KR101833983B1 - DOCK10 유전자의 mRNA 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 예후 예측용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이들의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유방암, 특히 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후를 예측하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트, 그리고 상기 조성물이나 키트를 이용하여 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후를 예측하거나, 상기 질환의 전이, 재발 또는 사망 억제제를 스크리닝 할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 DOCK10 유전자의 낮은 발현을 측정하여 프로게스테론 수용체 음성 유방암에 대한 유방암이 전이, 재발, 사망할 가능성을 정확하면서도 신속하게 예측할 수 있다. 따라서, 본 발명은 다른 유방암에 대해 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후가 양호하지 않은 환자와 양호한 환자를 특이적으로 식별할 수 있고, 이를 통해 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 전이, 재발 또는 사망 여부를 조기에 판단하여 적절한 치료법의 선발 및 적용을 가능케 함으로써 상기 유방암 환자의 생존율을 높일 수 있다.

Description

DOCK10 유전자의 mRNA 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 예후 예측용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이들의 이용{Composition for predicting prognosis of cancer, kit comprising the same and uses thereof}

본 발명은 유방암, 특히 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후를 예측하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트, 그리고 상기 조성물이나 키트를 이용하여 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후를 예측하거나, 상기 질환의 재발 억제제를 스크리닝 할 수 있는 방법에 관한 것이다.

에스트로겐 수용체(Estrogen receptor, ER) 발현은 내분비 치료의 치료 결정에 관한 주요한 바이오마커이고, 유방암에서의 중대한 예후적인 인자이다. 대조적으로 프로게스테론 수용체(Progesterone receptor, PR) 발현은 활성 ER의 보조적인 지표가 될 수 있다고 생각되고 있는데, 이는 PR의 전사가, 목적하는 유전자의 하나로서 ER에 의해 유도되기 때문이다. 그러나, 몇몇 연구에서는 PR 발현의 부재가 좋지 않은 예후나 보조적인 내분비계 치료에 대한 반응성을 나쁘게 한다고 보고하고 있다. 더욱 최근의 연구에서는 PR 발현이 ER의 상태나 내분비 치료와 관계없이 독립적인 예후인자라는 증거를 부가하고 있다. 나아가, 모하메드 등은 PR의 존재 또는 부존재가 유방암 세포 내의 ER의 DNA 결합 자리를 결정하고, 이에 ER-양성(ER+) 유방암 내에서 PR의 상태에 따라 서로 다른 목적 유전자를 스위치온(switch on) 또는 오프(off)한다는 것을 발견하였다. 따라서, PR-음성(PR-) 유방암은 PR-양성 유방암에서 볼 수 없는 별개의 시그널링 경로 내에서 변경될 수 있다는 것을 예측할 수 있다. 이에 PR 상태 기반의 서브그룹-특이적인 바이오마커 또는 예후적 인자를 동정하는 것이 요구되고, 이는 PR 양성 및 PR 음성 유방암 사이의 임상적 결과 및 동태상의 차이점에 원인이 있는 기전에 대한 단서를 제공할 수 있을 것이다.

한편, 공공 자료는 유전자 발현 및 임상 결과 사이의 통계적으로 중요한 관련성을 탐구하는 것에 의해 새로운 치료학적 타겟 또는 예후적인 유전자 시그니쳐를 찾기 위한 강력한 자원으로서 종종 사용된다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 PR 음성 유방암에 초점을 맞춘 특정 예후적인 유전자 시그니쳐를 발굴하는 것을 목적으로 하고, DOCK10의 발현이 PR 음성 유방암 환자에서의 예후와 음성적으로 관련이 있는 것을 확인하였다. 나아가, DOCK10이 Cdc-42 Rho-패밀리 GTPase에 대한 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자(GEF)이어서, 이것이 간엽-아메바 이행 및 그 반대를 야기하는 Cdc42 시그널링의 스위치온 및 오프에 의한 암세포 침윤에서의 주요인자(key player)라는 점을 추가적인 기능 연구로 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 DOCK10 유전자의 mRNA 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후 예측용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 DOCK10 유전자의 mRNA 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암의 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 DOCK10 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 시험물질을 처리하여 단백질의 활성을 억제하는 시험물질을 유방암의 재발 억제제로 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 DOCK10 유전자의 mRNA 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예후"는 유방암과 같은 질환의, 예를 들어 재발, 전이성 확산, 및 약물 내성을 비롯한 유방암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 예후는 유방암 치료 후 전신 또는 국소 전이, 재발 또는 사망 가능성을 의미하며, 바람직하게는 유방암의 수술 또는 항암 화학요법을 시술 받은 후 2년 이내에 전신 또는 국소 전이, 재발 또는 사망할 지의 여부를 예측하는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "예측"이란 환자가 화학요법 또는 방사선 치료 등의 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자가 치료, 예를 들어 특정 치료제, 및/또는 원발성 종양의 수술로 제거, 및/또는 암의 재발 없이 특정 시기 동안 화학요법으로 치료된 후의 생존 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 본 발명의 예측방법은 임의의 특정 환자에 대한 가장 적절한 치료방식을 선택하여 적용함으로써 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측방법은 환자가, 예를 들어 소정의 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정 의 치료 처방과 같은 치료법에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존 또는 전신 또는 국소 전이, 재발 또는 사망이 가능한지를 예측할 수 있다. 또한 이를 통하여 불필요한 보조 항암요법을 최소화하거나 전신 또는 국소 전이, 재발 또는 사망이 예측되는 환자에게는 더욱 효과적인 보조 항암요법을 사용할 수 있도록 계획할 수 있다.

