS, Lai CL. Alpha-fetoprotein monitoring in Chinese patients with chronic hepatitis E virus infection: role in the early detection of hepatocellular carcinoma. Hepatolog.y 1989;9: 110-115 [4] Colombo M, de Franchis R, Del Ninno E, Sangiovanni A, De Fazio C, Tommasini M, Donato MF, Piva A, Di Carlo V, Dioguardi N. Hepatocellular carcinoma in Italian patients with cirrhosis. N Engl J Med. 1991;325:675-80 [5] Sahani DV, Kalva SP. Imaging the Liver. The Oncologist. 2004; 9 (4): 385-397 [6] Masutomi K, Kaneko S, Yasukawa M, Arai K, Murakami S, Kobayashi K. Identification of serum anti-human telomerase reverse transcriptase (hTERT) auto-antibodies during progression to hepatocellular carcinoma. Oncogene. 2002 Aug 29;21(38):5946-50. [7] Karanikas V, Khalil S, Kerenidi T, Gourgoulianis KI, Germenis AE. Anti-survivin antibody responses in lung cancer. Cancer Lett. 2009 Sep 18;282(2):159-66. [8] Wang YQ, Zhang HH, Liu CL, Xia Q, Wu H, Yu XH, Kong W. Correlation between auto antibodies to survivin and MUCl variable number tandem repeats in colorectal cancer. Asian Pac J Cancer Prev. 2012;13(1 1):5557-62.
본 발명에서, 암을 진단하고 단계화할 목적으로 특이적 종양 바이오마커의 목록에 대한 자가 항체를 측정하는 검출 및 정량화 방법이 제공된다. 정상 간 상피세포와 비교하여, HCC 종양 세포는 고유한 단백질 세트를 생산하는 경향이 있다. 고유한 단백질 세트인 바이오마커의 평가는 통상적인 진단 방법을 보완하고 암의 조기 검출을 용이하게 할 것이다.
2차원/질량 분석법 기반 방법을 사용하여, 쌍을 이룬 환자 생검의 간암 바이오마커의 세트(종양 생검 대 병치된 정상 조직)가 본 발명에서 식별되며, 이는 Bmil, VCC1, SUMO-4, RhoA, TXN, ET-1, UBE2C, HDGF2, FGF21, LECT2, SOD1, STMN4, Midkine, IL-17A 및 IL26을 포함한다.
간암 바이오마커의 이러한 세트의 특이성 및 정확도는 간암의 진단에 대하여 인증되고 함께 취해진다. 본 발명에서 나열된 바이오마커의 단백질은 cDNA 클론으로부터 발현되고 정제되고 다른 방출 파장을 가진 형광 미소구체에 커플링된다. 환자의 혈청에 존재하는, 단백질에 대한 자가 항체는 단백질-비드 컨쥬게이트(conjugate)에 면역학적으로 결합한다. 자가 항체는 이어서 PE-컨쥬게이션된 2차 항체와 상호작용한다. 미소구체 비드의 특이적 형광 발광 신호는 컨쥬게이션된 바이오마커에 대한 식별자로서 역할을 수행한다. 복합체에서 PE-컨쥬게이션된 2차 항체에 의해 주어지는 형광 강도를 측정함으로써, 자가 항체를 검출 및 정량화한다. 자가 항체가 HCC 종양 세포에서 바이오마커의 풍부함에 비례하여 환자의 혈청에서 생산되기 때문에, 더 높은 농도의 자가 항체에서 발생한 더 높은 형광 강도는 해당 바이오마커의 더 높은 발현을 나타낸다. 전체 혈청의 자가 항체에 대한 각각의 바이오마커의 검출 하한은 약 0.15 ng/mL이다.
건강한 대상체의 혈청과 비교하여, 표적 바이오마커에 대한 자가 항체의 농도는 암 환자에서 더 높다. 더욱이, 다른 병기의 간암 환자의 다른 혈청과 비교하여, 단계화에 대한 특징적인 패턴이 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 표적화된 간암 바이오마커의 비-침습성 평가를 가능하게 한다. 이것은 초기 병기에서의 HCC의 검출, 단계화에 대한 특징적인 바이오마커 패턴의 식별, 뿐만 아니라 화학요법 치료 후 모니터링 동안 재발의 검출을 가능하게 한다.
본 발명의 구체예는 도면을 참고하여 하기 더 상세히 기술된다:
도 1은 2차원/질량 분석법에 의해, 간암에서 상향 조절된 15개의 특이적 바이오마커의 식별로 이어지는, 종양 생검 및 병치된 정상 조직 간의 단백질 발현 패턴의 차이를 나타낸다; 화살표는 질량 분석법의 2-D 겔 상에서 식별된 스폿(spot)의 위치를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 표적화되고 측정되는 15개의 인증된 간암 바이오마커 세트 및 그것들의 해당 분자량을 나타낸다.
도 3은 cDNA 클론으로부터 바이오마커 발현의 흐름도를 나타낸다.
도 4는 대장균(E. coli)으로부터 발현된 바이오마커의 정제의 흐름도를 나타낸다.
도 5는 BioPlex 시스템에 의한 자가 항체 측정의 흐름도를 나타낸다.
도 6은 BioPlex 비드로의 바이오마커 단백질의 컨쥬게이션을 나타낸다.
도 7은 1차 항체 및 PE-컨쥬게이션된 2차 항체와 면역반응하는 바이오마커-BioPlex 비드 컨쥬게이트의 복합체의 예시를 나타낸다.
도 8은 제한 효소 HindIII 및 BamHI에 의해 잘려진 플라스미드로부터 방출된 DNA 삽입물의 겔 전기영동을 나타낸다.
도 9는 (a) Bmil, (b) SOD1, (c) IL-17A, (d) TXN 및 (e) Midkine 바이오마커의 IPTG 유도를 확인하는 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색된 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 10은 AKTA에서 (a) Bmil, (b) SOD-1 및 (e) IL-17A의 용출 프로파일을 나타낸다.
도 11은 His 태그된(tagged) (a) Bmil, (b) SOD-1 및 (d) IL-17A 바이오마커의 정제를 확인하는 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE를 나타낸다; 분획 A는 IPTG 유도하지 않은 박테리아이다. 분획 B는 IPTG 유도된 박테리아이다. 분획 C는 박테리아 용해물이다.
