TW201602579A

TW201602579A - 用於非侵入性肝癌診斷之特異性生物標記組

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Publication number: TW201602579A
Application number: TW103126171A
Authority: TW
Inventors: 詠賢文; 鳳文衞; 炳鏐黃; 智賢繯
Original assignee: 龍勝發展有限公司
Priority date: 2014-07-02
Filing date: 2014-07-31
Publication date: 2016-01-16
Also published as: HK1224370A1; CN107478842B; SG11201606106SA; JP2017520763A; CN105319362B; JP2020160082A; CN105319362A; AU2014399919B2; CN107478842A; NZ722492A; UY36200A; AU2017232129A1; AU2014399919A1; HK1248803A1; KR20170021234A; CA2939912C; WO2016003479A1; MY179845A; EP3164711A4; AU2017232129B2

Abstract

肝腫瘤塊狀物內細胞與並置正常肝組織上皮細胞相比當包含獨特蛋白/腫瘤抗原組。腫瘤抗原的存在與針對此腫瘤抗原之自體抗體的產生相關連。本發明係關於可用於肝癌診斷及預測的新穎標記蛋白組的鑑別及闡明。特定言之，本發明係關於一種能夠診斷預測，測量肝癌患者血清中之自體抗體的裝備。本發明提供一種非侵入性、特異性強、靈敏度高、且成本有效的偵測及定量方法，通過對以下經驗證肝癌蛋白組/腫瘤抗原組Bmi-1、VCC1、SUMO-4、RhoA、TXN、ET-1、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、SOD1、STMN4、中期因子(Midkine)、IL-17A或IL26的評估以補充傳統診斷方法

Description

用於非侵入性肝癌診斷之特異性生物標記組

【相關申請案之交叉引用】

本申請案主張2014年7月2日申請之美國非臨時專利申請案第14/321,867號及2014年7月2日申請之美國非臨時專利申請案第14/321,870號之優先權，且其揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

本發明描述一種定量偵測一系列特異性新穎肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)腫瘤生物標記的方法，通過測量肝癌患者血清中之相應自體抗體進行。該組生物標記包含Bmi1、VCC1、SUMO-4、RhoA、TXN、ET-1、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、SOD1、STMN4、中期因子(Midkine)、IL-17A及IL26。特定言之，本發明進一步描述一種高輸送量，高靈敏度的測試裝備之設計，可通過於採集患者之周邊血清樣品，測量針對至少一種選自該生物標記組之生物標記的自體抗體，從而於早期以非侵入性方式偵測肝癌。本發明可進一步偵測特徵生物標記，用於癌症鑑別分期，以及在化學療法治療後的監測階段中偵測復發。本發明將支持自動資料分析。

肝細胞癌(HCC)為中國第二大流行癌症，其覆蓋總人口之5.7%[1]。大多數HCC患者腫瘤進展快速，從而導致高死亡率。為改良整體存活率，該疾病之早期診斷成為必需。當前，偵測HCC之最常見方式為血液測試，其量測諸如α胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)之HCC腫瘤標記之含量。AFP為在胎兒發育期間由卵黃囊及肝臟產生的血漿蛋白，是血清白蛋白的一種形式。在正常條件下，AFP含量在出生之後逐漸減少且在成人中保持低含量。腫瘤標記之含量增加表明肝癌之可能性。然而，AFP測試的主要問題為過多假陽性。因為HCC並非為AFP含量升高之唯一原因，而酒精性肝炎、慢性肝炎或肝硬化亦與AFP增加有關。

儘管AFP測試通常被建議用於診斷肝癌，但其結果並非為決定性的。疑似患者將需要進行超音波成像、CT掃描或對比MRI掃描以進一步確認。進行肝臟活檢以區分腫瘤為良性或惡性。然而，HCC的傳統偵測具有若干侷限性：(a)約20%肝癌並不產生高含量之常用HCC腫瘤標記[2]。(b)病毒性肝硬化在血液測試時產生假陽性結果[3]。(c)超音波不能偵測小腫瘤[4]。(d)CT掃描需要高輻射劑量且對小於1cm之腫瘤不靈敏[5]。(e)MRI掃描很昂貴且過程很耗時間。由於此等侷限性，我們需要開發具有較高靈敏度及特異性之新穎生物標記篩檢方法以早期診斷HCC及/ 或決定HCC的預後以補充傳統方法。