본 발명에서 용어, "예후 예측용 조성물"은 프로게스테론 수용체 음성 유방암에 대한 치료 후 예후가 양호한 환자와 양호하지 않은 환자를 구별하여 재발 가능성을 예측할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 대조군에 비해 유방암 재발군 및 비재발군에서 발현수준의 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백 등과 같은 유기 생체 분자 등을 예후 예측용 마커로서 포함한다. 유의성 있는 예후 예측 마커의 선택과 적용은 예후 예측 결과의 신뢰도를 결정짓는다. "유의성 있는 예후 예측 마커"란, 예후 예측하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다.

본 발명에 따른 유방암의 예후 예측 마커인 DOCK10(Dedicator of cytokinesis)는 ZIZ3, DRIP2, Nbla10300로도 알려져 있으며, 세포내 시그널링 네트워크에 관여한다는 것으로 알려진 단백질이고, 구아닌 뉴클레오타이드 교환인자인 DOCK 패밀리의 DOCK-D 패밀리의 일원으로 작은 G-단백질의 활성제로서 기능한다. 또한, DOCK10은 말초 혈관 백혈구뿐 아니라 뇌, 비장, 폐 등에서 발현하는 것으로 알려져 있고, 본 발명에서, 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 전신 또는 국소 재발과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 감소하는 유전자이다. 이 DOCK10 유전자의 서열은 유전자뱅크(GenBank)에 등록되어 당해 분야에 공지되어 있다(Accession No.: NC_000002.12). 본 발명자들은 프로게스테론 수용체 음성 유방암에 특이적인 예후 바이오 마커를 동정하기 위해 다수의 빅데이터셋을 분석하여 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 전이 또는 원격재발에 관여하는 예후적인 유전자를 선정하였고, 그중 DOCK10이 암세포 침윤에서 중요한 역할을 하는 Cdc42 Rho- 패밀리 GTPase에 대한 중요한 GEF이고, 그 결과 DOCK10의 낮은 발현이 프로게스테론 수용체 음성 유방암에서 특이적으로 높은 전이, 재발 또는 사망 위험을 나타냄을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "mRNA 발현수준 측정"은 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 DOCK10 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 마커 유전자의 염기서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 고안할 수 있다. 본 발명에 따른 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후 마커 유전자의 염기서열은 유전자뱅크(GenBank)에 등록되어 당해 분야에 공지된 상태이므로, 당업자는 상기 염기서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다. 본 발명에서 용어, "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어 표적 서열 내에서 전형적으로 mRNA와 헤테로이중체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 염기서열 및 서브 유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 유사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 본 발명에서 용어, "프라이머"는 적절한 완충액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포 스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적절한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30개 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필 요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 본 발명에서는 DOCK1 유전자에 대한 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행한 후 PCR 생성물의 증폭 여부를 통해 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 전이, 재발, 사망 가능성 및 생존 예후를 예측할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프로브"는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개 염기 내지 길게는 수백 개 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일가닥 DNA 프로브, 이중가닥 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 DOCK1 유전자에 대해 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시한 후, 혼성화 여부를 통해 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 재발 여부를 비롯한 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법을 비롯한 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분 야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡핑, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로 티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서 용어, "단백질의 발현수준 측정"은 프로게스테론 수용체 음성 유방암 전이, 재발 또는 사망 가능성을 특이적으로 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자로부터 코딩된 단백질의 존재 여부와 발현수준을 확인하는 과정으로, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용해 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석방법으로는 웨스턴 블랏팅(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 면역조직화학 염색, 면역침전분석(immunoprecipitation assay), 보체고정분석(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용되는 항체는 본 발명의 DOCK1 유전자에 의해 코딩된 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 상기 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻은 후, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 펩티드 단편도 포함되며, 본 발명의 펩티드 단편으로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체는 그 형태가 특별히 제한되지 않으며, 다중클론 항체, 단일클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이라면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기한 바와 같이 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후 예측 마커 유전자가 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당 업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다중클론 항체는 상기한 유방암의 예후 예측 마커 유전자로부터 코딩되는 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당해분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다중클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 단클론 항체는 당해분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology, 6: 511-519, 1976), 또 는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352: 624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222(58): 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 재조합 항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후 예측용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 마커 유전자의 mRNA 발현수준 또는 단백질의 발현수준을 확인하여 마커를 검출함으로써 프로게스테론 수용체 유방암 전이, 재발 또는 사망 가능성을 예측할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 상기 유방암 재발 여부를 예측할 수 있는 마커 유전자의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브, 또는 상기 마커 유전자로부터 코딩된 단백질을 선택적으로 인지하는 항체뿐만 아니라 분석에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 DOCK10 마커 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 필수요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 유방암의 재발 가능성을 예측하기 위한 마이크로어레이 형태일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 본 발명에 따른 유방암의 예후 마커 유전자의 염기서열에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함한다. 본 발명의 마이크로 어레이는 본 발명에 따른 마커 유전자의 낮은 발현을 검출하여 유방암의 전이, 재발 또는 사망 여부를 예후 예측 하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후 마커 유전자에 대한 프로브를 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당해분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, DNA 마이크로어레이는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 파이조일 렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법에 의해 본 발명에 따른 마커 유전자에 대한 프로브를 기판 상에 고정화시킬 수 있다. 본 발명의 마이크로어레이의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당해분야에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 핵산 시료를 형광물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 DOCK10 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기재로는 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소로는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광물질로는 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질로는 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐 렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 DOCK10 유전자의 mRNA 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암의 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법은,

