KR102175265B1 - Txndc7을 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물 - Google Patents

Txndc7을 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 TXNDC7을 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, 간세포암종과 정상 간 조직에서 TXNDC 패밀리들의 발현 변화를 분석한 결과, 정상 간 조직에 비해 간세포암종에서 TXNDC7의 mRNA 및 단백질 발현이 증가하는 반면에, TXNDC11은 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 간세포암종에서의 TXNDC7의 발현 증가 또는 TXNDC11의 발현 감소가 간세포암종의 불량한 예후와 관련이 있음을 확인함으로써, 본 발명의 TXNDC7 또는 TXNDC11이 간세포암종의 바이오마커로 이용 가능하며, 간세포암종에서의 TXNDC7 또는 TXNDC11의 발현량 분석을 통해 간세포암종의 진단 및 예후 예측이 가능하고, 간세포암종의 예방 또는 치료제 개발에 있어서도 활용 가치가 높을 것으로 기대된다.

Description

TXNDC7을 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물 {Biomarker composition comprising TXNDC7 for diagnosis or predicting prognosis of hepatocellular carcinoma}
본 발명은 TXNDC7(thioredoxin-domain-containing protein 7)을 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
간세포암종(hepatocellular carcinoma, HCC)은 간암의 가장 흔한 형태로, 우리나라 암 발생 순위 3위인 주요 암이며 5년 관찰 생존율 9.6%로 예후가 매우 불량하다. 간세포암종은 40대부터 발생이 급격히 증가하고 60대 정도에 최고치를 이룬다. 그러나 간세포암종은 특징적인 증상이 별로 없고, 이 시기는 사회 활동을 적극적으로 해나가는 시기로서 암과 관련하여 비특이적 증상인 피로감, 식욕부진, 전신 쇠약감 등이 어느 정도 수반될 수밖에 없기 때문에 초기에 나타날 수 있는 증상들이 간과되어 조기 발견을 어렵게 하는 요인이 된다.
간세포암종의 최근 진단기술과 치료 방법의 발달에도 불구하고 많은 환자에서 병기(stage)가 진행되어 발견되는 경우가 많아 효과적인 치료가 어렵다. 따라서 이러한 간세포암종을 조기에 진단하여 근치적인 시술을 행하는 것이 환자의 생존율을 높일 수 있는 가장 효과적인 방법이다.
간은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성하는 여러 물질을 해독하는 기능을 가진 주요 기관으로, 간의 환원-산화(레독스, redox) 시스템이 붕괴되면 산화 스트레스 및 간암과 관련된 해로운 과정을 초래한다. 지금까지 축적 된 증거는 종양의 시작과 진행은 산화 스트레스와 관련이 있으며, 특히 간에서의 산화 스트레스가 종양 형성을 촉진, 악화시킬 수 있음을 보여주고 있다.
간에서 산화 스트레스는 간세포암종을 촉진시키고 역설적으로 간세포암종은 산화-환원 능력을 유도한다. 간세포암종의 산화-환원 능력 유도는 암세포가 높은 활성산소종으로 인해 손상될 수 있기 때문에 종양 형성과 관련된 여러 신호 전달 경로를 통해 활성산소종 대사를 조절하여 스스로를 보호하기 위한 것이다.
티오레독신(thioredoxin, TXN) 시스템은 세포에서 레독스 상태의 조화와 조절을 유지하는데 있어서 필수 불가결한 것이다. TXNDC(thioredoxin(TXN)-domain containing protein)는 레독스 상태를 조절하는 조절자로, 시스테인 티올(thiol)이 디설파이드로 가역적으로 산화되는 것을 촉진하는 산화 환원 단백질 그룹에 속한다. TXNDC는 산화 환원 항상성, 산화 스트레스, 디설파이드 함유 단백질 및 전사 조절과 같은 다양한 기능에 관여한다. TXNDC 패밀리는 17개로 구성되어 있으며, 원형질막, 세포질, 소포체 및 핵을 포함하는 별개의 세포 내 위치에서 산화 환원 상태를 조절한다.
