JP3960614B2 - 抗ペプチド抗体測定法とペプチドワクチンのワクチン候補選択方法 - Google Patents
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Description
下記の(表1)に示す細胞傷害性Tリンパ球(CTL)エピトープペプチドはGMP(製造及び品質管理に関する基準)条件下で調製した。
細胞傷害性Tリンパ球(以下、CTL)エピトープペプチドを、製造者の指示に従って各蛍光色素の含有量を識別コード(以下、カラーコード)化した微小ビーズにそれぞれ次のようにして結合した。フィルタープレートの各ウェルにカラーコード化した未調製の微小ビーズを100μlずつ入れて吸引し、その後洗浄用緩衝液(リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)(pH7.4±0.1)、TWEEN(登録商標)20(0.05%v/v))で2回洗浄し各ウェルを同時に吸引した。次に0.1M MES緩衝液(pH 7.0)50μlを入れ、EDC(1mg/ml in 0.1M MES緩衝液(pH7.0))を各ウェル10μlずつ添加した。数百μlのCTLエピトープペプチド(1mg/ml,0.1M MES緩衝液、pH 7.0)をこの洗浄した微小ビーズと各ウェル内で混合した。その後ペプチドと混合した微小ビーズを、暗所で20分間、室温で反応させた後、さらにEDC(1 mg/ml in 0.1M MES緩衝液(pH 7.0))を各ウェル10μlずつ添加し、暗所で、20分間室温で反応させる操作を2回繰り返した。余剰液を吸引後、1Mトリス塩酸緩衝液(pH7.0)を各ウェル100μlずつ添加し、暗所で、15分間室温で反応させた。次に、各ウェルのビーズを上記洗浄用緩衝液で3回洗浄し、ブロックエース(登録商標)に0.05%アジ化ナトリウムを入れて調整した保存用溶液で回収した。
各ウェルの微小ビーズを調製するときは、上記のようにカラーコード化した微小ビーズにペプチドを結合させて得たビーズ溶液をフィルタープレートの各ウェル当たり微小ビーズが約5000個になるように入れて(各ウェル当たりビーズ1種類約1μl)調製する。また、このように調製した微小ビーズを10種類等量で混ぜて、上記洗浄用緩衝液(PBS、TWEEN(登録商標)20(0.05%v/v))で総量が約25μlになるように希釈してビーズミックスを調製した。
サンプル(本発明の検体)としてはがん患者からの血清を使用した。血清を反応用緩衝液(PBS(pH
7.4±0.1)、TWEEN(登録商標)20(0.05%v/v)、牛胎児血清アルブミン(BSA)10
mg/ml)を用いて100〜1000倍希釈した血清希釈液をそれぞれ100μl調製した。
ビオチン化二次抗体としては、ビオチン化ヤギ抗ヒトIgG(ガンマ鎖特異的)を上記反応用緩衝液で希釈して使用した。
PE(フィコエリスリン)で標識したストレプトアビジン(SRPE)1 mg/mlを上記反応用緩衝液で 20μlに希釈(1/50希釈)して使用した。
フィルタープレートの各ウェルに上記洗浄用緩衝液を100μl入れ、続いて吸引除去した。この洗浄操作を2回行った。次に、各ウェルに上記ビーズミックスを25μl入れた96ウェルのフィルタープレートを該洗浄用緩衝液で2回洗浄した。洗浄後、全てのウェルに上記サンプルをそれぞれ100μl入れた。次にフィルタープレートにカバーをして暗所で、2時間室温でプレートシェーカー(300rpm)を用いて振とうした後、吸引した。続いて、各ウェルに上記洗浄用緩衝液をそれぞれ100μl入れ、吸引除去した。この洗浄操作を3回行った。
まず、標準抗体として、SART3-109ペプチドをワクチン注射したがん患者からの抗体を調製した。標準抗体は、各ペプチドに結合したサンプルの抗体の数を推定するための標準値を得るためのものである。この標準抗体を、上記方法で予めSART3-109を結合したカラーコード化した微小ビーズに結合させ、微小ビーズの識別コードにより分類した。次に、ストレプトアビジン−PE(フィコエリスリン)を検体に結合させ、蛍光強度575±12nmで検出した。なお、SART3-109ペプチドに対する標準抗体は後記する図4(C)に示すように濃度依存的になり、ペプチドに結合した抗体分子の数は、標準抗体から得られた標準曲線から推定することができる。標準抗体を用いて標準曲線を作成することは実験室内で行うことができる。