1) 분리된 개체의 시료로부터 DOCK10 유전자의 발현수준 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계;

2) 상기 유전자의 mRNA 발현수준 또는 단백질의 발현수준을 정상 대조군 시료의 발현수준과 비교하는 단계;

3) 정상 대조군 시료보다 감소된 발현 수준을 나타내는 개체의 시료를 정상 대조군 시료보다 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 전이, 재발 또는 사망 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "개체의 시료"란 유방암에 대한 수술 및/또는 화학요법을 시술 받은 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. mRNA 발현수준을 측정하기 위한 분석방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기 분석방법을 통하여, 정상 대조군 시료의 mRNA 발현수준과 유방암 재발 의심 개체에서의 mRNA 발현수준을 비교할 수 있고, 마커 유전자에서 mRNA로의 발현수준의 유의한 감소여부를 판단하여 유방암 재발 의심 개체의 실제 유방암 재발 여부를 예후 예측할 수 있다. mRNA 발현수준은, 바람직하게는 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합반응 또는 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프로브를 이용하는 DNA 마이크로어레이 칩을 이용하여 측정할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 마커 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 역전사효소 중합반응을 수행한 후 생성물을 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 유방암의 예후 예측 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현수준을 측정한 후 이를 정상 대조군의 발현수준과 비교함으로써 유방암의 재발 가능성을 간 편하게 예후 예측할 수 있다. 이때, DOCK1 발현수준이 감소한 경우에 유방암의 전이, 재발 또는 사망 가능성이 높은 것으로 예후 예측할 수 있다. 한편, DNA 마이크로어레이 칩은 상기 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부에 형광물질이 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 유방암 재발 가능성을 예후 예측할 수 있다. 본 발명에 적합한 형광물질로 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-Bisothiocyanate), 로다민(rhodamine) 등을 사용할 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, DNA 마이크로어레이 칩은 36 k Human V4.0 OpArray 올리고마이크로어레이(Operon, Germany) 또는 전체 인간 게놈 올리고 마이크로어레이(Whole human genome oligo microarray, Agilent, USA) 등을 사용할 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 단백질 발현수준을 측정하기 위한 분석방법으로는, 웨스턴 블랏팅, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기 분석방법을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 유방암 재발 의심 개체에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 마커 유전자에서 단백질로의 발현수준의 유의한 증가여부를 판단하여, 유방암 재발 의심 개체의 실제 유방암 재발 가능성을 예후 예측할 수 있다. 본 발명에서 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 강도를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 단백질 발현수준은, 예컨대 ELISA를 이용하여 측정할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지 하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 이용할 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응 시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여 유방암의 전이, 재발 또는 사망 가능성을 예후 예측할 수 있다. 상기 검출방법은 유방암 비재발군에서의 마커 단백질의 발현수준과 유방암 재발 의심군에서의 마커 단백질의 발현수준을 조사하는 방법으로 이루 어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다. 또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직화학염색을 실시할 수 있다. 유방암 재발 의심군으로부터 채취한 조직을 고정한 후 당해분야에 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙여 조직 절편 슬라이드를 제작한 후, 여기에 본 발명에 따른 마커 단백질에 특이적인 항체를 공지의 방법에 따라 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하여 제거하고, 면역반응을 관찰하기 위한 발색시약으로 반응시켜 마커 단백질의 발현수준을 현미경 하에서 관찰할 수 있다. 또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화하여 항원-항체 복합체를 형성하고, 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현수준을 확인함으로써 유방암의 재발 가능성을 예후 예측할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 DOCK10 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 시험물질을 처리하여 단백질의 활성을 촉진 또는 억제하는 시험물질을 유방암의 전이, 재발 또는 사망 억제제로 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명의 스크리닝 방법은,

