CN106383231B - 一种诊断肝癌的标记物组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测肝癌分期的标志物组合及其应用。具体地，本发明提供了syndecan‑1和1‑磷酸鞘氨醇在制备检测肝癌分期的诊断试剂盒中的用途。研究表明，syndecan‑1和1‑磷酸鞘氨醇在肝癌患者血清中的表达量显著高于正常健康人群，肝癌患者的血清syndecan‑1和1‑磷酸鞘氨醇表达水平正相关，不同分期患者的表达水平存在明显区别。因此，syndecan‑1和1‑磷酸鞘氨醇组合可作为肝癌分期诊断（尤其是血清学诊断）的标志物，利用它们可以提供相应的检测方法和试剂盒，实现肝癌的分期检测。

Description

一种诊断肝癌的标记物组合及其应用
【技术领域】
本发明涉及肿瘤学和诊断技术领域，具体涉及一种诊断肝癌的标记物组合及其用途。
【背景技术】
细胞外被（glycocalyx）的主要成分硫酸乙酰肝素（heparan sulfate）蛋白聚糖（proteoglycan）syndecan-1是一种跨膜蛋白，它的胞外区（ectodomain）上结合有硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素（chondroitin sulfate）侧链。
1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）又称为1-磷酸神经鞘氨醇，由血清蛋白蛋白或高密度脂蛋白携带。正常情况下，血中浓度为0.3-0.5 µM，可作为第二信使或与细胞表面受体1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）结合发挥生物学功能。
目前，syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇之间的协同关系的研究主要集中在血管内皮细胞上，特别是内皮的选择性通透屏障功能。syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇组合在肝癌分期诊断中的重要用途未见相关报道。
肝癌是我国常见的一种恶性肿瘤，位居肿瘤发生率的第三位，死亡率的第二位。原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是最常见肝癌类型。
肝癌的分期很关键，直接影响着癌症的治疗和预后。原发性肝癌TNM分期（UICC /AJCC，2010年）标准介绍如下：
（1）T-原发病灶：
　　Tx：原发肿瘤不能测定；
　　T0：无原发肿瘤的证据；
　　T1：孤立肿瘤没有血管受侵；
　　T2：孤立肿瘤，有血管受侵或多发肿瘤直径≤5cm；
　　T3a：多发肿瘤直径>5cm；
　　T3b:孤立肿瘤或多发肿瘤侵及门静脉或肝静脉主要分支；
　　T4：肿瘤直接侵及周围组织，或致胆囊或脏器穿孔；
（2）N-区域淋巴腺：
　　Nx：区域内淋巴腺不能测定；
　　N0：无淋巴腺转移；
　　N1：区域淋巴腺转移；
（3）M-远处转移：
　　Mx：远处转移不能测定；
　　M0：无远处转移；
　　M1：有远处转移；
（4）肝癌分期：
　　I期：T1N0M0；
　　II期：T2N0M0；
　　IIIA期：T3aN0M0；
　　IIIB期：T3bN0M0；
　　IIIC期：T4，N0M0；
　　IVA期：任何T，N1M0；
　　IVB期：任何T，任何N，M1。
中国的肝癌患者数目庞大，其发病率有逐年上升的趋势。目前中国肝癌患者占全世界该病发病率的54%，而肝癌患者的5年生存率不到5%。对肝癌进行早期诊断，可以有效的降低肝癌的发病率和病死率，对肝癌患者进行准确分期，可以指导肝癌患者具体治疗方案的选择和实施。但是，当前缺少合适的方法。而发展高敏感的血清特异标志物可有效鉴别肝脏恶性病变，对肝癌进行准确地诊断和分期。本领域迫切需要开发可用于检测和判断肝癌分期的血清特异标志物。
【发明内容】
本发明的目的在于针对技术方法的缺陷和不足，提供一种可用于检测或判断肝癌分期的血清特异标志物及其用途。
在本发明中，提供了一种syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的基因、mRNA、cDNA、或蛋白的组合用途，它被用作检测肝癌分期诊断的标志物；或用于制备检测肝癌分期的试剂或试剂盒。更佳地，所述的检测是血清检测。
作为本发明的一种优选，所述的试剂包括抗体、引物、探针、核酸芯片（如DNA芯片）或蛋白质芯片。
在本发明中，提供了syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇特异性抗体的组合用途，用于制备检测肝癌分期的诊断试剂或试剂盒。更佳地，所述的检测是血清检测。
在本发明中，提供了一种用于检测肝癌分期的诊断试剂盒，所述的试剂盒包含：
（a）syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇特异性抗体；和/或
（b）特异性扩增syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的mRNAs或cDNAs的引物或引物对。
在本发明中，提供了一种检测肝癌分期的方法，该方法包括：
（a）准备受试者测试样品；
（b）检测测试样品中syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的表达量，并将表达量检测结果与参比值进行比较，可准确判断受试者肝癌分期情况。
作为本发明的一种优选，所述测试样品为组织样品、血液样品、血清样品或体液样品。
作为本发明的一种优选，所述检测步骤b包括检测测试样品中syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的mRNA、cDNA和/或蛋白的量。
作为本发明的一种优选，其特征在于，所述的试剂盒还用于联合检测其他标记物的表达；其中，所述的其他标记物包括：甲胎蛋白（AFP）、硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素的表达。
在本发明中，提供了一种syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇特异性抗体的组合用途，用于制备血清检测肿瘤分期的诊断试剂或试剂盒。
作为本发明的一种优选，所述的试剂包括抗体、核酸芯片（如DNA芯片）或蛋白质芯片。
作为本发明的一种优选，所述的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
作为本发明的一种优选，所述的血清检测是ELISA法、或双抗夹心时间分辨免疫荧光法（TRFIA法）。
在本发明中，提供了一种 syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的组合用途，它被用作血清检测肝癌分期的标志物。
作为本发明的一种优选，所述肝癌包括肝细胞肝癌，尤其是原发性肝细胞肝癌。