그러나 암 진행, 특히나 간세포암종에서의 TXNDC의 역할을 조사한 연구는 거의 없었다. 이전 연구에서 자궁경부암, 결장암, 위암, 간암 및 폐암에서 단백질의 접힘(folding)과 샤페론(chaperone) 활성 조절에 관여하는 TXNDC5의 상향조절(upregulation)이 보고되었다(Horna-Terron, E., et al., 2014). 또한, 샤페론-보조 단백질 접힘에 관여하는 TXNDC9의 과발현은 대장암에서 좋지 않은 예후와 관련되어 있으며(Lu, A., et al., 2012), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor) 신호 전이에 관여하는 TXNDC17은 난소암에서 화학 요법에 대한 내성을 촉진시킨다(Zhang, S.F., et al., 2015)는 것이 보고되었다.
이에, 본 발명자들은 간세포암종에서의 TXNDC 패밀리들의 발현 및 기능을 연구하는 과정에서, TXNDC7이 정상 간 조직에 비해 간세포암종에서 mRNA 및 단백질 발현이 증가하는 반면에, TXNDC11은 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 간세포암종에서 TXNDC7의 발현 증가 또는 TXNDC11의 발현 감소가 간세포암종의 불량한 예후와 관련이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래 선행기술로서 한국등록특허 제0877554호에는 간암 환자 생존기간 예측용 마커로 TXNDC11이 기재되어 있으나, TXNDC 이외의 56종의 유전자를 주요 마커로 하고, 추가 유전자로써 TXNDC11이 포함되는 것으로, 본 발명의 간세포암종에서의 TXNDC11의 발현 감소 및 TXNDC7을 포함하는 간세포암종 진단용 조성물은 전혀 기재 및 암시되어 있지 않다. 한국공개특허 제2017-0021234호에는 간암의 비-침습성 진단을 위한 바이오마커로 TXN이 기재되어 있으나, 본 발명의 TXNDC7 및 TXNDC11은 기재되어 있지 않다.
비특허문헌인 Chen, D., et al., (2018)에는 TXNDC9가 간세포암종에서 발현이 증가하고, 이러한 발현 증가가 간세포암종의 진행과 관련되어 있음이 기재되어 있으나, 본 발명의 간세포암종에서의 TXNDC7의 발현 증가 및 TXNDC11의 발현 감소는 전혀 기재 및 암시되어 있지 않다.
한국등록특허 제0877554호, 간암 환자 생존기간 예측용 마커, 그를 포함하는 키트 및 마이크로어레이, 및 상기 마커를 이용한 간암 환자 생존기간 예측 방법, 2008. 12. 30. 등록. 한국공개특허 제2017-0021234호, 간암의 비-침습성 진단을 위한 특이적 바이오마커 세트, 2017. 02. 27. 공개.
우현구, 간세포암의 유전체 프로파일링 연구, 분자세포생물학뉴스, 2011. Chen, D., et al., TXNDC9 promotes hepatocellular carcinoma progression by positive regulation of MYC-mediated transcriptional network, Cell Death and Disease. 9, 1110, 2018. Clackson, T., et al., Making antibody fragments using phage display libraries, Nature, 352, 624-628, 1991. Horna-Terron, E., et al., TXNDC5, a newly discovered disulfied isomerase with a key role in cell physiology and pathology, Int. J. Mol. Sci., 15(12), 23501~23518, 2014. Kohler, G., et al., Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, European J Immunology, 6, 511-519, 1976. Lu, A., et al., TXNDC9 expression in colorectal cancer cells and its influence on colorectal cancer prognosis, Cancer Invest., 30(10), 721~726, 2012. Zhang, S.F., et al., TXNDC17 promotes paclitaxel resistance via inducing autophagy in ovarian cancer, Autophagy, 11(2), 225-238, 2015.
본 발명의 목적은 TXNDC7(thioredoxin-domain-containing protein 7)을 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 TXNDC7(thioredoxin-domain containing protein 7)을 유효성분으로 포함하는 간세포암종(hepatocellular carcinoma, HCC) 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
상기 바이오마커 조성물은 TXNDC7 및 TXNDC11이 포함된 것일 수 있다.
상기 TXNDC7은 정상 간 조직과 비교하여 간세포암종에서 발현이 증가한 것일 수 있다.
상기 TXNDC11은 정상 간 조직과 비교하여 간세포암종에서 발현이 감소한 것일 수 있다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 상기 TXNDC7 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 쌍 또는 프로브(probe)를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트에 관한 것이다.
상기 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트는 TXNDC7 및 TXNDC11 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 상기 TXNDC7 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트에 관한 것이다.