1) DOCK10 유전자 발현이 감소된 세포와 시험물질을 접촉시키는 단계;

2) 상기 유전자의 mRNA 발현수준 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및

3) 시험물질 처리 세포의 발현수준을 미처리 세포의 발현수준과 비교하여 DOCK10 유전자의 발현을 억제시키는 시험물질을 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다.

상기에서 "시험물질(test agent)"은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물 (compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이들로 한정되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기분자(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한, 천연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 달리 지시되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다. 본 발명의 방법으로 스크리닝되거나 동정될 수 있는 시험물질은 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱(betaturnmimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르 바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 유사체 또는 조합을 포함한다. 상기 시험물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 시험물질은 펩티드, 예컨대, 약 5 내지 30개, 바람직하게는 약 5 내지 20개, 보다 바람직하게는 약 7 내지 15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 천연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스화(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다. 또한 상기 시험물질은 "핵산"일 수 있다. 핵산 시험물질은 천연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스화" 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다. 또한 상기 시험물질은 "소분자"(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 상기에서 대상 유전자의 발현수준은 mRNA 및/또는 단백질 수준에서 상술한 바와 같은 방법, 예컨대 mRNA 발현수준은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법(RPA), 노던 블랏팅, DNA 마이크로어레이 칩 등에 의해, 단백질 발현수준은 웨스턴 블랏팅, ELISA, 방사 선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염 색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS, 단백질 칩 등에 의해 측정될 수 있다.

본 발명에서는 DOCK10 유전자의 낮은 발현을 측정하여 프로게스테론 수용체 음성 유방암에 대한 유방암이 전이, 재발, 사망할 가능성을 정확하면서도 신속하게 예측할 수 있다. 따라서, 본 발명은 다른 유방암에 대해 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후가 양호하지 않은 환자와 양호한 환자를 특이적으로 식별할 수 있고, 이를 통해 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 재발 여부를 조기에 판단하여 적절한 치료법의 선발 및 적용을 가능케 함으로써 상기 유방암 환자의 생존율을 높일 수 있다.

도 1은 유방암 환자의 서브그룹을 결정하기 위해 ER, PR 및 HER2의 발현 프로파일에 기초하여 양봉 분포를 최적화하고 컷오프 수치를 결정하는 것을 나타낸다. A: Affymetrix Human Genome U133A Array (HGU133a)로부터의 총 2,329명 환자 데이터의 "205225_at" (ER), "208305_at" (PR), 및 "216836_s_at" (HER2) 의 프로브셋들의 발현 프로파일, B: Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array (HGU133plus2)로부터의 총 781명 환자 데이터의 "205225_at" (ER), "208305_at" (PR), 및 "216836_s_at" (HER2) 프로브셋들의 발현 프로파일, C: Illumina HumanRef-8 v1.0 expression beadchip (GSE22219)로부터의 216명 환자 데이터의 "360020" (ER), "4560050" (PR), 및 "2350129" (HER2) 프로브셋들의 발현 프로파일, D: Illumina HumanHT-12 V3.0 expression beadchip (GSE24490)로부터의 183명 환자 데이터의 "ILMN_1678535" (ER), "ILMN_1811014" (PR), 및 "ILMN_2352131" (HER2) 프로브셋의 발현 프로파일, E: Agilent 244K Custom Gene Expression G4502A-07 (TCGA)로부터의 503명 환자 데이터의 "NM_000125_1_6342" (ER), "NM_000926_1_2887" (PR), 및 "NM_004448_1_4031" (HER2) 프로브셋의 발현 프로파일을 나타낸다.
도 2는 탐색 데이터에서의 ER, PR 및 HER2 발현으로 정의된 서브그룹에 대한 전이, 원격전이 또는 원격비재발 생존의 Kaplan-Meier plot을 나타낸 것이다.
도3은 DOCK10 shRNA 넉다운 후의 증가된 종양 성장 및 전이를 나타낸 그래프이다. A: DOCK10의 shRNA 넉다운 이후의 DOCK10 발현, B: 팻패드 주사 후의 생체 내 종양 성장 및 최종 종양 크기 (D59), C: 팻패드 주사 이후의 폐 전이 (D59), D: 정맥 주사 이후의 폐 전이(D46)를 나타낸다.
도 4는 DOCK10 shRNA 넉다운 이후의 증가된 종양 침윤을 나타낸 것이다.
A: 마트리겔 매트릭스 상에서의 트랜스웰 침윤 어세이(24시간), B: 타입 I 콜라겐 매트릭스에서의 트랜스웰 침윤 어세이(24시간), C: 상처 치유 어세이(18시간), D: 마트리겔 매트릭스 내에서의 3D 배양(10일)
도 5는 콜라겐 I의 두꺼운 층상에서의 총 및 활성화 GTP-결합된 Cdc42 및 Rac1의 수준을 나타낸 도면이다.
도 6은 탐색 데이터에서의 ER, PR 및 HER2 발현의 양봉 분포에 의해 정의된 유방암 환자의 서브그룹 내에서의 DOCK10 발현의 예후 유의성에 대한 Kaplan-Meier plot 및 메타분석 결과인 forest plot이다. FE model: Fixed Effect model; RE model, Random Effect model을 의미한다.
도 7은 밸리데이션 데이터에서의 ER, PR 및 HER2 발현의 양봉 분포에 의해 정의된 유방암 환자의 서브그룹 내에서의 DOCK10 발현의 예후 유의성에 대한 Kaplan-Meier plot 및 메타분석 결과인 forest plot이다. FE model: Fixed Effect model; RE model, Random Effect model을 의미한다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