肝腫瘤塊狀物內細胞與並置正常肝組織上皮細胞相比當包含獨特蛋白/腫瘤抗原組。評估經驗證HCC腫瘤生物標記可極大地促進HCC之診斷。然而，並非所有生物標記本身可在血清或尿中被發現以進行便利之診斷。作為替代，針對特異性生物標記的自體抗體提供了一種評估該類生物標記的機會。腫瘤生物標記的存在與針對此種腫瘤抗原之自體抗體的產生相關連的事實已在很多癌症中展現[6-8]。對患者血清中自體抗體的偵測可更有效地檢查生物標記的存在。在理想條件下，檢查來自周邊血液之自體抗體將為在早期以非侵入性方式偵測肝癌提供實證。阻礙臨床使用生物標記的一個常見障礙為生物標記在發現之後未能經驗證。然而一旦經驗證，此類測試將為成本有效且精確的方法。我們的原型設計亦支援高輸送量篩檢。此可降低傳統肝癌診斷所需成本。

以下為本說明書中偶爾引用之參考文獻的清單。參考文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

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本發明提供一種通過測量針對一系列特異性腫瘤生物標記之自身抗體，為癌症診斷分期的偵測及定量之方法。與正常肝上皮細胞比較，HCC腫瘤細胞傾向於產生獨特蛋白組。該獨特蛋白組(生物標記)之評估將補充傳統診斷方法，促進癌症早期偵測。

通過基於二維/質譜的方法，本發明將鑑別一系列來自患者配對活檢體(腫瘤活檢體與並置之正常組織)的肝癌生物標記，其包含Bmi1、VCC1、SUMO-4、RhoA、TXN、ET-1、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、 SOD1、STMN4、中期因子、IL-17A及IL26。

隨後，此組肝癌生物標記之特異性及精確性將被驗證，用於診斷肝癌。在本發明中，所列生物標記之蛋白將由cDNA克隆表達，純化，並與具有不同發射波長之螢光微球體珠粒耦合。存在於患者血清中的針對該等蛋白之自體抗體將與蛋白質-珠粒共軛物免疫結合。該等自體抗體隨後與共軛於PE之二級抗體相互作用。微球體珠粒之特異性螢光信號將被作為所共軛之生物標記的識別物。通過量測複合物中由共軛於PE之二級抗體產生之螢光強度，可偵測及定量該等自體抗體。由於自體抗體在患者血清中與HCC腫瘤細胞中之生物標記的數量成比例產生，故由愈高濃度之自體抗體引起之愈高螢光強度表明相應生物標記之表現愈高。針對所有血清自體抗體之各生物標記的最低偵測極限為約0.15ng/mL。

與來自健康個體之血清相比，針對目標生物標記之自體抗體的含量在癌症患者中濃度較高。此外，比較來自不同期肝癌患者之不同血清，可產生用於分期之特徵模式。因此，本發明可非侵入性評估目標肝癌生物標記。此舉能夠在早期偵測HCC，鑑別用於分期之生物標記特徵模式，以及在化學療法治療後之監測階段期間偵測復發。

【定義】

術語「生物標記(biomarker)」指與正常上皮細胞相比，在腫瘤中獨特地表達或上調之蛋白質。

術語「生物標記組(biomarker set)」指自配對患者活檢體(腫瘤活檢體與並置之正常組織)鑑別之生物標記的特定組合且為本發明中量測之目標。

術語「自體抗體(auto-antibodies)」指由患者身體與腫瘤生物標記之表現伴隨產生之抗體且其存在於循環中且可在周邊血清中收集到。

Bmi1(環指多蜂房蛋白，Polycomb Ring Finger)為一種多蜂房蛋白組(Polycomb Group，PcG)多蛋白PRC1樣複合物之蛋白組分。其負責在產生中維持多個基因(包括Hox基因)之轉錄抑制狀態。經由單泛素化組蛋白H2A『Lys-119』進行調節，該調節對組蛋白進行修飾且重塑染色質從而進行表現。

VCC1或CXCL17(趨化因子(C-X-C基元)配體17)在血管生成中且可能在腫瘤產生中起主要作用。亦提出其為調節於組織中募集非活化血液單核細胞及不成熟樹突狀細胞之管家趨化因子。其亦可在針對感染之先天性防禦中起作用。VCC1之不正常與十二指腸炎及霍亂相關。

