CN105319362B - 用于肝癌的无创诊断的特异性生物标志物组 - Google Patents

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Abstract

与毗邻肝肿瘤的正常肝组织上皮细胞相比肝肿瘤块内的细胞包含独特的一组蛋白/肿瘤抗原。肿瘤抗原的存在与针对这些肿瘤抗原的自身抗体的产生有关。本发明涉及一组蛋白的鉴定和说明，该组蛋白可以充当用于肝癌诊断和预后的一组新的标志物。具体地，其涉及能够对肝癌患者的血清中的自身抗体进行诊断性和预后性测量的试剂盒。本发明提供了一种无创的、特异性的、灵敏的和有成本效益的检测和定量方法，从而对常规诊断方法形成补充，该方法通过评价一组经验证的肝癌蛋白/肿瘤抗原实现,该组肝癌蛋白/肿瘤抗原包括Bmi‑1、VCC1、SUMO‑4、RhoA、TXN、ET‑1、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、SOD1、STMN4、中期因子、IL‑17A或IL26。

Description

用于肝癌的无创诊断的特异性生物标志物组
版权声明/许可
本专利文件的公开内容的一部分含有接受版权保护的内容。版权拥有者不反对任何人影印复制专利文件或者专利公开，因为它出现在专利和商标局专利文档或记录中，但在其它方面保留所有版权。下面的声明适用于如下所述的和在本文附带的附图中的过程、实验和数据：版权2014,Vision Global Holdings Limited,保留所有权利。
技术领域
本发明描述了一种用于检测和定量一组特异性的和新的肝细胞癌(HCC)肿瘤生物标志物的方法，所述方法通过测量肝癌患者血清中的对应自身抗体来完成。该组生物标志物包括Bmi1、VCC1、SUMO-4、RhoA、TXN、ET-1、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、SOD1、STMN4、中期因子、IL-17A和IL26。更具体地，本发明进一步描述了一种容易获得的高通量和灵敏的测试试剂盒的设计，以采取患者的外周血清样品来在早期以无创的方式检测肝癌，所述检测通过测量针对选自所述生物标志物组的至少一种生物标志物的自身抗体进行。本发明进一步允许鉴定用于分期的特征生物标志物谱，以及检测化疗治疗后的监测期期间的复发。本发明将支持自动数据分析。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是中国第二普遍的癌症，占总人口的5.7％[1]。大多数HCC患者发生快速的肿瘤进展，导致高死亡率。为了提高总生存率，对该疾病的早期诊断变得至关重要。目前，检测HCC的最普遍方式是血液检查，血液检查测量HCC肿瘤标志物诸如甲胎蛋白(AFP)的水平。AFP是在胎儿的发育过程中由卵黄囊和肝产生的血浆蛋白，作为血清白蛋白的一种形式。在正常条件下，AFP水平在出生后逐渐下降并且在成年人中保持低水平。肿瘤标志物的水平增加指示可能有肝癌。然而，AFP检查的主要问题是过多的假阳性。这是因为HCC不是导致AFP水平升高的唯一原因，酒精性肝炎、慢性肝炎或肝硬化也与AFP的升高相关。
尽管AFP检查普遍被推荐用于肝癌的诊断，但其结果并不是结论性的。疑似患者将需要经历超声成像、CT扫描或对比MRI扫描以进一步确认。取肝活检以区分肿瘤是良性还是恶性的。然而，对HCC的常规检测具有一些限制性：(a)约20％的肝癌不产生升高水平的常用HCC肿瘤标志物[2]。(b)病毒性肝硬化会对血液检查产生假阳性结果[3]。(c)超声不能检测到小的肿瘤[4]。(d)CT扫描需要高的辐射剂量并且对小于1cm的肿瘤不灵敏[5]。(e)MRI扫描很昂贵，并且操作很耗时。由于这些限制，需要开发新的具有较高灵敏度和特异性的生物标志物筛选，目的是早期诊断HCC和/或确定HCC的预后，从而对常规方法进行补充。
与紧靠肿瘤的正常肝上皮细胞相比，HCC肿瘤细胞往往会产生独特的一组蛋白。评价经验证的HCC肿瘤生物标志物具有有利于HCC诊断的巨大潜力。然而，不是所有生物标志物本身可以在血清或尿中找到以进行方便的诊断。可选地，特异性针对生物标志物的自身抗体提供了评价生物标志物的表达的机会。在许多癌症中已经证明肿瘤生物标志物的存在与针对这些肿瘤抗原的自身抗体的产生有关[6-8]。检测患者血清中的自身抗体将允许我们更有效地检查生物标志物的存在。理想地，从外周血中检查自身抗体将是在早期以无创的方式检测肝癌的证据。妨碍生物标志物的临床应用的一个常见障碍是它们在被发现后并未被验证。但一旦经过验证，这些检查将具有成本效益并且是准确的。原型的设计也支持高通量筛选。这可以减少常规肝癌诊断所需的成本。
