CN106383231A - 一种诊断肝癌的标记物组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测肝癌分期的标志物组合及其应用。具体地，本发明提供了syndecan‑1和1‑磷酸鞘氨醇在制备检测肝癌分期的诊断试剂盒中的用途。研究表明，syndecan‑1和1‑磷酸鞘氨醇在肝癌患者血清中的表达量显著高于正常健康人群，肝癌患者的血清syndecan‑1和1‑磷酸鞘氨醇表达水平正相关，不同分期患者的表达水平存在明显区别。因此，syndecan‑1和1‑磷酸鞘氨醇组合可作为肝癌分期诊断（尤其是血清学诊断）的标志物，利用它们可以提供相应的检测方法和试剂盒，实现肝癌的分期检测。

Description

一种诊断肝癌的标记物组合及其应用
【技术领域】
本发明涉及肿瘤学和诊断技术领域，具体涉及一种诊断肝癌的标记物组合及其用途。
【背景技术】
细胞外被（glycocalyx）的主要成分硫酸乙酰肝素（heparan sulfate）蛋白聚糖（proteoglycan）syndecan-1是一种跨膜蛋白，它的胞外区（ectodomain）上结合有硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素（chondroitin sulfate）侧链。
1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）又称为1-磷酸神经鞘氨醇，由血清蛋白蛋白或高密度脂蛋白携带。正常情况下，血中浓度为0.3-0.5 µM，可作为第二信使或与细胞表面受体1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）结合发挥生物学功能。
目前，syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇之间的协同关系的研究主要集中在血管内皮细胞上，特别是内皮的选择性通透屏障功能。syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇组合在肝癌分期诊断中的重要用途未见相关报道。
肝癌是我国常见的一种恶性肿瘤，位居肿瘤发生率的第三位，死亡率的第二位。原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是最常见肝癌类型。
肝癌的分期很关键，直接影响着癌症的治疗和预后。原发性肝癌TNM分期（UICC /AJCC，2010年）标准介绍如下：
（1）T-原发病灶：
Tx：原发肿瘤不能测定；
T0：无原发肿瘤的证据；
T1：孤立肿瘤没有血管受侵；
T2：孤立肿瘤，有血管受侵或多发肿瘤直径≤5cm；
T3a：多发肿瘤直径>5cm；
T3b:孤立肿瘤或多发肿瘤侵及门静脉或肝静脉主要分支；
T4：肿瘤直接侵及周围组织，或致胆囊或脏器穿孔；
（2）N-区域淋巴腺：
Nx：区域内淋巴腺不能测定；
N0：无淋巴腺转移；
N1：区域淋巴腺转移；
（3）M-远处转移：
Mx：远处转移不能测定；
M0：无远处转移；
M1：有远处转移；
（4）肝癌分期：
I期：T1N0M0；
II期：T2N0M0；
IIIA期：T3aN0M0；
IIIB期：T3bN0M0；
IIIC期：T4，N0M0；
IVA期：任何T，N1M0；
IVB期：任何T，任何N，M1。
中国的肝癌患者数目庞大，其发病率有逐年上升的趋势。目前中国肝癌患者占全世界该病发病率的54%，而肝癌患者的5年生存率不到5%。对肝癌进行早期诊断，可以有效的降低肝癌的发病率和病死率，对肝癌患者进行准确分期，可以指导肝癌患者具体治疗方案的选择和实施。但是，当前缺少合适的方法。而发展高敏感的血清特异标志物可有效鉴别肝脏恶性病变，对肝癌进行准确地诊断和分期。本领域迫切需要开发可用于检测和判断肝癌分期的血清特异标志物。
【发明内容】
本发明的目的在于针对技术方法的缺陷和不足，提供一种可用于检测或判断肝癌分期的血清特异标志物及其用途。
在本发明中，提供了一种syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的基因、mRNA、cDNA、或蛋白的组合用途，它被用作检测肝癌分期诊断的标志物；或用于制备检测肝癌分期的试剂或试剂盒。更佳地，所述的检测是血清检测。
作为本发明的一种优选，所述的试剂包括抗体、引物、探针、核酸芯片（如DNA芯片）或蛋白质芯片。
在本发明中，提供了syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇特异性抗体的组合用途，用于制备检测肝癌分期的诊断试剂或试剂盒。更佳地，所述的检测是血清检测。
在本发明中，提供了一种用于检测肝癌分期的诊断试剂盒，所述的试剂盒包含：
（a）syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇特异性抗体；和/或
（b）特异性扩增syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的mRNAs或cDNAs的引物或引物对。
在本发明中，提供了一种检测肝癌分期的方法，该方法包括：
（a）准备受试者测试样品；
（b）检测测试样品中syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的表达量，并将表达量检测结果与参比值进行比较，可准确判断受试者肝癌分期情况。
作为本发明的一种优选，所述测试样品为组织样品、血液样品、血清样品或体液样品。
作为本发明的一种优选，所述检测步骤b包括检测测试样品中syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的mRNA、cDNA和/或蛋白的量。
作为本发明的一种优选，其特征在于，所述的试剂盒还用于联合检测其他标记物的表达；其中，所述的其他标记物包括：甲胎蛋白（AFP）、硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素的表达。
在本发明中，提供了一种syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇特异性抗体的组合用途，用于制备血清检测肿瘤分期的诊断试剂或试剂盒。
作为本发明的一种优选，所述的试剂包括抗体、核酸芯片（如DNA芯片）或蛋白质芯片。
作为本发明的一种优选，所述的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
作为本发明的一种优选，所述的血清检测是ELISA法、或双抗夹心时间分辨免疫荧光法（TRFIA法）。
在本发明中，提供了一种 syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的组合用途，它被用作血清检测肝癌分期的标志物。
作为本发明的一种优选，所述肝癌包括肝细胞肝癌，尤其是原发性肝细胞肝癌。
在本发明中，所述1-磷酸鞘氨醇可通过结合1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）发挥作用；作为本发明的一种优选，提供了一种syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）的组合用途，它被用作检测受试者组织样品、血液样品、血清样品或体液样品中的syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇I型受体的mRNA、cDNA和/或蛋白的表达量，检测判断受试者肝癌分期情况。
在本发明中，单独使用syndecan-1、1-磷酸鞘氨醇、或1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）无法判断受试者肝癌分期情况，联合syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇，或联合syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）可以准确判断肝癌的分期，指导肝癌患者具体治疗方案的选择和实施。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
【附图说明】
图1 是1-磷酸鞘氨醇（S1P）在40对肝癌及健康人血清中的差异表达结果，图中controlsubjects代表健康人，HCC代表肝癌患者。
图2是syndecan-1在40对肝癌及健康人血清中的差异表达结果，图中controlsubjects代表健康人，HCC代表肝癌患者。
图3是正常人中，血清1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1无明显相关性。control代表健康人。
图4是肝癌患者中，血清1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1有明显相关性（P<0.0001）。control代表健康人。而且，不同分期患者的1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1组合表达界限明显。
图5是1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）在 40对肝癌及癌旁组织样本中的差异表达结果。图中NT是癌旁组织，T是癌组织。
图6是syndecan-1在 40对肝癌及癌旁组织样本中的差异表达结果。图中NT是癌旁组织，T是癌组织。
图7是1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）与syndecan-1在 肝癌及癌旁组织样本中的相对表达值呈负相关，而且，不同分期患者的1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1组合表达界限较明显。
【具体实施方式】
本发明人经过深入研究，发现1-磷酸鞘氨醇和syndecan-1在肝癌患者的血清中表达异常，且有明显相关性，可以作为肝癌分期检测的标志物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明的具体实验方法，按照Zeng Ye 等发表在《Oncotarget》杂志上的论文Sphingosine-1-phosphate induced epithelial-mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma via an MMP-7/ syndecan-1/TGF-β autocrine loop. 2016. doi: 10.18632/oncotarget.11450. 中所述方法进行。下面详述该篇论文中，没有具体涉及的肝癌分期诊断情况。
具体地，本发明人通过使用酶联免疫技术（ELISA）检测了40对肝癌及健康人血清，结果表明，1-磷酸鞘氨醇（S1P）在肝癌患者血清显著高表达（图1）；syndecan-1在肝癌患者血清显著高表达（图2）；正常人中，血清1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1无明显相关性（图3）；肝癌患者中，血清1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1有明显相关性（P<0.0001），不同分期患者的1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1组合表达有明显界限（图4）。
本发明人又采用了免疫印迹实验（Western blotting）检测了40对肝癌及癌旁组织样本，结果表明1-磷酸鞘氨醇（S1P1）在肝癌组织中显著高表达（图5），而syndecan-1在肝癌组织中显著低表达（图6），1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）与syndecan-1在 肝癌及癌旁组织样本中的相对表达值呈负相关，不同分期患者的1-磷酸鞘氨醇与syndecan-1组合表达有较明显界限（图7）。
本发明的主要优点包括：肝癌作为病死率最高的恶性肿瘤之一，准确判断肝癌的分期，可以指导肝癌患者具体治疗方案的选择和实施。
以上所述仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的内容，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化或修饰，均包括于本发明所附权利要求书所限定的专利申请范围内。