1. 실시예 1: 방법

1-1) PR- 유방암의 특이적인 예후 관련 바이오마커의 동정을 위한 공공 데이터 수집 및 분석

모든 데이터 파일은 GEO FTP 사이트 및 TCGA 데이터 포털로부터 다운로드 받았다. Affymetrix Human Genome U133A (HGU133a) 플랫폼 또는 Human Genome U133 Plus 2.0 (HGU133plus2) 플랫폼 상에서 생성된 마이크로어레이 raw data는 Robust Multi-array Average (RMA) 알고리즘을 사용하여 전처리 하였고 동일한 플랫폼을 갖는 다수의 데이터 시리즈들은 통합하여 전처리 하였다. TCGA 데이터는 background subtraction, within-array loess normalization, 및 between-array quantile normalization을 사용하여 전처리 한 후 프로브들은 "ProbeName"을 기준으로 하여 평균값을 계산하여 분석에 사용하였다. GSE22219 및 GSE24450 시리즈들로부터 나온 2종의 데이터셋에 관하여는 전처리된 데이터를 GEO 사이트로부터 직접 다운로드하였다. 수집된 데이터는 마이크로어레이 플랫폼이 같은 데이터를 통합하여 최종적으로 5개의 데이터셋으로 통합하여 분석하였다. 5개의 데이터셋은 Affymetrix 마이크로어레이 플랫폼 HGU133a을 기반으로 생성된 데이터셋, Affymetrix 마이크로어레이 플랫폼 HGU133plus2을 기반으로 생성된 데이터셋, TCGA, GSE22219 및 GSE24450 데이터셋으로서 총 4,920 명 유방암 환자의 유전자 발현 프로파일로 구성되어 있었다. ER, PR 및 HER2 발현 상태에 따른 유방암 환자 자료를 세분화하기 위하여 먼저 각 데이터셋 내에서 ER, PR 및 HER2의 대표적인 프로브셋의 발현 분포에 최적화된 2개의 정규분포 즉 양봉분포(bimodal distribution)를 결정하였고 최적화된 양봉분포를 결정한 후 환자 자료를 분리하기 위한 컷오프 포인트는 2개의 정규분포 곡선이 교차되는 발현 수치로 결정하였다.

양봉분포의 최적화를 위해 선택된 대표적인 프로브셋은 다음과 같다:

HGU133a 의 전체 2,786명 환자 발현 프로파일에 대한 "205225_at" (ER), "208305_at" (PR), and "216836_s_at" (HER2) 의 프로브셋,

HGU133plus2의 전체 1,232명 환자 발현 프로파일에 대한 "205225_at" (ER), "208305_at" (PR), "216836_s_at" (HER2)의 프로브셋,

Illumina HumanRef-8 v1.0 (GSE22219)의 전체 216명 환자 발현 프로파일에 대한 "360020" (ER), "4560050" (PR), 및 "2350129" (HER2))의 프로브셋,

Illumina HumanHT-12 V3.0 (GSE24490)의 전체 183명 환자 발현 프로파일에 대한 "ILMN_1678535" (ER), "ILMN_1811014" (PR), 및 "ILMN_2352131" (HER2)의 프로브셋,

Agilent 244K G4502A-07 (TCGA)의 전체 503 발현 프로파일에 대한 "NM_000125_1_6342" (ER), "NM_000926_1_2887" (PR), 및 "NM_004448_1_4031" (HER2) 프로브셋.