下面列举的参考文献偶尔在说明书中引用。这些参考文献的每一篇公开内容都全部地通过引用合并于本文中。
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发明内容
在本发明中，提供了一种测量针对一组特异性肿瘤生物标志物的自身抗体以对癌症进行诊断和分期的检测和定量方法。与正常肝上皮细胞比较，HCC肿瘤细胞往往产生一组独特的蛋白。对该组独特的蛋白(生物标志物)的评价将对常规诊断方法进行补充并有利于癌症的早期诊断。
通过使用基于二维/质谱法的方法，在本发明中从患者的配对活检(肿瘤活检相对于毗邻的正常组织)中鉴定了一组肝癌生物标志物，包括Bmi1、VCC1、SUMO-4、RhoA、TXN、ET-1、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、SOD1、STMN4、中期因子、IL-17A和IL26。
然后验证了此组肝癌生物标志物的特异性和准确性，并一起用于诊断肝癌。在本发明中，列举的生物标志物的蛋白表达自cDNA克隆，其被纯化并偶联至具有不同发射波长的荧光微球珠。存在于患者血清中的针对所述蛋白的自身抗体免疫结合于蛋白-珠缀合物。自身抗体随后与藻红蛋白(PE)-缀合的二抗相互作用。微球珠的特异性荧光信号充当缀合的生物标志物的标识物。通过测量在复合物处由PE-缀合的二抗产生的荧光强度，能够检测和定量自身抗体。由于自身抗体是在患者血清中产生的，与HCC肿瘤细胞处的生物标志物的丰度成正比，因此由较高浓度的自身抗体所产生的较高荧光强度指示对应生物标志物的较高表达。针对总血清自身抗体的每种生物标志物的最低检测限为约0.15ng/mL。
与来自健康受试者的血清相比，针对目标生物标志物的自身抗体的水平在癌症患者中处于较高的浓度。而且，比较来自处于不同时期的肝癌患者的不同血清，可以生成用于分期的特征谱。因此，本发明允许无创地评价被靶向的肝癌生物标志物。这使得能够检测处于早期阶段的HCC以及鉴定用于分期的特征生物标志物谱，以及检测化疗治疗后的监测期期间的复发。
附图说明
下文参照附图更详细地描述本发明的实施方案，在附图中：
图1示出通过二维质谱法发现的肿瘤活检和毗邻的正常组织之间蛋白表达谱的差异，该法鉴别出在肝癌中上调的15种特异性生物标志物；箭头指示在质谱分析仪的2-D凝胶上鉴定出的点的位置。
图2显示了在本发明中靶向和测量的一组15种经验证的肝癌生物标志物以及它们的对应分子量。
图3显示了从cDNA克隆表达生物标志物的工作流程。
图4显示了纯化表达自大肠杆菌的生物标志物的工作流程。
图5显示了通过BioPlex系统测量自身抗体的工作流程。
图6显示了生物标志物蛋白与BioPlex珠的缀合。
图7显示了生物标志物-BioPlex珠缀合物与一抗和PE-缀合的二抗免疫反应的复合物的图示。
图8显示了从被限制性内切酶HindIII和BamH1切割的质粒释放的DNA插入物的凝胶电泳。
图9显示了考马斯蓝染色的SDS-PAGE，证明了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对(a)Bmi1、(b)SOD1、(c)IL-17A、(d)TXN和(e)中期因子生物标志物的诱导。
图10显示了(a)Bmi1、(b)SOD-1和(e)IL-17A在AKTA中的洗脱图。
图11显示了考马斯蓝染色的SDS-PAGE，证明了对带His-标签的(a)Bmi1、(b)SOD-1和(d)IL-17A生物标志物的纯化；级分A是未经IPTG诱导的细菌；级分B是利用IPTG诱导的细菌；级分C是细菌溶解产物。
图12显示了示出荧光强度相对于抗-Bmi1抗体的浓度的标准曲线。
图13是显示了试验设计的示意图：将含有自身抗体的患者血清混合至含对应于生物标志物组的15种生物标志物的15种类型的珠子的孔中，然后添加PE-缀合的二抗。
具体实施方式
定义
术语“生物标志物”是指与正常上皮细胞相比在肿瘤中独特地表达或上调的蛋白。
术语“生物标志物组”是指从患者的配对活检(肿瘤活检相对于毗邻的正常组织)中鉴定的生物标志物的特定组合，且其是本发明中测量的靶标。
术语“自身抗体”是指由患者身体产生的抗体，其与肿瘤生物标志物的表达有关，并且其存在于循环中并且可以在外周血清中收集。