도 12는 항-Bmi1 항체의 농도에 대한 형광 발광 강도를 나타내는 표준 곡선을 나타낸다.
도 13은 테스트의 디자인을 나타내는 개략적 다이어그램이다: 자가 항체를 함유하는 환자 혈청이 바이오마커 세트의 15개의 바이오마커에 해당하는 15가지 유형의 비드를 함유하는 웰에 혼합된 후, PE-컨쥬게이션된 2차 항체가 첨가된다.
정의
용어 "바이오마커"는 정상 상피세포와 비교하여 종양에서 고유하게 발현되거나 상향 조절되는 단백질을 말한다.
용어 "바이오마커 세트"는 쌍을 이룬 환자의 생검(종양 생검 대 병치된 정상 조직)으로부터 식별된 바이오마커의 특이적 조합을 말하며 본 발명에서 측정의 표적이다.
용어 "자가 항체"는 종양 바이오마커의 발현에 커플링하는 환자 신체에 의해 생산된 항체를 말하며, 순환계에 존재하고 말초 혈청에서 수거될 수 있다.
Bmi1(폴리콤 링 핑거(Polycomb Ring Finger))는 폴리콤 군(PcG) 다중 단백질 PRC 1-유사 복합체의 단백질 구성요소이다. 그것은 발달 중에 Hox 유전자를 포함하는 많은 유전자의 전사적 억제 상태 유지의 원인이 된다. 히스톤을 변형시키고 염색질을 리모델링하여, 발현을 가능케 하는 히스톤 H2A 'Lys-119'의 모노유비퀴틴화를 통해 조절된다.
VCC1 또는 CXCL17(케모카인 (C-X-C 모티프(Motif)) 리간드 17(Chemokine (C-X-C Motif) Ligand 17))은 혈관 형성 및 종양의 발달과 관련하여 필수적인 역할을 한다. 또한, 그것은 조직으로 비-활성화된 혈액 단핵구 및 미숙한 수지상세포의 모집을 조절하는 하우스키핑(housekeeping) 케모카인이라는 것이 제안된다. 또한, 그것은 감염에 대한 선천적 방어 역할을 할 수 있다. VCC1의 기능장애는 십이지장염(duodenitis) 및 콜레라(cholera)와 관련된다.
SUMO-4(Small Ubiquitin-Like Modifier 4)는 작은 유비퀴틴 관련 변형자의 패밀리에 속하고 세포질에 위치한다. 그것은 세포 이하 국소화, 안정성, 또는 활성을 제어하기 위해 표적 단백질, IKBA에 공유 결합에 의해 부착된다. 이것은 IL12B 유전자의 NF-카파-B-의존적 전사의 음성 조절로 이어진다.
RhoA(Ras 상동체 패밀리 구성원 A(Ras Homolog Family Member A))는 원형질막 수용체를 초점접착역(focal adhesion) 및 액틴 스트레스 섬유의 조립체에 결합하는 신호전달 경로를 조절한다. 그것은 또한 세포 주기 세포질 분열 중에 필수적인 미세소관-의존적 신호전달, 및 미세소관의 안정화 및 세포 이동 및 부착에 수반된 다른 신호전달 경로를 수반한다.
TXN(티오레독신(Thioredoxin))은 호모다이머를 형성하고 그것의 활성 중심 디티올의 이황화물로의 가역적 산화를 통해 산화 환원 반응에 수반되고 디티올-이황화물 교환 반응을 촉진한다. 그것은 유방 점액암종(breast mucinous carcinoma)과 관련된 것으로 보고되었다.
ET-1(엔도텔린 1(Endothelin 1))은 혈관 내피 세포에 의해 생산된 강력한 혈관 수축제이다. 그것은 비-혈관 구조 유사 상피세포, 신경교세포, 및 뉴런을 포함하는 모든 조직에서 널리 발현되는 엔도텔린 수용체에 결합한다. 그것은 혈관 긴장도를 유지시키는 주요 역할 외에도, 동시-분열원성 활성을 갖고 다른 성장 인자의 효과를 강화하는 것으로 밝혀졌다.
UBE2C(유비퀴틴-컨쥬게이션 효소 E2C(Ubiquitin-Conjugating Enzyme E2C))는 E2 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소의 패밀리에 속한다. 이것은 변성되는 비정상 단백질을 표적화하는 중요한 세포 메커니즘인 유비퀴틴화에 수반되는 세 개의 효소 중 하나이다. 더 구체적으로, UBE2C는 유사분열 사이클린의 표적화된 변성 및 세포 주기 진행에 필요하다. 따라서, 이 단백질 또한 암 진행에 수반될 수 있다고 생각된다.
HDGF2는 간종양(hepatoma)-유래 성장 인자 2(hepatoma-derived growth factor 2)라고 불린다. 다양한 종양에서 고도로 발현되는 이 단백질은 여러 종양의 발달 및 진행에서 중추적인 역할을 하는 것으로 보고되었다. 메커니즘이 아직 확인되지는 않았지만, HDGF2는 분열원성, 혈관형성성, 신경 영양성 및 항아폽토시스성 활성을 갖는 것으로 제안된다.
FGF21(섬유아세포 성장 인자 21(Fibroblast Growth Factor 21))는 배 발생, 세포 성장, 형태 형성, 조직 수복, 종양 성장 및 침습을 포함하는 다양한 생물학적 과정에 수반되는 FGF 패밀리의 멤버이다. 더 구체적으로, FGF21은 분화된 지방세포에서 글루코스 수송체 SLC2A1/GLUT1 발현의 유도를 통해 글루코스 업데이트를 자극한다. FGF21은 지방간 질환과 관련된 것으로 밝혀졌다.
LECT2(백혈구 세포 유래 케모탁신 1(Leukocyte Cell Derived Chemotaxin 1))은 호중구에 대한 화학주성 인자의 역할을 하고 연골세포 및 골아세포의 성장을 자극하는 분비 단백질이다. 이 단백질은 급성 간부전(liver failure)과 관련되어 있다.