상기 항체는 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb) 또는 다클론 항체(polyclonal antibody, pAb)일 수 있다.
본 발명은 또한, 간세포암종 환자의 간세포암종에서 발현되는 TXNDC7 유전자 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 1단계; 상기 TXNDC7 유전자 또는 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 2단계; 및 상기 간세포암종에서의 TXNDC7 유전자 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 높을 경우 간세포암종으로 판단하는 3단계;를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
상기 간세포암종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법은 TXNDC11 유전자 발현 수준을 추가적으로 분석할 수 있다.
상기 TXNDC11 유전자 발현은 간세포암종에서의 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 낮을 경우 간세포암종으로 판단할 수 있다.
상기 유전자 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블롯(Northern blot) 및 DNA 칩(DNA chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 확인할 수 있다.
상기 단백질 발현 수준은 항원-항체 반응을 통해 측정할 수 있다.
상기 항원-항체 반응은 웨스턴 블롯(Western blot), 면역조직화학염색법(immunohistochemial stain), 방사선면역분석(radioimmunoassay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement fixation assay) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 확인할 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 TXNDC7을 유효성분으로 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, "간세포암종(hepatocellular carcinoma, HCC)"은 간세포에서 유래하는 일차성 간암을 의미한다.
본 발명에 있어서, "예후"는 간세포암종의 재생(relapse) 또는 재발(recurrence), 전이성 확산 및 약물 내성을 비롯한 간세포암종-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다.
본 발명에 있어서, "예측"이란 환자가 화학요법 또는 방사선 치료 등의 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자가 치료, 예를 들어 특정 치료제, 및/또는 원발성 종양의 수술로 제거, 및/또는 암의 재발없이 특정 시기 동안 화학요법으로 치료된 후의 생존 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 본 발명의 예측 방법은 임의의 특정 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택하여 적용함으로써 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측 방법은 환자가, 예를 들어 소정의 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정의 치료 처방과 같은 치료법에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존 또는 전신 또는 국소 재발이 가능한지를 예측할 수 있다. 또한 이를 통하여 불필요한 보조 항암요법을 최소화하거나 전신 또는 국소 재발이 예측되는 환자에게는 더욱 효과적인 보조 항암요법을 사용할 수 있도록 계획할 수 있다.
본 발명에 있어서, "바이오마커(biomarker)"란 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료 반응을 예측할 수 있고, 객관적으로 측정할 수 있는 표지자를 의미하는 것으로, DNA, RNA와 같은 유전자, 단백질, 지방질, 대사물질 등과 그 패턴의 변화 등이 이용되고 있다.
본 발명에 있어서, "TXNDC(thioredoxin-domain containing protein)"은 세포의 산화-환원(레독스, redox) 상태를 조절하는 조절자로, 산화 환원 항상성, 산화 스트레스, 디설파이드 함유 단백질 및 전사 조절과 같은 다양한 기능에 관여하는 인자이다. TXNDC 패밀리는 17개로 구성되어 있으며, 원형질막, 세포질, 소포체 및 핵을 포함하는 별개의 세포 내 위치에서 산화 환원 상태를 조절한다.
상기 바이오마커 조성물은 TXNDC7 유전자 서열 전부 또는 일부를 포함하는 조성물 또는 TXNDC7 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 조성물일 수 있다.
상기 바이오마커 조성물은 TXNDC11 유전자 서열 전부 또는 일부를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 TXNDC7은 정상 간 조직과 비교하여 간세포암종에서 발현이 증가하는 반면에, 상기 TXNDC11은 정상 간 조직과 비교하여 간세포암종에서 발현이 감소한다.
또한, 상기 TXNDC7의 발현 증가 또는 TXDNC11의 발현 감소는 간세포암종의 각 TNM 병기 단계별 간세포암종 환자의 생존율 감소와 상관관계가 있고, 간세포암종의 불량한 예후와 관련되어 있다.
본 발명에 있어서, "TNM 병기(TNM stage)"는 암의 진행도를 분류하는 개념으로, 통상적으로 1기에서 4기까지 4단계로 분류되며, 암의 진행 정도가 심해질수록 숫자가 올라간다.
상기 TXNDC7의 발현 증가는 유전자 및 단백질의 발현 증가일 수 있다.
상기 TXNDC11의 발현 감소는 유전자의 발현 감소일 수 있다.