Bmi1(多梳环指)是多梳组(PcG)复合蛋白PRC1-样复合体的蛋白组分。其负责维持许多基因(包括Hox基因)在整个发育过程中的转录抑制状态。其调控经由组蛋白H2A'Lys-119'的单泛素化，单泛素化修饰组蛋白并重构染色质，导致表达。
VCC1或CXCL17(趋化因子(C-X-C基序)配体17)在血管生成并可能在肿瘤的发生中具有重要作用。也认为其是一种管家趋化因子，调控未活化的血液单核细胞和不成熟的树突状细胞至组织中的募集。其在针对感染的先天防御中也可能具有一定作用。VCC1的功能障碍与十二指肠炎和霍乱相关。
SUMO-4(小泛素样修饰物4)属于小的泛素相关修饰物家族且定位在细胞质中。其共价附着于靶蛋白IKBA以控制其亚细胞定位、稳定性或活性。这最终导致对IL12B基因的NF-κ-B-依赖性转录的负调控。
RhoA(Ras同源物家族成员A)调控联系质膜受体与粘着斑和肌动蛋白应力纤维的组装体的信号传导通路。其还参与细胞周期胞质分裂期间至关重要的微管依赖性信号传导，以及参与微管的稳定以及细胞迁移和粘附的其他信号传导通路。
TXN(硫氧还蛋白)形成同型二聚体，并且通过其活性中心二巯基化物可逆地氧化为二硫化物而参与到氧化还原反应中，并且催化二巯基化物-二硫化物交换反应。已报道其与乳腺粘液癌相关。
ET-1(内皮缩血管肽1)是由血管内皮细胞产生的强力血管收缩剂。其与在所有组织中广泛表达的内皮缩血管肽受体结合，所述组织包括非血管结构样上皮细胞、神经胶质和神经元。除了在维持血管张力中的主要作用以外，其还被认为具有共同促有丝分裂活性(co-mitogenic activity)并且增强其他生长因子的效应。
UBE2C(泛素缀合酶E2C)属于E2泛素缀合酶家族。这是参与泛素化的三种酶之一，泛素化是用于靶向异常蛋白以进行降解的重要细胞机制。更具体地，UBE2C是有丝分裂细胞周期蛋白的靶向降解和细胞周期进程所需要的。因此，据信此蛋白也可能参与癌症进展。
HDGF2称为肝癌衍生生长因子2。此蛋白在许多肿瘤中高度表达，据报道其在数种肿瘤的发生和进展中具有关键的作用。尽管机制尚未阐明，但认为HDGF2具有促有丝分裂、血管生成、神经营养和抗凋亡活性。
FGF21(成纤维细胞生长因子21)是FGF家族的家族成员，其参与多样的生物学过程，包括胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复、肿瘤生长和侵袭。更具体地，FGF21通过诱导葡萄糖转运蛋白SLC2A1/GLUT1表达来刺激分化的脂肪细胞中的葡萄糖更新。已经发现FGF21与脂肪肝病相关。
LECT2(白细胞衍生趋化因子1)是一种分泌蛋白，其充当中性粒细胞的趋化因子并且刺激软骨细胞和成骨细胞的生长。该蛋白与急性肝衰竭相关。
SOD1(超氧化物歧化酶1)是含Cu/Zn的抗氧化酶，其负责将胞液、细胞核和线粒体的膜间隙中的超氧自由基破坏成分子氧和过氧化氢。维持胞液中低水平的超氧化物是重要的，由此保护细胞免于发生氧化应激和随后的细胞死亡。
STMN4(Stathmin样蛋白4)是一种小的调控蛋白，据信该蛋白在传递整合多种多样的细胞内信号传导途径方面具有一定作用，该信号传导途径进而控制细胞增殖、分化和功能。还表明此蛋白通过抑制微管的聚合和/或有利于它们的解聚而促成对微管动力学的控制。
中期因子或NEGF2(神经轴突生长促进因子2)是一种分泌性生长因子，其结合肝素并对维甲酸有反应。中期因子促进细胞生长、迁移和血管生成，特别是在肿瘤发生期间。已经证明其与乳腺腺癌和软组织肉瘤相关。
IL-17A(白细胞介素17A)是一种由活化的T细胞产生的促炎细胞因子。其调控NF-κB和有丝分裂原激活的蛋白激酶的活性，刺激IL6和环氧合酶-2的表达，并且增加氧化氮的产生。几种慢性炎症和硬化症通常与IL-17A升高相关。
IL-26(白细胞介素26)属于IL-10细胞因子家族，并且由活化的T细胞产生，其靶向上皮细胞进行信号转导。其与细胞表面上的诸如肝素、硫酸肝素和硫酸皮肤素的糖胺聚糖强烈结合，糖胺聚糖以类似方式作用于复合受体以将IL-26富集在生产细胞和靶细胞的表面上。
在下面的描述中，一种或多种生物标志物、检测/验证/鉴定/定量方法的相应实施方案作为优选实例给出。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不背离本发明的范围和精神的前提下，可以做出多种修改，包括添加和/或替换。可以省略具体细节以不使本发明难以理解；然而，撰写本公开内容的目的是使得本领域技术人员能够在不进行过多实验的情况下实施本文中的教导。