SOD1(슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 1(Superoxide Dismutase 1))는 시토졸, 핵, 및 미토콘드리아의 막 사이 공간에서 유리 초과산화물 라디칼을 분자 수소 및 과산화수소로 파괴하는 Cu/Zn-함유 항산화 효소이다. 시토졸에서 낮은 수준의 초과산화물을 유지하여, 산화 스트레스 및 차후의 세포사로부터 세포를 보호하는 것이 중요하다.
STMN4(스타트민-유사 4(Stathmin-Like 4))는 다양한 세포 내 신호전달 경로의 통합을 중계하는 역할을 하는 것으로 생각되는 작은 조절 단백질이이며, 이것은 차례로 세포 증식, 분화 및 기능을 제어한다. 또한, 이 단백질은 미세소관의 중합을 억제하고 및/또는 해중합을 선호함으로써 미세소관 역학의 제어에 기여하는 것으로 밝혀졌다.
Midkine 또는 NEGF2(신경돌기 성장-촉진 인자 2(Neurite Growth-Promoting Factor 2))는 헤파린에 결합하고 레티노산에 반응성인 분비 성장 인자이다. Midkine은, 특히, 종양 형성 중에, 세포 성장, 이동 및 혈관 형성을 촉진한다. 그것은 유방 선암(breast adenocarcinoma) 및 연조직 육종(soft tissue sarcoma)과 관련된 것으로 입증되었다.
IL-17A(인터류킨 17A(Interleukin 17A))는 활성화된 T 세포에 의해 생산되는 전염증성 사이토카인이다. 그것은 NF-카파B 및 미토겐-활성화된 단백질 키나아제의 활성을 조절하고, IL6 및 사이클로하이드로게나아제-2의 발현을 자극하고, 산화 질소의 생산을 향상시킨다. 여러 만성 염증 및 경화증(sclerosis)은 보통 IL-17A 증가와 관련되어 있다.
IL-26(인터류킨 26(Interleukin 26))은 IL-10 사이토카인 패밀리에 속하고 활성화된 T 세포에 의해 생산되며 신호 전달을 위해 상피세포를 표적화한다. 그것은 생산자 및 표적 세포의 표면 상에서 IL-26이 풍부해지도록 세포 표면 상에서 공수용체와 유사하게 작용하는 글리코사미노글리칸, 예를 들어, 헤파린, 헤파린 황산염, 및 데르마탄 황산염에 강력하게 결합한다.
발명의 상세한 설명
하기 설명에서, 바이오마커/바이오마커들, 검출/인증/식별/정량화 방법의 해당 구체예가 바람직한 예로서 제시된다. 본 발명의 범위 및 사상에서 벗어나지 않으면서 첨가 및/또는 치환을 포함하는 변형이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 본 발명을 불분명하게 하지 않기 위해서 구체적인 상세한 설명이 제외될 수도 있지만, 개시물은 당업자가 불필요한 실험 없이 본원의 교시내용을 실시하는 것이 가능하도록 쓰여져 있다.
본 발명에서, 간암의 검출 및 정량화를 위한 간 종양 바이오마커의 세트는 먼저 쌍을 이룬 환자의 생검(종양 생검 대 병치된 정상 조직) 사이에서 단백질 발현 패턴의 차이를 해석하는 2차원/질량 분석법에 의해 식별된다(도 1). 바이오마커는 파라핀-절편화된 HCC 블록 상에서의 면역조직화학적 염색, 및 HCC 환자의 혈청의 웨스턴 블롯팅(Western Blotting)에 의해 입증된다. 이것은 간암 진단 목적을 위해 본 발명에서 평가되는 15개의 바이오마커의 확정된 목록을 발생시킨다(도 2).
표적화된 바이오마커의 아미노산 서열에 기초하여, 상업적으로 합성된 cDNA 클론이 바이오마커 세트의 발현에 이용된다(도 3). cDNA 클론으로부터 발현된 단백질은 일련의 정제 단계를 거친다(도 4). 이어서, 정제된 바이오마커는 형광 미소구체 비드의 유형이고 멀티플렉스(multiplex) 설정에서의 식별을 위해 개별적으로 고유한 형광 신호를 제공하는 패널에서 이용 가능한, BioPlex 비드와의 안정한 아미드 결합을 통해 컨쥬게이션된다(도 5, 6). 비드 상의 바이오마커는 특이적 1차 항체에 의해 인식된 후, PE와 컨쥬게이션된 항-인간 2차 항체에 의해 결합된다(도 7). 따라서, BioPlex 기계는 복합체로부터 두 개의 신호를 동시에 측정한다. BioPlex 비드에 의해 제공되는 형광 발광은 식별자의 역할을 하는 한편, PE로부터의 신호는 복합체 내에 바이오마커가 존재함을 나타낸다. 이것은 또한 항체 캐스케이드에 의해 결합된 바이오마커-비드 컨쥬게이트를 항체와의 면역반응성이 없는 것들과 구별하는데 도움을 준다.
본 발명에서 바이오마커의 중요성을 증명하기 위해서, cDNA 클론이 제한 효소 절단에 의해 확인된다(도 8). 형질전환된 박테리아는 IPTG에 의해 바이오마커 단백질을 발현하도록 유도된다. SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 확인된 단백질 발현은 단백질 밴드를 나타낸다(도 9 a-e). His-태그된 Bmil, SOD1 및 IL-17A 단백질은 AKTA에 의해 정제된 후(도 10 a-c), SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 확인된다(도 11 a-c).
테스트의 민감도는 항체의 단계 희석에서 스파이킹(spiking)에 의해 측정된다. 신호를 제공할 수 있는 첨가된 항체의 최저 농도는 상기 특정 바이오마커의 민감도를 제안한다. 한편 항체의 단계 희석에 대한 PE의 형광 발광 강도를 나타내는 표준 곡선이 작성된다(도 12). 표준 곡선은 PE 강도를 비교함으로써 환자 혈청에서의 바이오마커 특이적 자가 항체의 농도를 추정하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서, 개별적으로 고유한 형광 발광을 제공하는 15개의 다른 Bioplex 비드의 멀티플렉스는 바이오마커 세트와 컨쥬게이션되고 플레이트의 웰에 사전 로딩된다(도 13). 웰에, 자가 항체를 함유하는 환자 혈청이 로딩되고 바이오마커 컨쥬게이트와 상호작용하게 하였다. 이어서, PE-컨쥬게이션된 2차 항체가 첨가되고 자가 항체에 결합한다. 기계에서, 초과량의 2차 항체는 씻어내고, 바이오마커-비드 컨쥬게이트를 포함하는 복합체 및 항체의 캐스케이드는 개별적으로 측정된다. Bioplex 비드의 고유한 형광 발광 신호는 바이오마커를 식별하는 한편, 같은 복합체의 PE 신호는 1차 항체로서 자가 항체의 존재를 나타낸다(도 7). 종합해보면, 측정 결과는 환자 혈청에서의 자가 항체의 존재 및 상대적인 농도를 제안할 것이다.