SUMO-4(小泛素樣修飾物4)屬於小泛素相關修飾物之家族且位於細胞質中。其共價連接於目標蛋白IKBA，以控制其次細胞定位、穩定性或活性。此最終引起IL12B基因之NF-κ-B依賴性轉錄之負調節。

RhoA(Ras同源家族成員A)調節連接質膜受體與局部黏著斑及肌動蛋白應力纖維之總成的信號傳遞路徑。其亦參與細胞循環細胞質分裂期間所必需的微管依賴性信號傳遞及參與微管之穩定化及細胞遷移及黏著之其他信號傳遞路徑。

TXN(硫氧還蛋白)形成均二聚體且參與經由將其活性中心二硫醇可逆氧化為二硫化物進行之氧化還原反應且催化二硫醇-二硫化物交換反應。已報導其與乳腺黏液性癌瘤相關。

ET-1(內皮素1)為由血管內皮細胞產生之有效血管收縮劑。其結合於所有組織中廣泛表現之內皮素受體，該等組織包括非血管結構，如上皮細胞、神經膠質及神經元。除在維持血管張力中之主要作用以外，亦提出其具有共促細胞分裂活性且強化其他生長因子之作用。

UBE2C(共軛於泛素之酶E2C)屬於共軛於E2泛素之酶的家族。其為參與泛素化之三種酶之一，泛素化為用於以異常蛋白為目標以進行降解的重要細胞機制。更特定言之，UBE2C為有絲分裂細胞週期蛋白之目標性降解及細胞週期進展所必需。因此，認為此蛋白亦可能參與癌症進展。

HDGF2稱作肝腫瘤衍生之生長因子2。已報導在多種腫瘤中高度表現之此蛋白在若干腫瘤之產生及進展中起關鍵作用。儘管該機制尚待鑑別，但應提出HDGF2具有促細胞分裂、血管生成、神經營養及抗細胞凋亡活性。

FGF21(纖維母細胞生長因子21)為FGF家族之家族成員，其參與不同生物過程，包括胚胎發育、細胞生長、形態發生、組織修復、腫瘤生長及侵入。更特定言之，FGF21經由誘導葡萄糖輸送子SLC2A1/GLUT1表現刺激分化之脂肪細胞中進行葡萄糖更新。已發現FGF21與脂肪肝疾病相關。

LECT2(白血球細胞衍生之趨化因子1)為充當嗜中性白血球之趨化性因子且刺激軟骨細胞及骨母細胞生長之分泌性蛋白。此蛋白與急性肝衰竭相關。

SOD1(超氧化歧化酶1)為一種含有Cu/Zn之抗氧化酶，其負責在細胞溶質、細胞核及粒線體之膜間空間中將自由超氧化自由基分解成分子氧及過氧化氫。細胞溶質中維持低含量之超氧化物從而保護細胞免受氧化應力及隨後的細胞死亡影響很重要。

STMN4(微管解離蛋白樣4)為一種小調節蛋白，認為其在分程傳達之整合不同細胞內信號傳遞路徑中起作用，從而又控制細胞增殖、分化及功能。亦展示此蛋白藉由抑制微管聚合及/或促進其解聚合而有助於控制微管動態。

中期因子或NEGF2(神經突生長促進因子2)為一種結合肝素且對視黃酸起反應之分泌性生長因子。中期因子促進細胞生長、遷移及血管生成，尤其在腫瘤形成期間。已經展現其與乳腺癌及軟組織肉瘤相關。

IL-17A(介白素17A)為一種由經活化T細胞產生之促炎性細胞激素。其調節NF-κ B及經有絲分裂原活化之蛋白激酶的活性、刺激IL6及環加氧酶-2之表現且促進氧化氮之產生。若干慢性發炎及硬化症通常與IL-17A升高相關。

IL-26(介白素26)屬於IL-10細胞激素家族，由經活化T細胞產生且以上皮細胞為目標以進行信號轉導。其強結合於細胞表面上之葡糖胺聚糖(諸如肝素、硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素)，該等葡糖胺聚糖類似於共受體起作用以在生產細胞及目標細胞表面上富集IL-26。