在本发明中，用于检测和定量肝癌的肝肿瘤生物标志物组首先通过二维/质谱法鉴定，二维/质谱法解析患者的配对活检(肿瘤活检相对于毗邻的正常组织)之间蛋白表达谱的差异(图1)。生物标志物通过在石蜡切片的HCC块上进行免疫组织化学染色以及HCC患者血清中的Western印迹来验证。这样得到了要在本发明中进行评价以用于肝癌诊断目的的一组最终的15种生物标志物(图2)。
基于被靶向的生物标志物的氨基酸序列，采用商业合成的cDNA克隆表达生物标志物组(图3)。然后使从cDNA克隆表达的蛋白接受一系列步骤的纯化(图4)。经纯化的生物标志物随后经稳定的酰胺键与BioPlex珠缀合(图5、6)，BioPlex珠是一种荧光微球珠，可成组存在，其各自产生独特荧光信号用于在多路装置中标识。珠上的生物标志物被特异性一抗识别，该特异性一抗随后被与PE缀合的抗人二抗结合(图7)。因此BioPlex机器从复合物同时测量到两个信号。BioPlex珠发出的荧光充当标识物，同时来自PE的信号指示生物标志物存在于复合物中。这也有助于将通过抗体级联反应结合的生物标志物-珠缀合物和与抗体没有免疫反应性的那些生物标志物-珠缀合物区分开。
为了证明所述生物标志物在本发明中的重要性，通过限制性内切酶切割确认cDNA克隆(图8)。转化的细菌通过IPTG诱导以表达生物标志物蛋白。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色验证的蛋白表达显露了蛋白条带(图9a-e)。带His-标签的Bmi1、SOD1和IL-17A蛋白通过AKTA纯化(图10a-c)，然后通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色验证(图11a-c)。
试验的灵敏度通过在系列稀释度的抗体中加入标准品(spiking)进行测量。添加的抗体可以得到信号的最低浓度提示该特定生物标志物的灵敏度。同时，构建显示PE的荧光强度相对于系列稀释度的抗体的标准曲线(图12)。所述标准曲线可以用于通过比较PE强度来评估患者血清中生物标志物特异性自身抗体的浓度。
在本发明中，各自产生独特荧光的多个15种不同的Bioplex珠与生物标志物组缀合并且预装在平板的孔中(图13)。向孔中装入含有自身抗体的患者血清并使其与生物标志物缀合物相互作用。然后加入PE-缀合的二抗并使其与自身抗体结合。在机器中，洗掉过量的二抗，各自地测量包含生物标志物-珠缀合物以及级联的抗体复合物。Bioplex珠的独特荧光信号标识生物标志物，而来自相同复合物的PE信号指示自身抗体作为一抗存在(图7)。总起来说，测量值将提示自身抗体的存在以及患者血清中的相对浓度。
在标准化随机化试验设计中，比较健康组和诊断患有肝癌的患者之间自身抗体的相对水平的均值。使用T检验来分析变异显著性。显著性差异指示所述生物标志物对于肝癌是特异性的。在验证试验后，将获得肝癌阳性和阴性患者的生物标志物特异性自身抗体的浓度范围并将其用作未来诊断的参考点。同时，还在不同时期的肝癌患者之间比较自身抗体的表达谱。生物标志物表达的特征谱将指示HCC分期。
总起来说，对相对自身抗体水平和生物标志物的表达谱的测量，本发明代表了补充常规肝癌诊断的不同方法。本发明进一步能够无创地检测针对患者血清中的本发明的经验证的靶标的自身抗体，鉴别疾病的程度和特征。除了早期检测I期肝癌以外，本发明还能够生成用于分期的特征谱，并检测乳房切除术后或化疗治疗后的监测期期间的复发。
实施例
通过描述本发明的具体实施方案提供下面的实施例，而不意在以任何方式限制本发明的范围。
实施例1a
从患者的活检中提取蛋白
收集500mg患者的配对活检(肿瘤活检相对于毗邻的正常组织)并用PBS洗涤。通过浸没在液氮中冷冻组织，并立即用研杵和研钵将组织匀浆。向匀浆的样品中，加入裂解溶液(8M尿素，4％CHAPS,2％IPG缓冲液，0.2mg/ml PMSF)，然后涡旋至少5min直至组织完全分散。然后通过在4℃在14,000rpm离心10分钟将裂解产物澄清。通过2D Clean Up kit(清洗试剂盒)(Amersham)进一步清洗上清液以去除盐和杂质。用最小体积的再水化溶液(不添加DTT&IPG缓冲液)将片状沉淀物重悬。然后通过Bio-Rad蛋白测定法测量蛋白浓度，并将200g/管的等分试样在-70℃保存。
实施例1b
通过二维电泳解析蛋白