표준 무작위 시험 디자인에서, 건강한 군과 간암으로 진단된 환자 군 사이의 자가 항체의 상대적인 수준의 평균이 비교된다. 스튜던트 T 테스트(Student T test)가 편차 유의성을 분석하는데 사용된다. 유의한 차이는 바이오마커가 간암에 특이적이라는 것을 나타낸다. 인증 시험 후, 간암 양성 및 음성 환자에 대한 바이오마커 특이적 자가 항체의 농도 범위가 얻어지고, 이는 추 후 진단을 위한 기준 역할을 할 것이다. 한편 자가 항체의 발현 패턴은 또한 다른 병기의 간암 환자 사이에서 비교된다. 바이오마커 발현의 특징적인 패턴은 HCC 단계화를 나타낼 것이다.
종합해보면, 상대적인 자가 항체 수준의 측정 및 바이오마커의 발현 패턴을 통해, 본 발명은 통상적인 간암 진단을 보완하기 위한 다른 수단을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 환자의 혈청 내 인증된 표적에 대한 자가 항체의 비-침습성 검출을 가능하게 하며, 이는 질환의 정도 및 특성을 식별한다. 병기 I 간암에 대한 조기 검출 외에도, 본 발명은 또한 단계화를 위한 특징적인 패턴을 발생시킬 수 있으며, 유방절제술 또는 화학요법 치료 후 모니터링 동안 재발을 검출할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 어떤 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하고자 하지 않으면서 본 발명의 구체적인 구체예를 기술하는 방식으로 제공된다.
실시예 la
환자의 생검으로부터 단백질 추출
500 mg의 쌍을 이룬 환자의 생검(종양 생검 대 병치된 정상 조직)을 수거하여 PBS로 세척한다. 이 조직을 액체 질소에 잠기게 하여 냉동시키고 막자 및 막자사발로 즉시 균질화한다. 균질화된 샘플에, 용해 용액(8M 요소, 4% CHAPS, 2% IPG 버퍼, 0.2mg/ml PMSF)을 첨가하고, 이어서 조직이 완전히 분산될 때까지 적어도 5분 동안 보텍스한다(vortex). 그 다음에 용해물을 4 ℃에서 10분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하여 정화한다. 상층액을 2D Clean Up kit(Amersham)로 추가 정화하여 염 및 불순물을 제거한다. 펠릿은 최소 부피의 재수화 용액(DTT & IPG 버퍼 첨가되지 않음)으로 재현탁한다. 그 다음에 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 검정으로 측정하고 200 g/튜브의 앨리쿼트를 -70 ℃에 저장한다.
실시예 lb
2차원 전기영동에 의한 단백질의 분해
1 ml 재수화 스톡 용액에, 2.8 mg DTT, 5 μl 파말라이트(pharmalyte) 또는 IPG 버퍼, 및 2 μl 브로모페놀 블루를 첨가한다. 50 - 100 μg의 단백질 샘플을 250 μl의 재수화 용액을 함유하는 13 cm Immobiline DryStrip(IPG 스트립)에 첨가한다. 보호 덮개를 제거한 후, IPG 스트립을 겔 쪽을 아래로 하여 스트립 홀더(strip holder)에 위치시키고, 전기영동 중에 탈수를 방지하기 위해 커버액을 덮어씌운다. 그 다음에 스트립을 등전점 전기영동(isoelectric focusing)(1차원 전기영동)을 위해 Ettan IPGphor(Amersham) 상에 배치한다.
1차원 전기영동 후, IPG 스트립을 평형화 용액(6 M 요소 2 % SDS, 50 mM Tris HCl pH 6.8, 30 % 글리세롤, 0.002 % 브로모페놀 블루, 10 ml 버퍼 당 100 mg DTT 및 10 ml 버퍼 당 250 mg IAA)으로 평형화하고, 1 x SDS 러닝 버퍼로 4 - 5번 세척한다. IPG 스트립을 2차원 겔의 상부 위에 배치하고 밀폐 용액(1 x SDS 러닝 버퍼 중 0.5 % 저융점 아가로스, 0.002 % 브로모페놀 블루)으로 덮어씌웠다. 그 다음에 2차원 전기영동을 처음 15분 동안은 30 mA, 이어서 3 - 4시간 동안 60 mA로 수행한다.
2차원 전기영동의 완료시, 겔을 카세트로부터 제거하여 고정하고 질산은으로 염색한다. 15개의 상향 조절된 단백질을 나타내는 15개의 스폿을 식별한다(도 1). 단백질을 식별하기 위해서(도 2), 은 염색된 겔 슬라이스를 탈염색하고 트립신 처리하여 MALDI-TOF 분석을 위해 겔로부터 단백질을 방출시켰다.