下文將參考以下圖式更詳細地描述本發明之具體實例，其中：圖1展示藉由二維/質譜獲得的腫瘤活檢體與並置之正常組織之間的蛋白表現模式的差異以使得可鑑別肝癌中上調之15種特異性生物標記；箭頭指示質譜之2-D凝膠上所鑑別之點的位置。

圖2展示15種經驗證肝癌生物標記組及其在本發明中指定且量測之相應分子量。

圖3展示自cDNA克隆表達生物標記之工作流程。

圖4展示純化自大腸桿菌表達之生物標記的工作流程。

圖5展示藉由BioPlex系統量測自體抗體之工作流程。

圖6展示生物標記蛋白與BioPlex珠粒之共軛。

圖7展示生物標記-BioPlex珠粒共軛物與跟其發生免疫反應之初級抗體及共軛於PE之二級抗體的複合物的說明。

圖8展示自由限制酶HindIII及BamH1切割之質體釋放之DNA插入片段的凝膠電泳。

圖9展示經考馬斯藍(Coomassie Blue)染色之SDS-PAGE檢驗IPTG誘導的生物標記(a)Bmi1、(b)SOD1、(c)IL-17A、(d)TXN及(e)中期因子。

圖10展示AKTA中(a)Bmi1、(b)SOD-1及(e)IL-17A之洗提曲線。

圖11展示檢驗經His標記之(a)Bmi1、(b)SOD-1及(d)IL-17A生物標記之純化的經考馬斯藍染色的SDS-PAGE；洗提份A為不經IPTG誘導之細菌；洗提份B為經IPTG誘導之細菌；洗提份C為細菌溶解產物。

圖12展示展現螢光強度相對於抗Bmi1抗體之濃度的標準曲線。

圖13為展示測試之設計的示意圖：將含有自體抗體之患者血清混合於含有對應於生物標記組之15種生物標記的15種類型珠粒的孔中，隨後添加共軛於PE之二級抗體。

在以下實施方式中，將生物標記、偵測/驗證/鑑別/定量方法之相應具體實例作為較佳實施例闡述。對於熟習此項技術者顯而易見，可在不背離本發明之範疇及精神的情況下進行修改，包括添加及/或替代。可省略特定細節以免使本發明難以理解；然而，本發明經書寫以使熟習此項技術者能在不經過度實驗之情況下實踐本文中之教示。

在本發明中，首先藉由解析配對患者活檢體(腫瘤活檢體與並置之正常組織)之間的蛋白表現模式(圖1)的差異的二維/質譜鑑別用於偵測及定量肝癌之肝腫瘤生物標記組。該等生物標記藉由在石蠟切片之HCC塊上進行免疫組織化學染色及在HCC患者血清中進行西方墨點法驗證。此得到在本發明中出於肝癌診斷之目的評估之15種生物標記的最終清單(圖2)。

基於目標生物標記之胺基酸序列，採用商業上合成之cDNA克隆進行生物標記組表現(圖3)。接著對自cDNA克隆表達之蛋白進行一系列純化步驟(圖4)。隨後經純化生物標記經由穩定醯胺鍵與BioPlex珠粒共軛(圖5、圖6)，該等珠粒為一種類型之螢光微球體珠粒且可成組使用，其個別地產生獨特螢光信號以在多重設置下鑑別。珠粒上之生物標記由特異性初級抗體識別，該等抗體隨後結合於與PE共軛之抗人類二級抗體(圖 7)。因此，BioPlex機同時量測來自複合物之兩個信號。由BioPlex珠粒產生之螢光用作識別物，而來自PE之信號表明複合物中存在生物標記。此亦輔助區分結合於抗體級聯之生物標記-珠粒共軛物與不與抗體發生免疫反應之生物標記-珠粒共軛物。

在本發明中，為證明生物標記之重要性，藉由限制酶切割確認cDNA克隆(圖8)。由IPTG誘導經轉型細菌以表現生物標記蛋白。藉由SDS-PAGE及考馬斯藍染色檢驗之蛋白質表現顯示蛋白質條帶(圖9 a-e)。藉由AKTA純化經His標記之Bmi1、SOD1及IL-17A蛋白(圖10 a-c)，接著藉由SDS-PAGE及考馬斯藍染色檢驗(圖11 a-c)。