효과적인 분석을 위하여 전체 자료를 2개로 나누어 각각 탐색자료와 밸리데이션 자료로 사용하였다. 먼저 탐색자료로 사용된 자료는 유방암 환자의 전이와 관련된 임상자료 즉 전이관련된 결과인 무전이 생존(MFS), 무원격전이 생존(DMFS), 또는 무원격재발 생존(DRFS)와 관련된 생존 정보가 있는 샘플들만을 선택하여 탐색자료로 사용하였다. 탐색자료는 총 3,326 명 환자의 유전자 발현 프로파일을 포함하는 3종의 데이터셋으로 구성되어 있었으며 (dataset on HGU133a (n=2,329), dataset on HGU133plus2 (n=781), and GSE22219 (n=216)) 이 중 3,227명 환자의 전이관련 생존 결과를 포함하였다. 이들 3종의 테이터셋에서 공통적으로 분석 가능한 유전자들은 총 11,715 유전자였다(Entrez Gene IDs). 이들 유전자 중에서 유방암 환자군에서 발현 변화가 큰 유전자를 선택하여 분석하기 위하여 표준 편차(SD)가 각 데이터셋에서 계산된 표준 편차의 중간값보다 높은 것을 나타내는 것만을 선택하였고, 결과적으로 총 3,328 개의 유전자가 분석에 사용되었다. 다양한 프로브셋을 갖는 유전자에 대해서는 샘플간에 가장 큰 표준편차를 갖는 프로브셋을 유전자에 대한 대표적인 것으로서 선택하였다. 이 후 PR- 유방암에서 특이적인 예후 관련 유전자를 동정하기 위하여 3종의 데이터셋의 PR- 및 PR+ 서브그룹 내에서 Cox 회기 분석을 각각 수행하였다. Cox 회기 분석 결과 PR- 유방암에서 특이적인 예후 관련 유전자를 선택하는 기준은 해당 유전자가 3종의 모든 데이터셋의 PR- 서브그룹에서의 유의적으로 전이와 관련이 있고(P < 0.02), PR+ 서브그룹에서는 유의적인 관련이 없을 때 결정되었다(P ≥ 0.05). 비모수연관(Nonparametric associations) 분석은 Kaplan-Meier curve 및 log-rank test를 사용하여 측정하였다. 메타 분석은 이질성 검정(heterogeneity test)을 실시하여 이질성이 나타나지 않는 경우 고정요인(Fixed Effect, FE) 모델을 사용하고 유의한 이질성이 나타나는 경우 Restricted Maximum Likelihood (REML) 알고리즘을 사용하여 임의요인(Random Effect, RE) 모델을 적용함으로써 유전자 발현과 생존 결과 사이의 유의적인 관련성을 확인하는 방법에 의해 실시되었다. 본 발명자들은 탐색분석에서 발견된 결과의 통계학적 유의성을 확인하기 위해 독립적인 데이터셋에서의 밸리데이션을 실시하였고 밸리데이션을 위해 1,594명 환자 샘플들을 포함하는 잔여 데이터셋을 벨리데이션 데이터로서 지정하여 밸리데이션을 위한 추가 분석을 실시하였다. 모든 분석은 R 통계적 소프트웨어 및 바이오컨덕터 패키지를 사용하여 수행되었다(http://www.R-project.org/, http://bioconductor.org/).

실시예 2: 결과

2-1) PR- 유방암의 특이적인 예후 관련 바이오마커의 동정

PR- 유방암에서 특이적인 예후 관련 바이오마커를 동정하기 위하여 총 4,920 명의 유방암 환자로부터 얻어진 암조직의 유전자 발현 프로파일(마이크로어레이) 및 4,786명의 생존 결과가 포함된 공공데이터를 사용하였다 (표 1). ER, PR 및 HER2 유전자 발현에 따라 유방암 환자 자료를 세분하기 위하여 ER, PR 및 HER2 유전자 발현 프로파일을 이용한 양봉분포에 의해 결정된 컷오프 수치에 기초하여, 유방암 환자군 샘플을 ER, PR 및 HER2 발현에 따른 서브그룹으로 나누었다(도 1, 표 1).