向1ml再水化贮备溶液加入2.8mg DTT、5μl pharmalyte或IPG缓冲液和2μl溴酚蓝。将50–100μg蛋白样品加入至含有250μl再水化溶液的13cm Immobiline DryStrip(IPG条)。在去除保护盖后，将IPG条定位在条架中，凝胶侧向下，并且用Cover Fluid覆盖以防止电泳期间脱水。然后将条放置在Ettan IPGphor(Amersham)上以进行等电点聚焦(第一维电泳)。
在第一维电泳后，用平衡溶液(6M尿素2％SDS、50mM Tris HCl pH 6.8、30％甘油、0.002％溴酚蓝、每10ml缓冲液100mg DTT和每10ml缓冲液250mg IAA)将IPG条平衡，然后用1x SDS电泳缓冲液洗涤4–5次。将IPG条放置在第二维凝胶的顶部上面并且用密封溶液(在1×SDS电泳缓冲液中的0.5％低熔点琼脂糖、0.002％溴酚蓝)覆盖。然后进行第二维电泳：先30mA进行15min，接着以60mA进行3-4h。
在完成第二维电泳后，从盒上取出凝胶，将其固定并用硝酸银染色。鉴定出代表15种上调的蛋白的15个点(图1)。为了鉴定蛋白(图2)，将银染色的凝胶切片脱色并用胰蛋白酶消化以从凝胶中释放蛋白用于MALDI-TOF分析。
实施例2a(SEQ ID NO.1)
Bmi1的氨基酸序列
MHRTTRIKITELNPHLMCVLCGGYFIDATTIIECLHSFCKTCIVRYLETSKYCPICDVQVHKTRPLLNIRSDKTLQDIVYKLVPGLFKNEMKRRRDFYAAHPSADAANGSNEDRGEVADEDKRIITDDEIISLSIEFFDQNRLDRKVNKDKEKSKEEVNDKRYLRCPAAMTVMHLRKFLRSKMDIPNTFQIDVMYEEEPLKDYYTLMDIAYIYTWRRNGPLPLKYRVRPTCKRMKISHQRDGLTNAGELESDSGSDKANSPAGGIPSTSSCLPSPSTPVQSPHPQFPHISSTMNGTSNSPSGNHQSSFANRPRKSSVNGSSATSSG
实施例2b(SEQ ID NO.2)
VCC1的氨基酸序列
MKVLISSLLLLLPLMLMSMVSSSLNPGVARGHRDRGQASRRWLQEGGQECECKDWFLRAPRRKFMTVSGLPKKQCPCDHFKGNVKKTRHQRHHRKPNKHSRACQQFLKQCQLRSFALPL
实施例2c(SEQ ID NO.3)
SUMO-4的氨基酸序列
MANEKPTEEVKTENNNHINLKVAGQDGSVVQFKIKRQTPLSKLMKAYCEPRGLSVKQIRFRFGGQPISGTDKPAQLEMEDEDTIDVFQQPTGGVY
实施例2d(SEQ ID NO.4)
RhoA的氨基酸序列
MAAIRKKLVIVGDGACGKTCLLIVFSKDQFPEVYVPTVFENYVADIEVDGKQVELALWDTAGQEDYDRLRPLSYPDTDVILMCFSIDSPDSLENIPEKWTPEVKHFCPNVPIILVGNKKDLRNDEHTRRELAKMKQEPVKPEEGRDMANRIGAFGYMECSAKTKDGVREVFEMATRAALQARRGKKKSGCLVL
实施例2e(SEQ ID NO.5)
TXN的氨基酸序列
MVKQIESKTAFQEALDAAGDKLVVVDFSATWCGPCKMIKPFFHSLSEKYSNVIFLEVDVDDCQDVASECEVKCMPTFQFFKKGQKVGEFSGANKEKLEATINELV
实施例2f(SEQ ID NO.6)
ET-1的氨基酸序列
MDYLLMIFSLLFVACQGAPETAVLGAELSAVGENGGEKPTPSPPWRLRRSKRCSCSSLMDKECVYFCHLDIIWVNTPEHVVPYGLGSPRSKRALENLLPTKATDRENRCQCASQKDKKCWNFCQAGKELRAEDIMEKDWNNHKKGKDCSKLGKKCIYQQLVRGRKIRRSSEEHLRQTRSETMRNSVKSSFHDPKLKGNPSRERYVTHNRAHW
实施例2g(SEQ ID NO.7)
UBE2C的氨基酸序列
MASQNRDPAATSVAAARKGAEPSGGAARGPVGKRLQQELMTLMMSGDKGISAFPESDNLFKWVGTIHGAAGTVYEDLRYKLSLEFPSGYPYNAPTVKFLTPCYHPNVDTQGNICLDILKEKWSALYDVRTILLSIQSLLGEPNIDSPLNTHAAELWKNPTAFKKYLQETYSKQVTSQEP