藉由添加連續稀釋之抗體量測測試之靈敏度。可產生信號之所添加抗體之最低濃度表明特定生物標記之靈敏度。同時，建立標準曲線，其展示相對於抗體之連續稀釋度的PE之螢光強度(圖12)。該標準曲線將用於藉由比較PE強度估計患者血清中之生物標記特異性自體抗體之濃度。

在本發明中，使個別產生獨特螢光之多重15個不同Bioplex珠粒與生物標記組共軛且預裝載於盤孔中(圖13)。將含有自體抗體之患者血清裝載於孔中且使其與生物標記共軛物相互作用。接著添加共軛於PE之二級抗體且使其結合於自體抗體。在機器中洗去過量二級抗體，個別量測包含生物標記-珠粒共軛物及抗體級聯之複合物。Bioplex珠粒之獨特螢光信號鑑別生物標記，而來自同一複合物之PE信號表明存在自體抗體作為一級抗體(圖7)。總體而言，該量測將表明在患者血清中存在自體抗體及相對濃度。

在標準隨機化試驗設計中，比較了健康群組與診斷患有肝癌之患者之間的自體抗體之相對含量的平均值。使用史都登氏T檢驗(Student T test)分析變化顯著性。該顯著差異表明生物標記對肝癌具有特異性。在驗證試驗之後，將得到關於肝癌陽性及陰性患者之生物標記特異性自體抗體之濃度範圍且將其用作未來診斷的參考點。同時，亦比較了不同期肝癌患者之間的自體抗體之表現模式。生物標記表現之特徵模式將表明HCC分期。

總體而言，藉由量測相對自體抗體含量及生物標記之表現模式，本發明提供一種不同途徑以補充習知肝癌診斷。本發明進一步能夠非侵入性偵測針對本發明之患者血清中之經驗證目標的自體抗體，從而鑑別疾病之程度及特徵。除早期偵測I期肝癌以外，本發明亦能夠產生用於分期之特徵模式，及在乳房切除術後或化學療法後治療期間偵測復發。

實施例

在不欲以任何方式限制本發明之範疇的情況下藉助於描述本發明之特定具體實例來提供以下實施例。

實施例1a 自患者活檢體提取蛋白質

收集500mg配對患者活檢體(腫瘤活檢體與並置之正常組織)且用PBS洗滌。藉由浸於液氮中將組織冷凍且立即用研杵及研缽進行均質化。向均質化樣品中添加溶解溶液(8M尿素、4% CHAPS、2% IPG緩衝液、0.2mg/ml PMSF)，接著渦旋至少5分鐘直至組織完全分散。接著藉由在4℃下以14,000rpm離心10分鐘而使溶解產物澄清。進一步藉由2D清理套組(2D Clean Up kit，Amersham)清潔上清液以移除鹽及雜質。將集結粒再懸浮於最少量之復水溶液中(未添加DTT & IPG緩衝液)。接著藉由Bio-Rad蛋白質分析量測蛋白質濃度且在-70℃下儲存每管200g等分試樣。

實施例1b 藉由二維電泳解析蛋白質

向1ml復水儲備溶液中添加2.8mg DTT、5μl法莫利(pharmalyte)或IPG緩衝液及2μl之溴酚藍。將50-100μg之蛋白質樣品添加至含有250μl的復水溶液之13cm Immobiline DryStrip(IPG條帶)中。在移除保護罩之後，將IPG條帶安置於條帶固持器中，其中凝膠側朝下，且用覆蓋液覆蓋以防止在電泳期間脫水。接著將條帶置放於Ettan IPGphor(Amersham)上以進行等電聚焦(第一維電泳)。

在第一維電泳之後，用平衡溶液(6M尿素，2% SDS，50mM Tris HCl(pH 6.8)，30%甘油，0.002%溴酚藍，每10ml緩衝液100mg DTT及每10ml緩衝液250mg IAA)平衡IPG條帶，接著用1× SDS電泳緩衝液洗滌4-5次。將IPG條帶置放於第二維凝膠之頂部且用密封溶液(0.5%低熔點瓊脂糖、含有0.002%溴酚藍之1× SDS電泳緩衝液)覆蓋。接著前15分鐘在30mA下進行該第二維電泳，隨後在60mA下進行3-4小時。

在完成該第二維電泳後，自盒中移出凝膠，固定且用硝酸銀染色。鑑別代表15個上調蛋白質之15個點(圖1)。為鑑別該等蛋白質(圖2)，將經銀染色之凝膠切片去染且以胰蛋白酶處理以自凝膠釋放蛋白質而進行MALDI-TOF分析。