上記標準抗体を使用した抗ペプチド抗体分子の測定結果を図4、図5に基づいて説明する。図4は標準抗体を使用した抗ペプチド抗体分子の第1の測定結果を示す図、図5は標準抗体を使用した抗ペプチド抗体分子の第2の測定結果を示す図である。図4(a)は、18回目のペプチドワクチン投与後の大腸がん患者のワクチン投与後血清から調製したペプチドSART3-109に反応する部分的に精製したIgG(標準抗体)のプロテインGアフィニティーカラムクロマトグラフィーの結果を示すもので、プロテインGカラムに吸着後、溶出したクロマトグラムの図である。280nmの波長で吸光度を測定し、溶出順の14番目から16番目にIgG(標準抗体)が存在していることを示している。図4(b)は、この抗SART3-109部分精製抗体が、ペプチドSART3-109に対する濃度依存的反応性を有すことを従来のELISAによって確認した図を示す。図4(c)は、ペプチド特異性を吸収試験によって確認した図を示す。図5(a)は、微小ビーズのビーズサイズとビーズ数を示したものであり、ペプチドSART3-109のを結合したビーズが同じビーズサイズで正しくカウントされていることを示している。図5(b)は、各ペプチドを結合した微小ビーズを、ビーズの識別コード毎に分類し、各ペプチドを結合したビーズを識別コード(ここでは蛍光波長の組み合わせによるカラーコード)により特定したもので、図5(b)の矢印は、SART3-109を結合したビーズに対応するカラーコードの領域を示す。領域内の点の集合が同じカラーコードのビーズの集合を示している。図5(c)は、この微小ビーズを、575±12nmの波長でもって測定した結果、標準抗体の蛍光強度が濃度依存的に増加することを確認した図を示す。なお、リニアダイナミック領域は0.01pmol−1pmolであった。
標準ELISA法は、本発明の抗ペプチド抗体測定法と測定結果を比較するための従来のELISA法である。この標準ELISA法の説明をすると、ペプチド(20μg/ml)を固定したマイクロプレートをブロックエース(登録商標)でブロッキングし、洗浄用緩衝液(PBS、TWEEN(登録商標)20(0.05%v/v))で洗浄した。このマイクロプレートに血清サンプル100μlを添加し、37℃で2時間反応した後、このマイクロプレートを洗浄用緩衝液で洗浄し、更にラビット抗ヒトIgG(ガンマ鎖特異的)を用いて37℃で2時間反応した。このように処理したマイクロプレートを、洗浄用緩衝液で洗浄した後、西洋ワサビパーオキシダーゼーデキストランポリマー共役抗ラビットIgGを各ウェルに添加し、室温で40分間反応した。マイクロプレートを洗浄後、テトラメチルベンジジン基質溶液100μlを添加し、1Mリン酸を添加して反応を停止させた。吸光度を450−620nmで測定した。
本発明の個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法と従来のELISA法の感度限界を決定するために、健常人14名からの血清を用いて陰性コントロールとしての抗HIVペプチド抗体レベルを測定した。図6、図7に示すようにELISAによる吸光度の平均値は0.040であるのに対して、本発明の抗ペプチド抗体測定法による蛍光強度の平均値は296であった。各値はカットオフ値として採用した。なお、ここで用いた平均値は健常人の通常の値を示すため、感度限界(感度と信頼性との調和点)として妥当なラインを示すが、より信頼性を高めた判断をするには、標準偏差SDを利用し、(平均値+SD)若しくは(平均値+2SD)を採用することもできる。
本発明の個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法がワクチンしたペプチドに反応する抗体レベルを正確に定量できるかどうかを試験するために、本発明の抗ペプチド抗体測定法を標準ELISA法と比較した。
本発明の個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法と標準ELISA法との間でのペプチド反応性のパターンを比較した。その結果を図7に示す。
本発明の個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法のモニターシステムとしての利用可能性について検討した。4つの異なる設定条件(ペプチド1個、10個、50個ならびに100個に対する抗体測定に要する条件)下、並びに4つの異なる臨床スケール(患者数10名、50名、100名ならびに1000名)の条件下における必要検体量(血清)並びに作業時間を、本発明の抗ペプチド抗体測定法と標準ELISA法とで検証した。図10は本発明の実施例1における個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法と従来のELISA法との血清量、コストおよび作業時間を比較したグラフである。
本発明の個々の人ごとに有効な医療を行うためのペプチドワクチンのワクチン候補選択方法は、抗ペプチド抗体測定後に個々の人ごとに行うワクチン候補の決定方法である。従って、抗ペプチド抗体測定法としては蛍光フローメトリーアッセイ法に属する測定法であればよい。