PR- 유방암에서 특이적인 예후 관련 바이오마커를 동정하기 위하여 총 4,920 명의 샘플들을 2종의 데이터 카테고리로 나누었다: 하나는 PR- 서브그룹에 특이적인 전이 관련 유전자 시그니쳐를 검출하기 위한 탐구 분석을 위한 것이고, 하나는 밸리데이션 분석을 위한 것으로 나머지 모든 샘플을 포함하였다(표 1). 먼저 PR+, PR- 유방암 환자의 예후를 비교하기 위하여 탐구자료를 이용하여 Kaplan-Meier curve 및 logrank 분석을 실시한 결과 ER+HER2- 유방암인 경우 PR+ 경우에 비하여 PR- 인 경우 예후가 나쁜 것으로 나타났다. 즉 ER+HER2- 유방암에서 전이 위험이 PR+ 서브그룹 내에서보다 PR- 서브그룹에서 더 높다는 것을 보여주었다(도 2).

위의 분석 결과에 기초하여 PR- 유방암 환자에서만 특이적으로 예후와 관련된 유전자를 탐색하였다. 3종의 독립적인 데이터셋에서의 Cox 회기 분석에 기초하여, PR+ 서브그룹에서가 아닌 PR- 서브그룹에서 전이 또는 원격재발에 관여하는 예후 관련 유전자로서 11개의 유전자를 찾아내었다(표 2).

이들 11개 유전자의 발현이 낮아질수록 전이가 높아지는 것으로 나타났으며, 이 유전자들은 면역반응 (CCL19, APOBEC3G, CD79A, XCL1 및 CD27)(P=0.00009), 림프구 분화 (LCK, IRF1, 및 CD79A)(P=0.0008) 및 사이토카인-사이토카인 상호반응 (CCL19, XCL1 및 CD27)(P=0.01)과 관련된 유전자로 구성되어 있었다. 11개의 예후 관련 유전자 시그니쳐 중 2개의 유전자, ARHGAP15 및 DOCK10은 Rho GTPase 조절제로 알려져있었다. 본 발명자들은 특히 간엽-아메바 이행(mesenchymal-amoeboid transition) 또는 그 반대를 야기하는 Cds42 시그널링을 스위치온 및 오프하는 것에 의해 암세포 침윤에서 중요한 역할을 하는 Cdc42 Rho-패밀리 GTPase에 대한 GEF로 알려진 DOCK10에 초점을 맞추었다.

2-2) DOCK10 유전자의 기능적 연구

DOCK10 유전자의 shRNA 넉다운은 마우스 내로 MB231 세포의 지방 패드 주사를 한 후에 생체 내 종양 성장(도 3A-3C) 및 팻패드 주사 및 정맥내 주사 (도 3D, 3E)후의 폐 전이를 중대하게 증가시켰다. MB231 세포의 이동 및 침윤하는 능력은 DOCK10의 shRNA 넉다운 이후에 현저하게 증가하였고, 이는 트랜스웰 침윤 어세이 (도 4A, 4B), 상처 치유 어세이 (도 4C), 수직 콜라겐 어세이 (도 4D)에 의해 확인되었다. 나아가, 마트리겔 매트릭스에의 3D 배양은 DOCK10의 shRNA 넉다운이 MB231 세포의 더욱 많은 스템셀 유사 콜로니 (도 4E)의 형성을 야기하는 것을 나타내었다. 이후, 본 발명자들은 shRNA DOCK10 세포주에서의 Cdc42 및 Rac1 활성을 확인하였다; Rac1-GTP 수준이 더욱 완만하게 증가한것에 반해 (도 5A 및 4B); Cdc42-GTP 수준은 대조군 세포에 비해 감소한 것을 확인하였다; 이는 DOCK10이 생체 내에서 Rac1이 아닌 Cdc42의 GEF로 작용하는 것으로 사료되었다. 종합하면, dock10의 넉다운 결과 GTP와 결합한 Cdc42-GTP의 감소가 야기되고, DOCK10이 Cdc42와 결합한다는 결과는 DOCK10이 Cdc42-GEF라는 것을 강하게 뒷받침하는 것이다.

2-3) 유방암 환자들의 예후와 DOCK10 -발현과의 관련성

Kaplan-Meier 커브, 비모수 logrank test 및 메타분석 결과는 DOCK10이 유방암의 PR- 서브그룹에서 중요한 예후 관련 유전자임을 분명하게 보여주었다(도 6A-6C). PR+ 서브그룹에서, logrank 테스트 또는 메타분석 어느 것에서도 통계적인 유의성은 관찰되지 않았다 (도 6C). 환자들을 추가적으로 ER+PR- 및 ER-PR- 서브그룹으로 나누어 DOCK10의 예후 관련성을 분석한 경우, DOCK10의 예후 관련성은 ER+PR- 서브그룹에서 보다는 ER-PR- 서브그룹에서 더욱 뚜렷하게 나타났다 (도 6D, 6E). 즉 메타분석 결과 DOCK10의 발현 1 증가에 의해 감소되는 위험비(hazard ratio) 및 95% 신뢰구간은 ER+PR- 및 ER-PR- 서브그룹에서 각각 0.74 (95% CI: 0.60-0.92) 및 0.67 (95% CI: 0.54-0.83)로 DOCK10의 예후 관련성은 ER-PR- 서브그룹에서 좀 더 확실하게 나타나는 것으로 확인되었다 (도 6D, 6E). 반면에, 유방암 환자의 HER2 status는 DOCK10의 예후 관련성에 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다 (도 6F, 6G). 각 유방암 서브그룹 내에서의 DOCK10 발현수치의 분포는 3종의 데이터셋에서 거의 차이가 없을 뿐 아니라 데이터셋의 작은 샘플 크기에 영향을 받을 수도 있는 GSE22219 데이터셋에서도 단지 작은 차이만을 나타냄을 보여주었다(도 6H).