實施例2a (SEQ ID NO.1) Bmi1之胺基酸序列

實施例2b (SEQ ID NO.2) VCC1之胺基酸序列

實施例2c (SEQ ID NO.3) SUMO-4之胺基酸序列

MANEKPTEEVKTENNNHINLKVAGQDGSVVQFKIKRQTPLSKLMKAYCEPRGLSVKQIRFRFGGQPISGTDKPAQLEMEDEDTIDVFQQPTGGVY

實施例2d (SEQ ID NO.4) RhoA之胺基酸序列

實施例2e (SEQ ID NO.5) TXN之胺基酸序列

MVKQIESKTAFQEALDAAGDKLVVVDFSATWCGPCKMIKPFFHSLSEKYSNVIFLEVDVDDCQDVASECEVKCMPTFQFFKKGQKVGEFSGANKEKLEATINELV

實施例2f (SEQ ID NO.6) ET-1之胺基酸序列

實施例2g (SEQ ID NO.7) UBE2C之胺基酸序列

實施例2h (SEQ ID NO.8) HDGF2之胺基酸序列

實施例2i (SEQ ID NO.9) FGF21之胺基酸序列

實施例2j (SEQ ID NO.10) LECT2之胺基酸序列

實施例2k (SEQ ID NO.11) SOD1之胺基酸序列

實施例2l (SEQ ID NO.12) STMN4之胺基酸序列

實施例2m (SEQ ID NO.13) 中期因子之胺基酸序列

實施例2n (SEQ ID NO.14) IL-17A之胺基酸序列

實施例2o (SEQ ID NO.15) IL-26之胺基酸序列

實施例3a 生物標記組之表現

將含有編碼生物標記組之cDNA插入片段之經His標記質體轉型於DH5勝任細胞中(301，圖3)。選取單菌落且使其在細菌培養物中生長(302)。擴增質體數目且藉由miniprep自細菌提取出。將質體進一步轉型於BL21DE3或BL21DE3pLysS勝任細胞中。選擇經轉型細菌且在2×100ml LB培養基中生長。當細菌培養物達到0.06之光學密度時，將200μM IPTG添加至100ml之細菌培養物(303)中。使用另一100ml不含IPTG之細菌培養物作為陰性對照組。在30℃下在震盪下培育細菌培養物。在培育之後且在培育隔夜之後的次日早晨，保留500μl細菌培養物且在-20℃下儲存3小時。

將經或不經IPTG誘導之細菌培養物在500ml之離心瓶中混合在一起。藉由在4℃下以9000rpm離心20分鐘收集細菌細胞(304)。保留500μl上清液作為另一個陰性對照組且丟棄剩餘上清液。將在不同時間收集之細菌培養物及陰性對照組在SDS-PAGE上操作以解析蛋白質(305)。接著用考馬斯藍染色凝膠隔夜。在將凝膠去染之後，可藉由檢查尺寸且與陰性對照組比較來確認蛋白質誘導。

實施例3b 生物標記組之蛋白質純化

細菌細胞集結粒在室溫下藉由渦旋再懸浮於10ml溶解緩衝液中。將再懸浮細胞保持於冰上之50ml離心管中，藉由以30秒之間隔在振幅70%下音波處理30秒10輪使細胞完全溶解(401，圖4)。將溶解細胞在4℃下以10,000rpm離心1小時(402)。將上清液轉移至透析管中且在4℃下在持續攪拌下將其浸於1L未過濾起始緩衝液中4-6小時(403)。用另一1L起始緩衝液繼續透析隔夜。用0.22μm濾片及注射器進一步過濾上清液。向配備有載有0.1M硫酸鎳之HiTrap螯合柱的AKTA機(404)中裝載經過濾樣品(405)。在AKTA機上設定自動在洗提份中收集洗提液之程式(406)。藉由SDS-PAGE分析來檢查自不同洗提份純化之蛋白質(407)。