(本発明の個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法による第1のワクチン候補選択方法)
本発明における個々の人ごとに有効な医療を行うための第1のペプチドワクチンのワクチン候補選択方法は、上述した本発明の個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法を使ってワクチン候補を決定するものである。その詳細は重複するので省略する。
(ワクチン候補決定)
本発明の個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法で採用した蛍光強度のカットオフ値は、健常人の感染症に対する陰性の限度を示す感度限界である。これを越えた場合、産生された抗ペプチド抗体の量が健常人の陰性レベルを越えており、このペプチドは既に刺激として与えられ、既に人体で抗体を産生していたと考えられる。この刺激が疾患によるものの場合、感染症陰性基準値を越えて抗ペプチド抗体の量を検出できた場合にはこの疾患の可能性を疑うのが合理的であり、これをワクチンとして投与すれば、疾患があればこの疾患に対する免疫力を高めることができる。このように感染症陰性基準値でカットオフすることによりワクチン候補を的確に絞り込むことができる。
個々の人ごとに有効な医療を行うための第2のペプチドワクチンのワクチン候補選択方法は、マイクロチューブ等を使った蛍光フローメトリーアッセイ法によるペプチドワクチンのワクチン候補選択方法である。
細胞傷害性Tリンパ球(以下、CTL)エピトープペプチドを、製造者の指示に従って各蛍光色素の含有量を識別コード(カラーコード)化した微小ビーズにそれぞれ次のようにして結合した。カラーコード化した微小ビーズ100μlをマイクロチューブに入れ、10分間遠心分離(15000rpm)後、上澄みを除去した。次に0.1M
MES緩衝液(pH 4.5)を400μl添加し、5分間遠心分離(15000rpm)後、上澄みを除去し洗浄した。この洗浄操作を2回繰り返した。数百μlのCTLエピトープペプチド(1 mg/ml, 0.1M MES緩衝液、pH
4.5)をこの洗浄した微小ビーズと混合し、EDC(1 mg/ml in ddw)を20μl添加して、攪拌後、暗所で、30分間室温で反応した。さらに、EDCを添加後30分間の反応を2回繰り返した。その後、洗浄用緩衝液1mlをマイクロチューブに添加し、攪拌後、5分間遠心分離(15000rpm)し、上澄みを除去した。次に、洗浄用緩衝液を400μl添加し、攪拌後、2−アミノエタノール(5%v/v in ddw)20μlを添加し攪拌して、暗所で15分間室温で反応した。反応後、洗浄用緩衝液400μlを添加し5分間遠心分離(15000rpm)した後、上澄みを除去し洗浄した。この洗浄操作を2回繰り返した。洗浄用緩衝液中に0.05%のアジ化ナトリウムを入れて調整した保存用溶液を用いて再懸濁し、ペプチド結合ビーズを回収した。
(ワクチン候補決定)
抗ペプチド抗体が感染症陰性基準値を越えた場合に、このペプチドをペプチドワクチンとする。また、感染症陰性基準値として抗HIVペプチド抗体陰性基準値を採用すれば、確実に感染症陰性の限度を示し、ペプチドワクチンのワクチン候補を決定する基準値として最適なものとなる。この場合の抗HIVペプチド抗体陰性基準値も296となる。また、投与前の検体と投与後の検体のペプチド認識抗体の結合量を比較し、増加している場合だけワクチン候補とするものである。
2 ペプチド
3 表面処理部
4 ペプチド認識抗体
5 二次抗体
6 標識
10 真空マニホールド装置
11 フィルタープレート
12 ウェル
13 フィルター
14 真空ポンプ
21 透光性細管
22 担持体検出用レーザー
23 標識検出用レーザー
25,26 受光センサ
Claims (11)
- 相互に識別可能でそれぞれに別種のペプチドが固相化された複数種類の担持体を調製し、調製後の複数種類の担持体に患者から得た検体を注いで該検体に含まれるペプチド認識抗体を前記ペプチドと特異的に反応させ、該反応で前記ペプチドに結合したペプチド認識抗体に対して更に二次抗体を結合するとともに、該二次抗体に標識を結合して、該標識の結合量の測定と前記担持体の種類の識別を行い、前記ペプチド認識抗体の結合量と種類とを測定する個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法であって、プレート上に配列した複数のウェル内のフィルター上に未調製の複数種類の担持体をそれぞれ収容し、前記フィルターを介して接続された減圧室を吸引することにより前記担持体のそれぞれにこれを均一の分布状態に整然と配列させることができる吸引力を共通に作用させて、前記複数のウェルで各担持体にそれぞれのペプチドを時間的に並行して同一の条件で固相化し、前記複数のウェルにおける各担持体の調製を一括して同時に行うことを特徴とする個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法。