实施例2h(SEQ ID NO.8)
HDGF2的氨基酸序列
MARPRPREYKAGDLVFAKMKGYPHWPARIDELPEGAVKPPANKYPIFFFGTHETAFLGPKDLFPYKEYKDKFGKSNKRKGFNEGLWEIENNPGVKFTGYQAIQQQSSSETEGEGGNTADASSEEEGDRVEEDGKGKRKNEKAGSKRKKSYTSKKSSKQSRKSPGDEDDKDCKEEENKSSSEGGDAGNDTRNTTSDLQKTSEGT
实施例2i(SEQ ID NO.9)
FGF21的氨基酸序列
MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLLGACQAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS
实施例2j(SEQ ID NO.10)
LECT2的氨基酸序列
MFSTKALLLAGLISTALAGPWANICAGKSSNEIRTCDRHGCGQYSAQRSQRPHQGVDVLCSAGSTVYAPFTGMIVGQEKPYQNKNAINNGVRISGRGFCVKMFYIKPIKYKGPIKKGEKLGTLLPLQKVYPGIQSHVHIENCDSSDPTAYL
实施例2k(SEQ ID NO.11)
SOD1的氨基酸序列
MATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ
实施例2l(SEQ ID NO.12)
STMN4的氨基酸序列
MTLAAYKEKMKELPLVSLFCSCFLADPLNKSSYKYEADTVDLNWCVISDMEVIELNKCTSGQSFEVILKPPSFDGVPEFNASLPRRRDPSLEEIQKKLEAAEERRKYQEAELLKHLAEKREHEREVIQKAIEENNNFIKMAKEKLAQKMESNKENREAHLAAMLERLQEKDKHAEEVRKNKELKEEASR
实施例2m(SEQ ID NO.13)
中期因子(midkine)的氨基酸序列
MQHRGFLLLTLLALLALTSAVAKKKDKVKKGGPGSECAEWAWGPCTPSSKDCGVGFREGTCGAQTQRIRCRVPCNWKKEFGADCKYKFENWGACDGGTGTKVRQGTLKKARYNAQCQETIRVTKPCTPKTKAKAKAKKGKGKD
实施例2n(SEQ ID NO.14)
IL-17A的氨基酸序列
MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA
实施例2o(SEQ ID NO.15)
IL-26的氨基酸序列
MLVNFILRCGLLLVTLSLAIAKHKQSSFTKSCYPRGTLSQAVDALYIKAAWLKATIPEDRIKNIRLLKKKTKKQFMKNCQFQEQLLSFFMEDVFGQLQLQGCKKIRFVEDFHSLRQKLSHCISCASSAREMKSITRMKRIFYRIGNKGIYKAISELDILLSWIKKLLESSQ
实施例3a
生物标志物组的表达
将含有编码生物标志物组的cDNA插入物的带His标签的质粒转化至DH5感受态细胞中(301,图3)。挑出单个集落并使其在细菌培养物中生长(302)。扩充质粒的数目，并通过miniprep从细菌中提取质粒。将质粒进一步转化至BL21DE3或BL21DE3pLysS感受态细胞中。选择转化的细菌并使其在2X 100ml LB培养基中生长。当细菌培养物达到0.06的光密度时，向100ml细菌培养物加入200μM IPTG(303)。使用不含IPTG的另外100ml细菌培养物作为阴性对照。将细菌培养物在30℃摇动孵育。在孵育后3h以及在孵育过夜后的第二天早晨保留500μl细菌培养物并在-20℃贮存。
将进行IPTG诱导以及未进行IPTG诱导的细菌培养物在500ml离心瓶中混合在一起。通过在4℃以9000rpm离心20min收集细菌细胞(304)。保留500μl上清液作为另一阴性对照，并弃去剩余的上清液。对在不同的点收集的细菌培养物和阴性对照进行SDS-PAGE电泳以解析蛋白(305)。然后将凝胶用考马斯蓝染色过夜。在将凝胶脱色后，可以通过检查尺寸和与阴性对照比较来确认蛋白诱导。