實施例4a 與Bio-Plex珠粒耦合之蛋白質

根據製造商之手冊，使生物標記組之經純化蛋白質與Bio-Plex珠粒(Bio-Rad)耦合(501)。簡言之，將未耦合珠粒渦旋30秒且接著音波處理15秒。藉由在最大速度下離心100μl珠粒4分鐘在反應管中收集到1,250,000個珠粒。在藉由離心用100μl珠粒洗滌緩衝液洗滌之後，將珠粒再懸浮於80μl珠粒活化緩衝液中。向珠粒中添加10μl 50mg/ml新製備之S-NHS及10μl 50mg/ml新製備之EDAC，隨後在室溫下於黑暗中培育20分鐘(圖6)。接著用150μl PBS洗滌珠粒兩次。

向經洗滌珠粒中添加10μg蛋白質且用PBS使總體積達500μl，且在黑暗中在震盪下培育2小時。在最大速度下離心4分鐘之後移除上清液。將250μl之阻斷緩衝液添加至珠粒中且在黑暗中震盪30分鐘，隨後在最大速度下離心4分鐘且移除上清液。簡單洗滌珠粒且接著將其再懸浮於儲存緩衝液中以在4℃下儲存。用血球計來計數珠粒之數目。

實施例4b 蛋白質-珠粒耦合之驗證

向HTS 96孔盤中添加50μl共軛Bio-Plex珠粒(每微升100個珠粒)以依序與初級抗體及二級抗體反應(502)。將針對生物標記組之市售初級抗體之連續稀釋液製備為8,000ng/ml、4,000ng/ml、1,000ng/ml、250ng/ml、62.5ng/ml、15.625ng/ml、3.906ng/ml、0.977ng/ml、0.244ng/ml及0.061ng/ml。將50μl各稀釋液添加至各孔中。藉由不包括初級抗體獲得兩個陰性對照組，且初級抗體與二級抗體均在孔中。接著用箔片密封培養盤且在350rpm下在震盪器上保持30分鐘以避免曝露於光。

培育之後，用150μlPBS洗滌珠粒三次。除陰性對照組以外，將50μl共軛於PE之二級抗體(8,000ng/ml)添加至各孔中。再次密封培養盤且在黑暗中在震盪下培育30分鐘。接著用PBS洗去過量抗體。用校準套組及驗證套組校準Bio-Plex機。將HTS盤裝載於Bio-Plex機之後，量測來自Bio-Plex珠粒與二級抗體上所共軛之PE的信號(示意圖展示於圖7中)(503)。藉由Logistic-5PL產生校準曲線。

實施例4c： 收集血清樣品及藉由BioPlex系統量測自體抗體

藉由在37℃下靜置1小時使全血樣品凝結。在室溫下以1000g離心10分鐘之後，在上清液中收集含有自體抗體之血清。必要時，用PBS稀釋血清樣品。向預裝載有與生物標記組共軛之Bioplex珠粒的HTS盤中裝載血清樣品且在震盪下培育30分鐘(圖13)。類似於實施例4b中所述之步驟，向經PBS洗滌之珠粒中添加50μl共軛於PE之二級抗體(8000ng/ml)，隨後再震盪30分鐘。在三輪洗滌之後，將培養盤裝載於Bio-Plex機中且量測螢光信號(504)。可接著自標準曲線計算自體抗體之濃度。

本發明之前述描述出於說明及描述之目的而提供。其不欲為詳盡的或將本發明限制於所揭示之精確形式。諸多修改及變化將對於熟習此項技術之人士顯而易見。

該等具體實例經選擇且描述以便最佳地解釋本發明之原理及其實際應用，從而使其他熟習此項技術者能夠理解本發明之各種具體實例且進行適合於特定預期用途之各種修改。本發明之範疇欲由以下申請專利範圍及其等效物界定。

產業利用性

本發明所主張之方法及包含15種所鑑別生物標記之套組不僅可用於鑑別及定量患者血清中自體抗體之存在以偵測及/或分期肝癌，而且可適用於以此等標記為目標之藥物開發以尤其治療肝癌。