- 前記ペプチドが癌組織由来のペプチドであって、癌の症例ごとに異なった数の担持体を調製することを特徴とする請求項1記載の個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法。
- 前記担持体が複数の蛍光色素を使って種類を識別する微小ビーズであることを特徴とする請求項1または2に記載された個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法。
- 前記標識が前記二次抗体に対する蛍光色素による染色であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載された個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法。
- 前記調製を行うとき、前記フィルター上にそれぞれ別種で未調製の担持体を収容し前記フィルターを介して同時に吸引する第1の工程と、緩衝液を注いで各ウェルを前記フィルター側から同時に吸引する第2の工程と、各ウェルに結合試薬を注いだ後前記ペプチドの溶液を添加し反応させる第3の工程と、さらに結合試薬を添加して反応を促進させる第4の工程と、前記フィルターを介して余剰液を各ウェルから同時に吸引する第5の工程と、を行うことを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載された個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法。
- 前記調製を行うとき、前記第2の工程と前記第4の工程を少なくとも2回以上繰り返して行うことを特徴とする請求5記載の個々の人ごとに有効な医療を行うための抗ペプチド抗体測定法。
- 相互に識別可能でそれぞれに別種のペプチドが固相化された複数種類の担持体を調製し、調製後の複数種類の担持体に患者から得た検体を注いで該検体に含まれるペプチド認識抗体を前記ペプチドと特異的に反応させ、該反応で前記ペプチドに結合したペプチド認識抗体に対して更に二次抗体を結合するとともに、該二次抗体に標識を結合して、該標識の結合量の測定と前記担持体の種類の識別を行い、前記ペプチド認識抗体の結合量と種類とを測定し、前記ペプチド認識抗体の結合量に基づいてペプチドを選んで前記検体に対するワクチン候補とする個々の人ごとに有効な医療を行うためのペプチドワクチンのワクチン候補選択方法であって、前記ペプチドワクチンの投与後に採取した検体のペプチド認識抗体の結合量が、前記感染症陰性基準値を越えると共に、投与前のペプチド認識抗体の結合量より増加している場合のペプチドだけをワクチン候補とすることを特徴とする個々の人ごとに有効な医療を行うためのペプチドワクチンのワクチン候補選択方法。
- 前記ペプチドが癌組織由来のペプチドであって、癌の症例ごとに異なった数の担持体を調製することを特徴とする請求項7記載の個々の人ごとに有効な医療を行うためのペプチドワクチンのワクチン候補選択方法。
- 前記感染症陰性基準値が抗HIVペプチド抗体陰性基準値であることを特徴とする請求項7または8に記載された個々の人ごとに有効な医療を行うためのペプチドワクチンのワクチン候補選択方法。
- 前記ペプチド認識抗体の結合量の増加からワクチン候補を決定するとき、前記ペプチドワクチンを所定回数投与し、前記ペプチド認識抗体の結合量が投与前より一度も増加しなかったペプチドを除いて、ワクチン候補とすることを特徴とする請求項7〜9のいずれかに記載された個々の人ごとに有効な医療を行うためのペプチドワクチンのワクチン候補選択方法。
- 請求項7〜10のいずれかに記載された個々の人ごとに有効な医療を行うためのペプチドワクチンのワクチン候補選択方法において、相互に識別可能でそれぞれに別種のペプチドが固相化された複数種類の担持体を調製するのに代えて、プレート上に配列した複数のウェル内に同時に共通の吸引力を作用させて、相互に識別可能でそれぞれに別種のペプチドが固相化された複数種類の担持体を一括して同時に調製することを特徴とする個々の人ごとに有効な医療を行うためのペプチドワクチンのワクチン候補選択方法。
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