상기 유전자의 발현 감소는 mRNA 발현 감소일 수 있다.
또 다른 일면에서, 본 발명은 TXNDC7 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 쌍 또는 프로브(probe)를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트에 관한 것이다.
상기 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트는 TXNDC11 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 TXNDC7 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트 또는 상기 TXNDC11 유전자에 특이적으로 결합하는 추가의 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트는 간세포암종에서 발현되는 TXNDC7 또는 TXNDC11 유전자를 검출하기 위한 것으로, 상기 유전자는 바람직하게는 mRNA이다.
본 발명에 있어서, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고, 주형가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
상기 프라이머는 TXNDC7 또는 TXNDC11 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머로, TXNDC7 또는 TXNDC11 유전자 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 염기 서열을 가지는 것으로, 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머가 쌍을 이룬다.
본 발명에 있어서, "프로브(probe)"는 mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 프로브는 TXNDC7 또는 TXNDC11 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부에 결합하는 것으로, TXNDC7 또는 TXNDC11 유전자 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 염기 서열을 가질 수 있다.
상기 TXNDC7 또는 TXNDC11 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트는, 프라이머 쌍 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), DNA/RNA 중합 효소 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 TXNDC7 단백질에 특이적으로 결합하는 항체(antibody, Ab)를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트에 관한 것이다.
상기 TXNDC7에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트는 간세포암종에서 발현되는 TXNDC7 단백질을 검출하기 위한 것으로, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기재로는 니트로셀룰로오스 멤브레인, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소로는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광물질로는 FITC, RITC, Cy3, Cy5 등이 사용될 수 있고, 발색기질로는 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아님), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, "항체(antibody, Ab)"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 바람직하게는 상기 항체는 TXNDC7 단백질 또는 이의 면역원성 단편(항원)에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb), 다클론 항체(polyclonal antibody, pAb) 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다. 상기 항체를 생산하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 상기 다클론 항체는 TXNDC7 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 동물에 주사한 뒤 채혈한 혈청에서 얻을 수 있다. 상기 동물로는 염소, 토끼, 돼지, 양 등 임의의 동물 숙주를 이용할 수 있다. 상기 단클론 항체는, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로, 하이브리도마 방법(Kohler, G. et al., 1976), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson, T. et al., 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 방법을 수행하기 위해서는 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물의 세포와, 암 또는 골수종 세포주를 이용할 수 있다. 이후, 폴리에틸렌글라이콜 등을 이용하는 방법, 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로, 이러한 두 종류의 세포들을 융합시킨 후, 항체 생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법으로 증식시킬 수 있다. 이후, 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후, 본 발명의 TXNDC7 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양할 수 있다. 상기 파지 항체 라이브러리 방법은, 본 발명의 TXNDC7 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 인식하는 항체 유전자를 획득하여, 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 상기 라이브러리로부터 본 발명의 TXNDC7 단백질 또는 이의 면역원성 단편과 결합하는 단클론 항체를 분리 및 제작하여 수행할 수 있다. 상기 방법들에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.
상기 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, F(ab)2, Fv 등이 있다.
상기 항체를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트는 항체 대신에 TXNDC7 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머(aptamer), 펩타이드(peptide) 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "압타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형 핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종으로, 압타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, "펩타이드(peptide)"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 간세포암종 환자의 간세포암종에서 발현되는 TXNDC7 유전자 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 1단계; 상기 TXNDC7 유전자 또는 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 2단계; 및 상기 간세포암종에서의 TXNDC7 유전자 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 높을 경우 간세포암종으로 판단하는 3단계;를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
상기 간세포암종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법은 TXNDC11 유전자 발현 수준을 추가적으로 분석할 수 있다.
상기 TXNDC11 유전자 발현은 간세포암종에서의 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 낮을 경우 간세포암종으로 판단할 수 있다.
상기 TXNDC7 또는 TXNDC11 유전자 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블롯(Northern blot) 및 DNA 칩(DNA chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 TXNDC7 단백질 발현 수준은 항원-항체 반응을 통해 측정할 수 있다.