<110> 視界全球控股有限公司

<120> 用於非侵入性肝癌診斷之特異性生物標記組

<130> P7783TW00

<150> US 14/321,867

<151> 2014-07-02

<150> US 14/321,870

<151> 2014-07-02

<160> 15

<170> PatentIn 3.5版

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Claims

一種用於偵測及定量用於診斷及分期肝癌的針對複數種腫瘤生物標記之自體抗體的方法，其包含：比較腫瘤細胞與正常細胞以評估蛋白組，該蛋白組在腫瘤細胞中獨特地作為該等癌症之複數種特異性生物標記但在正常細胞中並非如此；藉由使用基於二維或質譜之技術鑑別來自配對患者活檢體樣品之蛋白組；驗證該蛋白組以用於診斷肝癌；其中，該蛋白組自cDNA克隆表達、純化且與具有不同發射波長之螢光微球體珠粒耦合以形成蛋白質-珠粒共軛物；其中，患者血清中所存在之針對該蛋白組之自體抗體免疫結合於該蛋白質-珠粒共軛物。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該等自體抗體隨後與共軛於PE之二級抗體相互作用，且對該等微球體珠粒具有特異性之螢光信號用作該蛋白質-珠粒共軛物之識別物。
如申請專利範圍第2項之方法，其中量測複合物中由該等共軛於PE之二級抗體產生之螢光強度以使得可偵測及定量該等自體抗體。
如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含比較患者與健康個體之間的血清以確定針對該(等)相應生物標記之自體抗體的含量。
如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含比較獲自不同期之不同患者的不同血清以產生用於分期之特徵模式。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該蛋白組包含SEQ ID NO.1至15 之胺基酸序列之至少一者。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該複數種腫瘤生物標記包含Bmi-1、VCC1、SUMO-4、RhoA、TXN、ET-1、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、SOD1、STMN4、中期因子(Midkine)、IL-17A及IL26。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該等腫瘤細胞包含來自肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)腫瘤之細胞。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該等螢光微球體珠粒各自具有對該等蛋白質中之每一者具有特異性之獨特螢光發射波長從而對應於特異性腫瘤生物標記之存在，而由結合於該特異性腫瘤生物標記之蛋白質中之每一者的蛋白質-珠粒共軛物的共軛於PE之二次抗體產生的PE信號為患者血清中如此產生之該自體抗體之存在的指標，且該PE信號之螢光強度與該特異性腫瘤生物標記之量成比例。
如申請專利範圍第1項之方法，其中存在於該等自體抗體中之各腫瘤生物標記低至約0.15ng/mL。
一種藉由偵測及定量來自患者之針對複數種腫瘤生物標記之自體抗體診斷及分期肝癌之套組，該套組包含如下蛋白組，其自cDNA克隆表達、純化且與具有不同發射波長之螢光微球體珠粒耦合以形成蛋白質-珠粒共軛物以用於免疫結合該等自體抗體，且隨後共軛於PE之二級抗體以其為目標，以量測螢光信號及強度以確定與正常個體相比患者中自體抗體之含量。
如申請專利範圍第11項之套組，其中該蛋白組包含SEQ ID NO.1至15之胺基酸序列中之至少一者。
如申請專利範圍第11項之套組，其中該等腫瘤生物標記包含Bmi-1、VCC1、SUMO-4、RhoA、TXN、ET-1、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、SOD1、STMN4、中期因子、IL-17A及IL26。
如申請專利範圍第11項之套組，其中該等cDNA克隆各自包含含有如下蛋白質之對應cDNA插入片段之經His標記之質體，該蛋白質欲表現於勝任細胞中以與具有不同發射波長之螢光微球體珠粒耦合以形成蛋白質-珠粒共軛物而用於免疫結合該等自體抗體，且隨後經PE共軛之二級抗體以其為目標。
如申請專利範圍第11項之套組，其中使個別產生獨特螢光之多重不同螢光微球體珠粒與如此表現且純化之蛋白組共軛以形成蛋白質-珠粒共軛物，且將該蛋白質-珠粒共軛物預裝載於容器之孔中，且將含有自體抗體之患者血清裝載於各孔中，並使其與該蛋白質-珠粒共軛物相互作用，隨後添加該等共軛於PE之二級抗體以使其與該等自體抗體結合，接著洗去任何過量二級抗體且個別量測包含該蛋白質-珠粒共軛物及該等抗體之級聯的複合物，其中該蛋白質-珠粒共軛物之該獨特螢光信號鑑別特異性腫瘤生物標記之存在，而來自該複合物之二級抗體之PE信號表明該等自體抗體之存在及該患者血清中之該腫瘤生物標記之相對濃度。
如申請專利範圍第11項之套組，其中存在於該等自體抗體中之各腫瘤生物標記低至約0.15ng/mL。