실시예 2a(서열 번호 l)
Bmil의 아미노산 서열
MHRTTRIKITELNPHLMCVLCGGYFIDATTIIECLHSFCKTCIVRYLETSKYCPICDVQVHKTRPLLNIRSDKTLQDIVYKLVPGLFKNEMKRRRDFYAAHPSADAANGSNEDRGEVADEDKRIITDDEIISLSIEFFDQNRLDRKVNKDKEKSKEEVNDKRYLRCPAAMTVMHLRKFLRSKMDIPNTFQIDVMYEEEPLKDYYTLMDIAYIYTWRRNGPLPLKYRVRPTCKRMKISHQRDGLTNAGELESDSGSDKANSPAGGIPSTSSCLPSPSTPVQSPHPQFPHISSTMNGTSNSPSGNHQSSFANRPPvKSSVNGSSATSSG
실시예 2b(서열 번호 2)
VCC1의 아미노산 서열
MKVLISSLLLLLPLMLMSMVSSSLNPGVARGHRDRGQASRRWLQEGGQECECKDWFLRAPRRKFMTVSGLPKKQCPCDHFKGNVKKTRHQRHHRKPNKHSRACQQFLKQCQLRSFALPL
실시예 2c(서열 번호 3)
SUMO-4의 아미노산 서열
MANEKPTEEVKTENNNHINLKVAGQDGSVVQFKIKRQTPLSKLMKAYCEPRGLSVKQIRFRFGGQPISGTDKPAQLEMEDEDTIDVFQQPTGGVY
실시예 2d(서열 번호 4)
RhoA의 아미노산 서열
MAAIRKKLVIVGDGACGKTCLLIVFSKDQFPEVYVPTVFENYVADIEVDGKQVELALWDTAGQEDYDRLRPLSYPDTDVILMCFSIDSPDSLENIPEKWTPEVKHFCPNVPIILVGNKKDLRNDEHTRRELAKMKQEPVKPEEGRDMANRIGAFGYMECSAKTKDGVREVFEMATRAALQARRGKKKSGCLVL
실시예 2e(서열 번호 5)
TXN의 아미노산 서열
MVKQIESKTAFQEALDAAGDKLVVVDFSATWCGPCKMIKPFFHSLSEKYSNVIFLEVDVDDCQDVASECEVKCMPTFQFFKKGQKVGEFSGANKEKLEATINELV
실시예 2f(서열 번호 6)
ET-1의 아미노산 서열
MDYLLMIFSLLFVACQGAPETAVLGAELSAVGENGGEKPTPSPPWRLRRSKRCSCSSLMDKECVYFCHLDIIWVNTPEHVVPYGLGSPRSKRALENLLPTKATDRENRCQCASQKDKKCWNFCQAGKELPvAEDIMEKDWNNHKKGKDCSKLGKKCIYQQLVRGRKIRRSSEEHLRQTRSETMRNSVKSSFHDPKLKGNPSRERYVTHNRAHW
실시예 2g(서열 번호 7)
UBE2C의 아미노산 서열
MASQNRDPAATSVAAARKGAEPSGGAARGPVGKRLQQELMTLMMSGDKGISAFPESDNLFKWVGTIHGAAGTVYEDLRYKLSLEFPSGYPYNAPTVKFLTPCYHPNVDTQGNICLDILKEKWSALYDVRTILLSIQSLLGEPNIDSPLNTHAAELWKNPTAFKKYLQETYSKQVTSQEP
실시예 2h(서열 번호 8)
HDGF2의 아미노산 서열
MARPRPREYKAGDLVFAKMKGYPHWPARIDELPEGAVKPPANKYPIFFFGTHETAFLGPKDLFPYKEYKDKFGKSNKRKGFNEGLWEIENNPGVKFTGYQAIQQQSSSETEGEGGNTADASSEEEGDRVEEDGKGKRKNEKAGSKRKKSYTSKKSSKQSRKSPGDEDDKDCKEEENKSSSEGGDAGNDTRNTTSDLQKTSEGT
실시예 2i(서열 번호 9)
FGF21의 아미노산 서열
MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLLGACQAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS
실시예 2j(서열 번호 10)
LECT2의 아미노산 서열
MFSTKALLLAGLISTALAGPWANICAGKSSNEIRTCDRHGCGQYSAQRSQRPHQGVDVLCSAGSTVYAPFTGMIVGQEKPYQNKNAINNGVRISGRGFCVKMFYIKPIKYKGPIKKGEKLGTLLPLQKVYPGIQSHVHIENCDSSDPTAYL
실시예 2k(서열 번호 ll )
SOD1의 아미노산 서열
MATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ
실시예 2l( SEQ ID N0.12)
STMN4의 아미노산 서열
MTLAAYKEKMKELPLVSLFCSCFLADPLNKSSYKYEADTVDLNWCVISDMEVIELNKCTSGQSFEVILKPPSFDGVPEFNASLPRRRDPSLEEIQKKLEAAEERRKYQEAELLKHLAEKREHEREVIQKAIEENNNFIKMAKEKLAQKMESNKENREAHLAAMLERLQEKDKHAEEVRKNKELKEEASR
실시예 2m( SEQ ID N0.13)
Midkine의 아미노산 서열
MQHRGFLLLTLLALLALTSAVAKKKDKVKKGGPGSECAEWAWGPCTPSSKDCGVGFREGTCGAQTQRIRCRVPCNWKKEFGADCKYKFENWGACDGGTGTKVRQGTLKKARYNAQCQETIRVTKPCTPKTKAKAKAKKGKGKD
실시예 2n(서열 번호 14)
IL-17A의 아미노산 서열
MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA
실시예 2o( SEQ ID N0.15)
IL-26의 아미노산 서열
MLVNFILRCGLLLVTLSLAIAKHKQSSFTKSCYPRGTLSQAVDALYIKAAWLKATIPEDmKNIRLLKKKTKKQFMKNCQFQEQLLSFFMEDVFGQLQLQGCKKIRFVEDFHSLRQKLSHCISCASSAREMKSITRMKRIFYRIGNKGIYKAISELDILLSWIKKLLESSQ
실시예 3a
바이오마커 세트의 발현
바이오마커 세트를 암호화하는 cDNA 삽입물을 함유하는 His 태그된 플라스미드를 DH5 컴피턴트 세포(competent cell)로 형질전환하였다(301, 도 3). 단일 콜로니를 골라서 박테리아 배양물에서 자라게 한다(302). 플라스미드의 수를 확장시켜 미니프렙(miniprep)에 의해 박테리아로부터 추출한다. 상기 플라스미드를 BL21DE3 또는 BL21DE3pLysS 컴피턴트 세포로 추가 형질전환한다. 형질전환된 박테리아를 선택하여 2 X 100 ml LB 배지에서 키운다. 박테리아 배양물이 0.06의 광학 밀도에 도달할 때, IPTG 200 μM을 100 ml 박테리아 배양물에 첨가한다(303). IPTG가 없는 박테리아 배양물의 다른 100 ml를 음성 대조군으로 사용한다. 박테리아 배양물을 30 ℃에서 흔들면서 배양하였다. 500 μl의 박테리아 배양물을 남겨서 배양 3시간 후 및 밤새도록 배양한 후 다음 날 아침에 -20 ℃에서 저장한다.