实施例3b
对生物标志物组的蛋白纯化
将细菌细胞片状沉淀物通过在室温下涡旋重悬在10ml增溶缓冲液中。将重悬的细胞保持在处于冰上的50ml离心管中，通过以70％的振幅进行10轮超声完全裂解细胞，每轮为超声30秒、间隔30秒(401,图4)。裂解的细胞在4℃以10,000rpm离心1h(402)。将上清液转移至透析管中并浸没在4℃的1L未过滤的起始缓冲液4-6h并持续搅拌(403)。用另一份1L起始缓冲液继续透析过夜。上清液进一步用0.22μm滤片和注射器过滤。向装配有装填了0.1M硫酸镍的HiTrap螯合柱的AKTA机器(404)中加载经过滤的样品(405)。在AKTA机器上设定程序，自动地将洗脱液以多个级分收集(406)。从不同级分纯化的蛋白通过SDS-PAGE分析检查(407)。
实施例4a
蛋白与Bio-Plex珠的偶联
根据生产厂商的指导手册将纯化的生物标志物组的蛋白与Bio-Plex珠(Bio-Rad)偶联(501)。简言之，将未偶联的珠子涡旋30s，然后超声作用15s。通过以最大速度将100μl珠子离心4min将1,250,000个珠子收集在反应管中。在用100μl珠子洗涤缓冲液通过离心洗涤后，将珠子重悬在80μl珠子活化缓冲液中。向珠子添加10μl 50mg/ml新鲜制备的N-羟基磺酸琥珀酰亚胺(S-NHS)和10μl 50mg/ml新鲜制备的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，接着在室温下在暗处孵育20min(图6)。然后用150μl PBS洗涤珠子两次。
向洗涤过的珠子添加10μg蛋白，并用PBS将总体积加满至500μl,并使其在暗处摇动孵育2h。在以最大速度离心4min后去除上清液。向珠子添加250μl封闭缓冲液并在暗处震摇30min,接着以最大速度离心4min，并移除上清液。将珠子简单洗涤，然后将其重悬在储存缓冲液中在4℃储存。利用血细胞计数器计数珠子的数目。
实施例4b
对蛋白-珠子偶联的验证
向HTS 96孔板加入50μl缀合的Bio-Plex珠(100珠/μl)以与一抗反应，然后与二抗反应(502)。制备市售的针对生物标志物组的一抗的系列稀释液：8,000、4,000、1,000、250、62.5、15.625、3.906、0.977、0.244和0.061ng/ml。将50μl每种稀释液加入至每孔中。通过在孔中不包括一抗、以及一抗和二抗两者制备两个阴性对照。然后用箔封闭板，并将其保持在振荡器上以350rpm持续30min，并避光。
孵育后，用150μl PBS洗涤珠子3次。将50μl PE-缀合的二抗(8,000ng/ml)添加至每孔中，除了阴性对照以外。再次密封板，将板在暗处摇动孵育30min。然后通过PBS洗掉过量的抗体。用校正试剂盒和验证试剂盒校正Bio-Plex机器。在将HTS板加载至机器上后，测量来自Bio-Plex珠和二抗上缀合的PE两者的信号(503)(示意图显示在图7中)。通过Logistic-5PL生成校正曲线。
实施例4c:
通过BioPlex系统收集血清样品并测量自身抗体
通过在37℃静置1h使全血样品凝固。在以1000g室温离心10min后在上清液收集包含自身抗体的血清。当需要时用PBS稀释血清样品。向预先装载了缀合有生物标志物组的Bioplex珠的HTS板加载血清样品、摇动孵育30min(图13)。类似于实施例4b中所述的步骤，向PBS洗过的珠子加入50μl PE-缀合的二抗(8000ng/ml)，接着震荡另外30min。在三轮洗涤后，将板加载至Bio-Plex机器并测量荧光信号(504)。然后可以从标准曲线计算自身抗体的浓度。
为了说明和描述的目的，前面已经提供了对本发明的描述。其不意在是穷尽的或限制本发明于所公开的准确形式。许多改型和变化形式对于本领域中熟练的从业人员来说是显而易见的。
选择并描述多个实施方案以最好地解释本发明的原理及其实际应用，由此使得本领域其他技术人员能够理解本发明的多种实施方案并利用适合于所考虑的特定用途的各种改型。意在由下面的权利要求及其等效形式限定本发明的范围。
工业实用性
本申请要求保护的方法和包含15种经鉴定的生物标志物的试剂盒可以不仅用来鉴定和定量患者血清中自身抗体的存在以对肝癌进行检测和/或分期，而且也可用于靶向这些标志物的药物开发以用于专门地治疗肝癌。

Claims (7)