Claims (6)

1.一种诊断肝癌的标记物组合及其应用，其特征在于，提供了一种syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇组合标记物，用于制备血清检测肝癌分期的诊断试剂或试剂盒。
2.如权利要求1所述的一种诊断肝癌的标记物组合及其应用，其特征在于， 所述的诊断试剂包括抗体、引物、探针、核酸芯片（如DNA芯片）或蛋白质芯片。
3.如权利要求1所述的一种诊断肝癌的标记物组合及其应用，其特征在于，所述的试剂盒包含：syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇特异性抗体；和/或特异性扩增syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇的mRNAs或cDNAs的引物或引物对。
4.如权利要求1所述的一种诊断肝癌的标记物组合及其应用，其特征在于，所述肝癌是原发性肝细胞肝癌。
5.如权利要求1所述的一种诊断肝癌的标记物组合及其应用，其特征在于，所述的试剂盒还用于联合检测其他标记物的表达；其中，所述的其他标记物包括：甲胎蛋白（AFP）、硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素的表达。
6.如权利要求1所述的一种诊断肝癌的标记物组合及其应用，其特征在于，所述1-磷酸鞘氨醇可通过结合1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）发挥作用，作为优选，提供了一种syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇I型受体（S1P1）的组合用途，它被用作检测受试者组织样品、血液样品、血清样品或体液样品中的syndecan-1和1-磷酸鞘氨醇I型受体的mRNA、cDNA和/或蛋白的表达量，检测判断受试者肝癌分期情况。
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