IPTG 유도된 박테리아 배양물 및 IPTG 유도되지 않은 박테리아 배양물을 500 ml 원심분리 병에서 혼합한다. 박테리아 세포를 4 ℃에서 20분 동안 9000 rpm으로 원심분리하여 수거한다(304). 상층액 500 μl를 또 다른 음성 대조군으로서 남겨두고 나머지 상층액을 제거한다. 다른 시점에 수거된 박테리아 배양물 및 음성 대조군을 SDS-PAGE를 실행하여 단백질을 분해한다(305). 그 다음에 겔을 쿠마시 블루로 밤새도록 염색한다. 겔을 탈염색한 후, 크기를 체크하고 음성 대조군과 비교하여 단백질 유도를 확인할 수 있다.
실시예 3b
바이오마커 세트에 대한 단백질 정제
박테리아 세포 펠릿을 실온에서 보텍스하면서 10 ml 가용화 버퍼에 재현탁하였다. 50 ml 원심분리 튜브 내의 재현탁된 세포를 얼음 위에서 유지하면서, 세포를 진폭 70 %에서 증폭 30초 간격으로 30초씩 10 라운드의 소니케이션(sonication)으로 완전히 용해시킨다(401, 도 4). 용해된 세포를 4 ℃에서 1시간 동안 10,000 rpm으로 원심분리한다(402). 상층액을 투석 튜브로 옮기고 4 ℃에서 4 - 6시간 동안 일정하게 교반하면서 1 L 여과되지 않은 시작 버퍼에 잠기게 한다(403). 투석을 또 다른 1 L 시작 버퍼로 밤새도록 계속한다. 상층액을 0.22 μm 필터 디스크 및 주사기로 추가 여과한다. 0.1M 황산니켈 충전된 HiTrap 킬레이트화 컬럼(0.1M Nickel sulfate charged HiTrap chelating column)이 장착된 AKTA 기계(404)에, 여과된 샘플을 로딩한다(405). 용리액이 분획에서 자동적으로 수거되는 AKTA 기계에 프로그램을 설치한다(406). 다른 분획으로부터 정제된 단백질을 SDS-PAGE 분석으로 체크한다(407).
실시예 4a
Bio- Plex 비드와 커플링하는 단백질
바이오마커 세트의 정제된 단백질을 제조사의 설명서에 따라 Bio-Plex 비드(Bio-Rad)와 커플링시킨다(501). 간략히 말하면, 커플링되지 않은 비드를 30초 동안 보텍스하고 이어서 15초 동안 소니케이션한다. 4분 동안 최대 속도로 100 μl 비드를 원심분리하여 반응 튜브에 1,250,000개의 비드를 수거한다. 원심분리에 의해 100 μl 비드 세척 버퍼로 세척한 후, 비드를 80 μl 비드 활성화 버퍼에 재현탁한다. 비드에 10 μl 50 mg/ml 새로 제조된 S-NHS 및 10 μl 50 mg/ml 새로 제조된 EDAC를 첨가한 후, 어둠 속에서 실온으로 20분 배양한다(도 6). 그 다음에 비드를 150 μl PBS로 두 번 세척한다.
세척된 비드에 10 μg 단백질을 첨가하고 전체 부피를 500 μl까지 PBS로 가득 채우고, 어둠 속에서 흔들면서 2시간 동안 배양시킨다. 4분 동안 최대 속도로 원심분리 후 상층액을 제거한다. 250 μl 차단 버퍼를 비드에 첨가하고 어둠 속에서 30분 동안 흔든 후, 이어서 4분 동안 최대 속도로 원심분리하고 상층액을 제거한다. 비드를 간단히 세척한 후, 4 ℃에서 저장하기 위해 저장 버퍼에 재현탁한다. 비드의 수를 혈구 계산기(hemocytometer)로 계수한다.
실시예 4b
단백질- 비드 커플링의 인증
HTS 96 웰 플레이트에, 컨쥬게이션된 Bio-Plex 비드(100 비드 / μl) 50 μl를 첨가하여 1차 항체에 이어서 2차 항체와 반응시킨다(502). 바이오마커 세트에 대한 상업적으로 이용 가능한 1차 항체의 단계 희석액을 8,000, 4,000, 1,000, 250, 62.5, 15.625, 3.906, 0.977, 0.244 및 0.061 ng/ml로 제조한다. 각각의 희석액 50 μl를 각 웰에 첨가한다. 웰에서 1차 항체, 및 1차 항체 및 2차 항체 둘 다를 제외하여 두 개의 음성 대조군으로 수행한다. 그 다음에 플레이트를 호일로 밀봉하여 30분 동안 350 rpm의 셰이커(shaker) 위에 두어, 빛에 노출되는 것을 방지한다.
배양 후, 비드를 150 μl PBS로 세 번 세척한다. PE 컨쥬게이션된 2차 항체(8,000 ng/ml) 50 μl를 음성 대조군을 제외한 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 다시 밀봉하고 어둠 속에서 30분 동안 흔들면서 배양한다. 그 다음에 초과량의 항체를 PBS로 씻어낸다. Bio-Plex 기계를 보정 키트 및 인증 키트로 보정한다. HTS 플레이트가 기계에 로딩된 후, Bio-Plex 비드 및 2차 항체에 컨쥬게이션된 PE 둘 다로부터의 신호(503)를 측정한다(개략적 다이어그램은 도 7에 나타남). 보정 곡선은 Logistic-5PL에 의해 생성된다.