탐색자료에서 확인된 PR- 유방암에서의 DOCK10의 예후 관련성은 전이관련 예후가 아닌 기타 생존 자료 [OS(overall survival), EFS(event-free survival), DFS(disease-free survival), DSS(disease-specific survival) 또는 RFS(relapse-free survival)]를 사용한 1,559명 환자 자료 즉 또 다른 독립적인 밸리데이션 자료를 사용하여 재확인 되었다. 탐색자료와 밸리데이션 자료는 생존 자료가 서로 상이함에도 불구하고, 그 결과는 탐색자료로부터 얻어진 분석결과와 놀랍게도 일치하였다 (도 7). 단지 경미한 결과에서 탐색 자료 분석과 밸리데이션 분석 결과 사이에 일치하지 않는 점이 있었다. 즉 밸리데이션 자료 분석에서 PR+ 서브그룹의 logrank 테스트에서 통계적 유의성이 보였다는 것이나 (도 7C) 메타분석에서는 통계적인 유의성을 나타내지 않았으며 이 결과는 탐색자료 분석 결과와 일치하는 것이다(도 7C의 오른쪽 패널).

결론적으로, DOCK10 유전자는 다양한 암 진행 및 전이에 관여한다고 알려진 Cdc-42에 대한 중요한 GEF로서 PR- 유방암에서 예후와 관련된 유전자로 확인되었으며 DOCK10 유전자 발현이 감소하면서 전이나 생존 등 예후가 나빠진다는 것을 확인하였다.

Claims (18)

1. DOCK10(Dedicator of cytokinesis) 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 프로게스테론 수용체(Progesterone receptor, PR) 음성 유방암의 예후 예측용 조성물로서,
   상기 DOCK10 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현이 대조구의 DOCK10 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현보다 낮은 경우 프로게스테론 수용체(Progesterone receptor, PR) 음성 유방암의 예후가 나빠지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
2. 제1항에 있어서, mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제가 DOCK10 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 프라이머쌍 또는 프로브인 것인, 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후 예측용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 단백질의 발현수준을 측정하는 제제가 상기 DOCK10 유전자로부터 코딩되는 단백질에 특이적인 항체인 것인, 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후 예측용 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후 예측용 키트.
5. 제4항에 있어서, 상기 키트가 RT-PCR 키트, 마이크로어레이칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인, 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후 예측용 키트.
6. 제5항에 있어서, 상기 RT-PCR 키트가 DOCK10 유전자에 특이적인 프라이머쌍을 포함하는 것인, 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후 예측용 키트.
7. 제5항에 있어서, 상기 마이크로어레이 칩 키트가 DOCK10 유전자에 특이적인 프로브를 포함하는 것인, 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후 예측용 키트.
8. 제5항에 있어서, 상기 단백질 칩 키트가 DOCK10 유전자로부터 코딩되는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인, 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후 예측용 키트.
9. 1) 분리된 개체의 시료로부터 DOCK10(Dedicator of cytokinesis) 유전자의 발현수준 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계;
   2) 상기 유전자의 mRNA 발현수준 또는 단백질의 발현수준을 정상 대조군 시료의 발현수준과 비교하는 단계;
   3) 정상 대조군 시료보다 감소된 발현 수준을 나타내는 개체의 시료를 정상 대조군 시료보다 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 전이, 재발 또는 사망 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 프로게스테론 수용체 음성 유방암의 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 단계 2)에서 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제가 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브인 것인 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 단계 2)에서 mRNA 발현수준이 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 및 DNA 마이크로어레이 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 분석법에 의해 측정되는 것인 방법.
12. 제9항에 있어서, 상기 단계 2)에서 단백질의 발현수준을 측정하는 제제가 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질에 특이적인 항체인 것인 방법.
13. 제9항에 있어서, 상기 단계 2)에서 단백질 발현수준이 웨스턴 블랏팅, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정 분석, FACS 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 분석법에 의해 측정되는 것인 방법.
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