상기 항원-항체 반응은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 웨스턴 블롯(Western blot), 면역조직화학염색법(immunohistochemial stain), 방사선면역분석(radioimmunoassay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement fixation assay) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 TXNDC7을 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, 간세포암종과 정상 간 조직에서 TXNDC 패밀리들의 발현을 분석한 결과, 정상 간 조직에 비해 간세포암종에서 TXNDC7의 mRNA 및 단백질 발현이 증가하는 반면에, TXNDC11은 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 TXNDC7의 발현 증가 또는 TXNDC11의 발현 감소가 간세포암종의 불량한 예후와 관련이 있음을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 TXNDC7 또는 TXNDC11이 간세포암종의 바이오마커로 이용 가능하며, 간세포암종에서의 TXNDC7 또는 TXNDC11의 발현량 분석을 통해 간세포암종의 진단 및 예후 예측이 가능하고, 간세포암종의 예방 또는 치료제 개발에 있어서도 활용 가치가 높을 것으로 기대된다.
도 1은 정상 간 조직 대비 간세포암종에서의 TXNDC 패밀리들의 mRNA 발현 변화량(fold change)을 분석한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 간세포암종에서의 TXNDC 패밀리들의 단백질 발현을 확인한 면역조직염색 결과로, (A)는 TXNDC 패밀리들간의 단백질 발현을 비교한 결과를, (B)는 정상 간 조직(Normal) 대비 간세포암종(HCC)에서의 TXNDC 패밀리들의 단백질 발현을 비교한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 간세포암종에서의 TXNDC 패밀리들의 mRNA 발현과 간세포암종 환자의 생존율과의 상관관계를 분석한 결과를 보여주고 있다. p<0.05일 경우에 통계적 유의성을 나타낸다.
도 4는 간세포암종 환자의 TNM 병기에 따른 TXNDC 패밀리들의 mRNA 발현과 간세포암종 환자의 생존율과의 상관관계를 분석한 결과를 보여주고 있다. p<0.05일 경우에 통계적 유의성을 나타낸다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
< 실시예 1. 간세포암종 환자의 임상정보 및 유전자 발현 프로파일 데이터 확보>
유전자 발현 분석을 위해 Firebrowse(http://firebrowse.org/)로부터 377명의 간세포암종 샘플의 유전자 발현 프로파일 데이터 등이 포함된 RNAseqV2-RSEM_gene 정보 및 임상정보를 확보하였다. 이중, 간담관암(hepatocholangiocarcinoma) 환자 7명과 섬유층판암종(fibrolamellar carcinoma) 환자 3명을 제외한 하기 표 1의 367명의 간세포암종 환자의 임상정보 및 유전자 발현 프로파일 데이터를 분석에 이용하였다.
간세포암종 환자 (n=367) 환자수(명)
성별 남성 249
여성 118
나이 ≤60 176
>60 190
TNM 병기 I 단계 171
II 단계 83
III 단계 85
IV 단계 4
해당사항 없음 24
조직학적 등급
(histological grade)		 1 등급 53
2 등급 174
3 등급 123
4 등급 12
해당사항 없음 5
생사 여부 생존 236
사망 131
차일드 분류법
(Child-Pugh classification)		 A 218
B 21
C 1
해당사항 없음 127
이삭 섬유증 점수
(Ishak fibrosis score)		 0-섬유화 없음 74
1,2-간문맥 섬유화 31
3,4-섬유 격막 30
5-결절형성 및 불완전한 간경변 9
6-확정된 간경변 72
해당사항 없음 151
< 실시예 2. 간세포암종 환자에서의 TXNDC 패밀리들 mRNA 및 단백질 발현 확인>
실시예 2-1. TXNDC 패밀리들의 mRNA 발현 확인
상기 실시예 1의 367명의 간세포암종 환자의 간세포암종과 정상 간 조직에서의 TXNDC 패밀리들의 mRNA 발현량을 분석한 정보를 Firebrowse(http://firebrowse.org/viewGene.html?gene=thioredoxin)로부터 확보하여 TXNDC 패밀리들의 mRNA 발현량을 비교 분석하였다.
구체적으로, 17개의 TXNDC 패밀리 중에서 TXNDC8을 제외한 16개의 유전자들의 정상 간 조직 대비 간세포암종에서의 mRNA 발현량을 비교하여, 변화된 mRNA 발현량을 로그(log) 값으로 환산하여 mRNA 발현 변화량(fold change)으로 나타내었고, 그 결과를 도 1 및 하기 표 2에 나타내었다.