실시예 4c:
BioPlex 시스템에 의한 혈청 샘플의 수거 및 자가 항체의 측정
전혈 샘플을 37 ℃에서 1시간 동안 방치하여 응고시킨다. 자가 항체를 함유하는 혈청을 실온에서 10분 동안 1000g로 원심분리 후 상층액에서 수거한다. 혈청 샘플을 필요할 때 PBS로 희석한다. 바이오마커 세트와 컨쥬게이션된 Bioplex 비드가 사전 로딩된 HTS 플레이트에, 혈청 샘플을 로딩하고 30분 동안 흔들면서 배양한다(도 13). 실시예 4b에서 기술된 단계와 유사하게, PBS 세척된 비드에 PE-컨쥬게이션된 2차 항체(8000 ng/ml) 50 μl를 첨가한 후, 이어서 추가로 30분 동안 흔들었다. 3라운드의 세척 후, 플레이트를 Bio-Plex 기계에 로딩하고 형광 발광 신호를 측정한다(504). 그 다음에 자가 항체의 농도를 표준 곡선으로부터 계산할 수 있다.
본 발명의 상기 언급된 설명은 예시 및 설명의 목적으로 제공되었다. 그것은 총망라하거나 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하려는 의도는 아니다. 많은 변형 및 차이는 당업자에게는 자명할 것이다.
구체예는 본 발명의 원칙 및 그것의 실질적인 적용을 가장 잘 설명하기 위해 선택되고 기술되며, 이로 인해 당업자가 다양한 구체예에 대하여 및 고려되는 특정 사용에 적합한 다양한 변형에 관하여 본 발명을 이해하는 것이 가능하게 된다. 본 발명의 범위는 하기 청구범위 및 그것들의 동등물에 의해 한정되는 것은 아니다.
산업상 이용 가능성
15개의 식별된 바이오마커를 포함하는 본 발명의 청구된 방법 및 키트는 간암을 검출하고 및/또는 단계화하기 위해 환자의 혈청에서의 자가 항체의 존재를 식별하고 정량화하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 간암을 특이적으로 치료하기 위해 이 마커들을 표적화하는 약물 개발에 또한 유용하다.
<110> DRAGON VICTORY DEVELOPMENT LTD. <120> SPECIFIC BIOMARKER SET FOR NON-INVASIVE DIAGNOSIS OF LIVER CANCER <130> IF16P166HK <150> US 14/321,867 <151> 2014-07-02 <150> US 14/321,870 <151> 2014-07-02 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met His Arg Thr Thr Arg Ile Lys Ile Thr Glu Leu Asn Pro His Leu 1 5 10 15 Met Cys Val Leu Cys Gly Gly Tyr Phe Ile Asp Ala Thr Thr Ile Ile 20 25 30 Glu Cys Leu His Ser Phe Cys Lys Thr Cys Ile Val Arg Tyr Leu Glu 35 40 45 Thr Ser Lys Tyr Cys Pro Ile Cys Asp Val Gln Val His Lys Thr Arg 50 55 60 Pro Leu Leu Asn Ile Arg Ser Asp Lys Thr Leu Gln Asp Ile Val Tyr 65 70 75 80 Lys Leu Val Pro Gly Leu Phe Lys Asn Glu Met Lys Arg Arg Arg Asp 85 90 95 Phe Tyr Ala Ala His Pro Ser Ala Asp Ala Ala Asn Gly Ser Asn Glu 100 105 110 Asp Arg Gly Glu Val Ala Asp Glu Asp Lys Arg Ile Ile Thr Asp Asp 115 120 125 Glu Ile Ile Ser Leu Ser Ile Glu Phe Phe Asp Gln Asn Arg Leu Asp 130 135 140 Arg Lys Val Asn Lys Asp Lys Glu Lys Ser Lys 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Gly Asp Arg 115 120 125 Val Glu Glu Asp Gly Lys Gly Lys Arg Lys Asn Glu Lys Ala Gly Ser 130 135 140 Lys Arg Lys Lys Ser Tyr Thr Ser Lys Lys Ser Ser Lys Gln Ser Arg 145 150 155 160 Lys Ser Pro Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asp Cys Lys Glu Glu Glu Asn 165 170 175 Lys Ser Ser Ser Glu Gly Gly Asp Ala Gly Asn Asp Thr Arg Asn Thr 180 185 190 Thr Ser Asp Leu Gln Lys Thr Ser Glu Gly Thr 195 200 <210> 9 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 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Ile Lys Lys Gly Glu Lys Leu Gly Thr Leu Leu Pro Leu Gln Lys 115 120 125 Val Tyr Pro Gly Ile Gln Ser His Val His Ile Glu Asn Cys Asp Ser 130 135 140 Ser Asp Pro Thr Ala Tyr Leu 145 150 <210> 11 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln 1 5 10 15 Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val 20 25 30 Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val 35 40 45 His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His 50 55 60 Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg 65 70 75 80 His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala 85 90 95 Asp Val Ser Ile Glu Asp Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys Ile 100 105 110 Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys 115 120 125 Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu 130 135 140 Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln 145 150 <210> 12 <211> 189 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Thr Leu Ala Ala Tyr Lys Glu Lys Met Lys Glu Leu Pro Leu Val 1 5 10 15 Ser Leu Phe Cys Ser Cys Phe Leu Ala Asp Pro Leu Asn Lys Ser Ser 20 25 30 Tyr Lys Tyr Glu Ala Asp Thr Val Asp Leu Asn Trp Cys Val Ile Ser 35 40 45 Asp Met Glu Val Ile Glu Leu Asn Lys Cys Thr Ser Gly Gln Ser Phe 50 55 60 Glu Val Ile Leu Lys Pro Pro Ser Phe Asp Gly Val Pro Glu Phe Asn 65 70 75 80 Ala Ser Leu Pro Arg Arg Arg Asp Pro Ser Leu Glu Glu Ile Gln Lys 85 90 95 Lys Leu Glu Ala Ala Glu Glu Arg Arg Lys Tyr Gln Glu