在本发明中，所述1-磷酸鞘氨醇可通过结合1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）发挥作用；作为本发明的一种优选，提供了一种syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）的组合用途，它被用作检测受试者组织样品、血液样品、血清样品或体液样品中的syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇I型受体的mRNA、cDNA和/或蛋白的表达量，检测判断受试者肝癌分期情况。
在本发明中，单独使用syndecan-1、1-磷酸鞘氨醇、或1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）无法判断受试者肝癌分期情况，联合syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇，或联合syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）可以准确判断肝癌的分期，指导肝癌患者具体治疗方案的选择和实施。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
【附图说明】
图1 是1-磷酸鞘氨醇（S1P）在40对肝癌及健康人血清中的差异表达结果，图中control subjects代表健康人，HCC代表肝癌患者。
图2是syndecan-1在40对肝癌及健康人血清中的差异表达结果，图中controlsubjects代表健康人，HCC代表肝癌患者。
图3是正常人中，血清1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1无明显相关性。control代表健康人。
图4是肝癌患者中，血清1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1有明显相关性（P<0.0001）。control代表健康人。而且，不同分期患者的1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1组合表达界限明显。
图5是1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）在 40对肝癌及癌旁组织样本中的差异表达结果。图中NT是癌旁组织，T是癌组织。
图6是syndecan-1在 40对肝癌及癌旁组织样本中的差异表达结果。图中NT是癌旁组织，T是癌组织。
图7是1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）与syndecan-1在 肝癌及癌旁组织样本中的相对表达值呈负相关，而且，不同分期患者的1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1组合表达界限较明显。
【具体实施方式】
本发明人经过深入研究，发现1-磷酸鞘氨醇和syndecan-1在肝癌患者的血清中表达异常，且有明显相关性，可以作为肝癌分期检测的标志物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明的具体实验方法，按照Zeng Ye 等发表在《Oncotarget》杂志上的论文Sphingosine-1-phosphate induced epithelial-mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma via an MMP-7/ syndecan-1/TGF-β autocrine loop. 2016. doi: 10.18632/oncotarget.11450. 中所述方法进行。下面详述该篇论文中，没有具体涉及的肝癌分期诊断情况。
具体地，本发明人通过使用酶联免疫技术（ELISA）检测了40对肝癌及健康人血清，结果表明，1-磷酸鞘氨醇（S1P）在肝癌患者血清显著高表达（图1）；syndecan-1在肝癌患者血清显著高表达（图2）；正常人中，血清1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1无明显相关性（图3）；肝癌患者中，血清1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1有明显相关性（P<0.0001），不同分期患者的1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1组合表达有明显界限（图4）。
本发明人又采用了免疫印迹实验（Western blotting）检测了40对肝癌及癌旁组织样本，结果表明1-磷酸鞘氨醇（S1P1）在肝癌组织中显著高表达（图5），而syndecan-1在肝癌组织中显著低表达（图6），1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）与syndecan-1在 肝癌及癌旁组织样本中的相对表达值呈负相关，不同分期患者的1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1组合表达有较明显界限（图7）。
本发明的主要优点包括：肝癌作为病死率最高的恶性肿瘤之一，准确判断肝癌的分期，可以指导肝癌患者具体治疗方案的选择和实施。
以上所述仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的内容，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化或修饰，均包括于本发明所附权利要求书所限定的专利申请范围内。

Claims (6)

1.包含syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的标记物在用于制备血清检测肝癌分期的试剂或试剂盒中的用途，其中，所述1-磷酸鞘氨醇通过结合1-磷酸鞘氨醇I型受体(S1P1)发挥作用。
2.如权利要求1所述的用途，所述的试剂包括抗体、引物、探针、核酸芯片或蛋白质芯片。
3.如权利要求1所述的用途，所述的试剂盒包含：(a)syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇特异性抗体；和/或(b)特异性扩增syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的mRNAs或cDNAs的引物或引物对。
4.如权利要求1所述的用途，所述的试剂盒还用于联合检测其他标记物的表达；其中，所述的其他标记物包括：甲胎蛋白(AFP)、硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述标记物通过以下方法进行所述检测，所述方法包括：
(a)准备受试者测试样品；
(b)检测测试样品中syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的表达量，并将表达量检测结果与参比值进行比较。
6.如权利要求5所述的用途，所述检测步骤(b)包括检测测试样品中syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的mRNA、cDNA和/或蛋白的量。
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