유전자명 이명 변화량(fold change)
(log)
TXNDC1 TMX1, thioredoxin-related transmembrane protein 1 0.9
TXNDC2 - 0.8
TXNDC3 NME8, NME/NM23-family member 8 0.9
TXNDC4 ERP44, endoplasmic reticulum protein 44 0.9
TXNDC5 - 1.0
TXNDC6 NME9, NME/NM23-family member 9 1.1
TXNDC7 PDIA6, protein disulfide isomerase family A member 6 1.3
TXNDC9 - 1.2
TXNDC10 TMX3, thioredoxin-related transmembrane protein 3 1.0
TXNDC11 - 0.7
TXNDC12 - 1.1
TXNDC13 TMX4, thioredoxin-related transmembrane protein 4 1.2
TXNDC14 TMX2, thioredoxin-related transmembrane protein 2 1.1
TXNDC15 - 1.0
TXNDC16 - 1.0
TXNDC17 - 1.0
도 1 및 상기 표 2의 정상 간 조직 대비 간세포암종에서의 TXNDC 패밀리들의 mRNA 발현 변화량(fold change)을 확인한 결과에서 보듯이, TXNDC7의 변화량이 1.3으로, 정상 간 조직과 비교하여 간세포암종에서 발현량이 증가하는 것을 확인하였고, 이는 간세포암종에서 발현이 증가한다고 알려진 TXNDC9의 mRNA 발현 변화량 1.2에 비해 높은 것을 확인하였다. 반면에, TXNDC11의 mRNA 발현 변화량은 0.7로, 정상 간 조직에 비해 간세포암종에서 발현이 감소한다는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 TXNDC7의 경우에는 정상 간 조직에 비해 간세포암종에서 mRNA 발현량이 증가하고, TXNDC11의 경우에는 정상 간 조직에 비해 간세포암종에서 mRNA 발현이 감소하므로 TXNDC7 및 TXNDC11을 간세포암종 진단 바이오마커로 이용 가능함을 알 수 있었다.
실시예 2-2. TXNDC 패밀리들의 단백질 발현 확인
TXNDC 패밀리들의 간세포암종에서의 단백질 발현을 확인하기 위해 Human Protein Atlas portal(http://www.proteinatlas.org)로부터 TXNDC 패밀리들 관련 면역조직염색 결과를 확보하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2(A)의 간세포암종에서의 TXNDC 패밀리들의 단백질 발현을 확인한 면역조직염색 결과에서 보듯이, TXNDC 패밀리들에 따라 단백질 발현이 다르게 나타나는 것을 확인하였다.
도 2(B)의 정상 간 조직(Normal) 대비 간세포암종(HCC)에서의 TXNDC 패밀리들의 단백질 발현을 비교한 결과에서 보듯이, TXNDC7 및 TXNDC9는 정상 간 조직에 비해 간세포암종에서 단백질 발현이 증가한다는 것을 확인하였다. 특히나 도 2의 (B)에서 보듯이, TXNDC7 단백질이 TXNDC9에 비해 간세포암종에서 더 많이 발현되는 것을 확인함으로써, TXNDC7이 간세포암종 진단 마커로 알려진 TXNDC9에 비해 더 우수한 간세포암종 진단 마커임을 알 수 있었다.
<실시예 3. TXNDC 패밀리들의 발현과 간세포암종 예후와의 상관관계 확인>
실시예 3-1. TXNDC 패밀리들의 mRNA 발현과 생존율과의 상관관계 분석
간세포암종에서의 TXNDC 패밀리들의 mRNA 발현과 간세포암종 환자의 생존율과의 상관관계를 확인하기 위해, 상기 실시예 1의 367명의 간세포암종 환자의 임상정보 및 유전자 발현 프로파일 데이터를 분석에 이용하였다.
누적된 사망률은 결과 변수로 사용된 첫 번째 사건까지의 시간을 기준으로 Kaplan-Meier 방법을 이용하여 계산하였고, 통계 분석을 위한 생존 기간은 수술일과 사망일의 차이로 한 후, 상기 실시예 1의 367명의 간세포암종 환자의 mRNA 발현에 따른 전체 생존 누적 곡선(cumulative overall survival curve)을 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
전체 생존 누적 곡선에서 두 표본의 생존 분포를 비교하기 위한 가설 검정을 위해 log-rank test를 사용하였고, log-rank test를 위한 mRNA 발현 데이터의 기준값(cutoff value)을 Cutoff Finder(http://molpath.charite.de/cutoff)를 이용하여 결정하였다. 또한 log-rank test에서 p<0.05일 경우에 통계적 유의성을 나타낸다는 것을 확인하였다.