Ala Glu Leu 100 105 110 Leu Lys His Leu Ala Glu Lys Arg Glu His Glu Arg Glu Val Ile Gln 115 120 125 Lys Ala Ile Glu Glu Asn Asn Asn Phe Ile Lys Met Ala Lys Glu Lys 130 135 140 Leu Ala Gln Lys Met Glu Ser Asn Lys Glu Asn Arg Glu Ala His Leu 145 150 155 160 Ala Ala Met Leu Glu Arg Leu Gln Glu Lys Asp Lys His Ala Glu Glu 165 170 175 Val Arg Lys Asn Lys Glu Leu Lys Glu Glu Ala Ser Arg 180 185 <210> 13 <211> 143 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Gln His Arg Gly Phe Leu Leu Leu Thr 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Lys Leu Ser His Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ser Ala 115 120 125 Arg Glu Met Lys Ser Ile Thr Arg Met Lys Arg Ile Phe Tyr Arg Ile 130 135 140 Gly Asn Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Ile Ser Glu Leu Asp Ile Leu Leu 145 150 155 160 Ser Trp Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Ser Gln 165 170

Claims (16)

  1. 간암을 진단하고 단계화할 목적으로 복수의 종양 바이오마커에 대한 자가 항체를 검출 및 정량화하는 방법으로서,
    종양 세포를 정상 세포와 비교하여 상기 암에 특이적인 복수의 바이오마커로서 정상 세포에서는 아니지만 종양 세포에서 고유한 단백질 세트를 평가하는 것;
    2차원 또는 질량 분석법 기반 기술을 사용함으로써 쌍을 이룬 환자의 생검 샘플로부터 단백질 세트를 식별하는 것; 및
    간암의 진단을 위해 단백질 세트를 인증하는 것을 포함하며,
    단백질 세트는 cDNA 클론으로부터 발현되고 정제되며 다른 방출 파장을 가진 형광 미소구체에 커플링되어 단백질-비드 컨쥬게이트를 형성하고,
    환자 혈청에 존재하는, 단백질 세트에 대한 자가 항체는 단백질-비드 컨쥬게이트에 면역학적으로 결합하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 자가 항체는 이어서 PE-컨쥬게이션된 2차 항체와 상호작용하고, 미소구체 비드에 특이적인 형광 발광 신호는 단백질-비드 컨쥬게이트에 대한 식별자로서 역할을 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 복합체에서 PE-컨쥬게이션된 2차 항체에 의해 제공되는 형광 강도를 측정하여 자가 항체를 검출 및 정량화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 환자 및 건강한 대상체 간의 혈청을 비교하여 해당 바이오마커(들)에 대한 자가 항체의 수준을 결정하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계화를 위한 특징적인 패턴을 생성하기 위해 다른 병기의 다른 환자로부터 얻어진 다른 혈청들을 비교하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단백질 세트는 서열 번호 1 내지 15의 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 복수의 종양 바이오마커는 Bmi-1, VCCl, SUMO-4, RhoA, TXN, ET-1, UBE2C, HDGF2, FGF21, LECT2, SODl, STMN4, Midkine, IL-17A 및 IL26을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 종양 세포는 간세포 암종(HCC) 종양 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 각각의 형광 미소구체 비드는 특이적 종양 바이오마커의 존재에 해당하는 각각의 단백질에 특이적인 고유한 형광 방출 파장을 갖는 한편, 특이적 종양 바이오마커에 대한 각각의 단백질의 단백질-비드 컨쥬게이트에 결합된 PE-컨쥬게이션된 2차 항체에 의해 생성된 PE 신호는 환자의 혈청에서 생산된 자가 항체 존재의 지표이고 PE 신호의 형광 강도는 특이적 종양 바이오마커의 풍부함에 비례하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 자가 항체에 존재하는 각각의 종양 바이오마커는 약 0.15 ng/mL 정도로 낮은 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 환자로부터 복수의 종양 바이오마커에 대한 자가 항체를 검출하고 정량화함으로써 간암을 진단하고 단계화하는 키트로서, 정상 대상체와 비교하여 환자의 자가 항체의 수준을 결정하기 위해 형광 신호 및 강도가 측정되도록, 자가 항체에 면역학적으로 결합한 후 PE컨쥬게이션된 2차 항체에 의해 표적화되는 단백질-비드 컨쥬게이트를 형성하기 위해 cDNA 클론으로부터 발현되고 정제되고 다른 방출 파장을 가진 형광 미소구체 비드에 커플링되는 단백질 세트를 포함하는 키트.
  12. 제11항에 있어서, 단백질 세트는 서열 번호 1 내지 15의 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 제11항에 있어서, 종양 바이오마커는 Bmi-1, VCC1, SUMO-4, RhoA, TXN, ET-1, UBE2C, HDGF2, FGF21, LECT2, SOD1, STMN4, Midkine, IL-17A 및 IL26을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  14. 제11항에 있어서, 각각의 cDNA 클론은 자가 항체에 면역학적으로 결합한 후 PE-컨쥬게이션된 2차 항체에 의해 표적화되는 단백질-비드 컨쥬게이트를 형성하기 위해 다른 방출 파장을 가진 형광 미소구체 비드에 커플링되는 컴피턴트 세포에서 발현되도록 단백질의 해당 cDNA 삽입물을 함유하는 His 태그된 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  15. 제11항에 있어서, 개별적으로 고유한 형광 발광을 제공하는 다른 형광 미소구체 비드의 멀티플렉스는 상기와 같이 발현되고 정제되어 단백질-비드 컨쥬게이트를 형성하는 단백질 세트와 컨쥬게이션되고, 상기 단백질-비드 컨쥬게이트는 용기의 웰에 사전 로딩되며, 각 웰에 자가 항체를 함유하는 환자의 혈청이 로딩되어 단백질-비드 컨쥬게이트와 상호작용하게 한 후, 자가 항체와 결합하기 위한 PE-컨쥬게이션된 2차 항체를 첨가하고, 그 다음에 초과량의 2차 항체가 세척되고 단백질-비드 컨쥬게이트를 포함하는 복합체 및 항체의 캐스케이드가 개별적으로 측정되며, 단백질-비드 컨쥬게이트의 고유한 형광 발광 신호는 특이적 종양 바이오마커의 존재를 식별하는 한편, 복합체의 2차 항체의 PE 신호는 자가 항체의 존재 및 환자의 혈청에서의 상기 종양 바이오마커의 상대적 농도를 나타내는 것을 특징으로 하는 키트.
  16. 제11항에 있어서, 자가 항체에 존재하는 각각의 종양 바이오 마커는 약 0.15 ng/mL 정도로 낮은 것을 특징으로 하는 키트.
KR1020167032783A 2014-07-02 2014-07-31 간암의 비-침습성 진단을 위한 특이적 바이오마커 세트 KR102086788B1 (ko)

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