1.包含Bmi-1、VCC1、SUMO-4、RhoA、TXN、ET-1、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、SOD1、STMN4、中期因子、IL-17A和IL26的一组生物标志物在制备用于测量肝细胞癌(HCC)生物标志物在疑似患HCC的受试者中存在的诊断剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述一组生物标志物被制备来通过以下方法进行所述测量，所述方法包括：
a.从所述疑似患HCC的受试者获得血清样品，并针对所述一组生物标志物的一抗自身抗体(生物标志物一抗自身抗体)的存在测量所述血清；
b.检测所述HCC生物标志物在所述疑似患HCC的受试者中的存在，所述方法包括以下步骤：
i.将所述血清样品与所述一组生物标志物缀合物混合，以使得所述生物标志物一抗自身抗体─如果存在于所述血清样品中的话─结合至所述一组生物标志物缀合物，并且洗涤去除任何未结合的抗体；
其中所述一组生物标志物缀合物包含通过酰胺键缀合至独特荧光微球珠的所述一组生物标志物中的各生物标志物，其中与所述一组生物标志物中的特定具体生物标志物相关联的各独特荧光微球珠具有对各生物标志物不同的发射波长，
其中所述生物标志物缀合物能够被所述受试者血清样品中存在的特定生物标志物一抗自身抗体结合，
ii.向步骤i中形成的混合物加入能够结合生物标志物一抗自身抗体的与藻红蛋白(PE)缀合的抗人二抗；并且使所述与PE缀合的抗人二抗结合至与生物标志物缀合物结合的特定一抗，以形成荧光珠-生物标志物-自身抗体-PE缀合的抗体级联；并且洗涤去除未结合的抗体；以及
iii.针对所述荧光珠-生物标志物-自身抗体-PE缀合的抗体级联的存在测量步骤ii中形成的混合物，以确定所述受试者血清是否含有所述生物标志物一抗自身抗体。
3.权利要求2所述的用途，其中来自所述微球珠的独特荧光信号用于鉴别所述组生物标志物中的哪种生物标志物存在，并且其中来自所述PE的信号指示所述生物标志物缀合物的存在。
4.权利要求3所述的用途，其中测量由所述荧光珠-生物标志物-自身抗体-PE缀合的抗体级联中的所述PE-缀合的二抗提供的荧光强度以允许检测和定量所述生物标志物一抗自身抗体。
5.权利要求1或2所述的用途，其中所述组生物标志物由下述组成：Bmi-1、VCC1、SUMO-4、RhoA、TXN、ET-1、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、SOD1、STMN4、中期因子、IL-17A和IL26。
6.包含Bmi-1、VCC1、SUMO-4、RhoA、TXN、ET-1、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、SOD1、STMN4、中期因子、IL-17A和IL26的一组生物标志物在制备用于测量肝细胞癌(HCC)生物标志物在患处于不同时期的肝细胞癌(HCC)的多个受试者中存在的诊断剂中的用途。
7.权利要求6所述的用途，其中所述一组生物标志物被制备来通过以下方法进行所述测量，所述方法包括：
a.从所述患处于不同时期的HCC的多个受试者获得血清样品，并针对所述一组生物标志物的一抗自身抗体(生物标志物一抗自身抗体)的存在测量所述血清；
b.检测所述HCC生物标志物在所述患处于不同时期的HCC的多个受试者中的存在，所述方法包括以下步骤：
i.将所述血清样品与所述一组生物标志物缀合物混合，以使得所述生物标志物一抗自身抗体─如果存在于所述血清样品中的话─结合至所述一组生物标志物缀合物，并且洗涤去除任何未结合的抗体；
其中所述一组生物标志物缀合物包含通过酰胺键缀合至独特荧光微球珠的所述一组生物标志物中的各生物标志物，其中与所述一组生物标志物中的特定具体生物标志物相关联的各独特荧光微球珠具有对各生物标志物不同的发射波长，
其中所述生物标志物缀合物能够被所述受试者血清样品中存在的特定生物标志物一抗自身抗体结合，
ii.向步骤i中形成的混合物加入能够结合生物标志物一抗自身抗体的与藻红蛋白(PE)缀合的抗人二抗；并且使所述与PE缀合的抗人二抗结合至与生物标志物缀合物结合的特定一抗，以形成荧光珠-生物标志物-自身抗体-PE缀合的抗体级联；并且洗涤去除未结合的抗体；以及
iii.针对所述荧光珠-生物标志物-自身抗体-PE缀合的抗体级联的存在测量步骤ii中形成的混合物，以确定所述多个受试者血清是否含有所述生物标志物一抗自身抗体。
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