도 3에서 보듯이, TXNDC9과 마찬가지로 TXNDC7의 mRNA 발현 수준이 높으면 간세포암종 환자의 생존율이 감소하는 것을 확인하였고, 사망 위험률(hazard ratio, HR)이 높아 간세포암종의 예후가 불량하다는 것을 확인하였다. 반면에, TXNDC11는 mRNA 발현 수준이 높을수록 간세포암종 환자의 생존율이 증가하고, 사망 위험률이 낮아 간세포암종의 예후가 좋다는 것을 확인하였다.
실시예 3-2. 간세포암종 환자의 TNM 병기(TNM stage)에 따른 TXNDC 패밀리들의 발현 관련 생존율 분석
간세포암종 환자의 TNM 병기 단계에서 TXNDC 패밀리들의 mRNA 발현에 따른 간세포암종의 예후와의 관련성을 확인하였다.
상기 실시예 1의 367명의 간세포암종 환자의 임상정보 및 유전자 발현 프로파일 데이터를 이용하여, 상기 실시예 3-1의 전체 생존 누적 곡선 분석과 동일한 방법을 이용해 간세포암종 환자의 TNM 병기 단계별 mRNA 발현 수준과 누적 생존율을 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보듯이, TXNDC7의 높은 mRNA 발현은 모든 TNM 병기 단계에서 간세포암종 환자의 생존율을 감소시키는 것을 통해, 간세포암종의 불량한 예후와 유의한 상관관계가 있는 것을 확인하였고, TXNDC11의 높은 mRNA 발현이 TNM 병기 단계 중 I 및 III-IV 단계에서 간세포암종 환자의 생존율을 증가시키는 것을 통해, 간세포암종의 좋은 예후와 유의한 관련이 있는 것을 확인하였다. 한편, 간세포암종에서 발현이 증가되어 간세포암종의 진단에 이용 가능하다고 알려진 TXNDC9의 경우에는 TNM 병기 단계 중 III-IV 단계에서만 유의한 상관관계가 있음이 확인되는 바, 간세포암종의 예후 예측에 있어서, TXNDC9에 비해 TXNDC7 또는 TXNDC11이 좀 더 정확하다는 것을 알 수 있었다.
상기 실시예 3-1 및 3-2의 결과를 통해, 본 발명의 TXNDC7의 높은 mRNA 발현은 간세포암종의 불량한 예후와 관련성이 높으며, TXNDC11의 높은 mRNA 발현은 간세포암종의 좋은 예후와 관련성이 있음을 알 수 있었고, 이는 TXNDC7 및 TXNDC11을 간세포암종의 진단 및 예후 예측을 위한 바이오마커로 사용할 수 있음을 보여주고 있다.

Claims (14)

  1. TXNDC7(thioredoxin-domain containing protein 7) 및 TXNDC11(thioredoxin-domain containing protein 11)을 유효성분으로 포함하는 간세포암종(hepatocellular carcinoma, HCC) 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 TXNDC7은 정상 간 조직과 비교하여 간세포암종에서 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 TXNDC11은 정상 간 조직과 비교하여 간세포암종에서 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  5. 제1항의 TXNDC7 및 TXNDC11 유전자에 각각 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트.
  6. 삭제
  7. 제1항의 TXNDC7 및 TXNDC11 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 항체는 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb) 또는 다클론 항체(polyclonal antibody, pAb)인 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측용 키트.
  9. 간세포암종 환자의 간세포암종에서 발현되는 TXNDC7 및 TXNDC11 유전자 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 1단계;
    상기 TXNDC7 및 TXNDC11 유전자 또는 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 2단계; 및
    상기 간세포암종에서의 TXNDC7 유전자 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 높을 경우 또는 TXNDC11 유전자 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 낮을 경우 간세포암종으로 판단하는 3단계;
    를 포함하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제9항에 있어서,
    상기 유전자 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블롯(Northern blot) 및 DNA 칩(DNA chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 단백질 발현 수준은 항원-항체 반응을 통해 측정하는 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 항원-항체 반응은 웨스턴 블롯(Western blot), 면역조직화학염색법(immunohistochemial stain), 방사선면역분석(radioimmunoassay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement fixation assay) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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