CN104673894B - 一种分子标记检测物在制备检测肝癌的试剂盒中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种分子标记检测物在制备检测肝癌的试剂盒中的用途，其中，所述分子标记检测物包括能够特异性地检测miR‑19a的检测物和能够特异性地检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的检测物。本发明能够提高检测肝癌的病理学分期和不良预后的准确率。

Description

一种分子标记检测物在制备检测肝癌的试剂盒中的用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种分子标记检测物在制备检测肝癌的试剂盒中的用途。
背景技术
原发性肝细胞癌(以下简称肝癌)是病死率很高的常见肿瘤。肝癌的发病率在所有肿瘤中排第六位，然而在全球癌症死亡率中排第三位，其中约55％发生在我国。由于肝癌发病隐匿，临床症状极不典型，对于不大于5cm的小肝癌约70％左右无症状，故肝癌常常不易被早期发现，当患者出现明显的临床症状时往往已处于肝癌的晚期，多数患者已失去最佳的治疗时间。肝癌的发生是很多因素综合作用的结果，涉及到很多基因的失调或突变。这些异常基因可导致正常肝细胞异常增殖及凋亡受抑制等。近年来发现的微小RNA(microRNA，miRNA)便是通过调控基因来发挥作用的，故miRNA在肝癌的诊断治疗中发挥着至关重要的作用。
miRNA是一种非编码、内源性的单链小分子RNA，长度为21-25nt。根据数据库miRBase第21版的记载，人类基因组中编码了1881个前体miRNA，这些前体miRNA能够形成2588个成熟miRNA。miRNA的功能主要是负性调节靶基因的表达，可与其靶基因信使RNA(mRNA)的3’非编码区(3’-UTR)特异性结合，使miRNA在翻译水平上抑制靶基因的表达，除此之外miRNA还可引起靶基因mRNA的降解。近些年来有研究结果表明miRNA可在转录水平上对目的基因进行调控，其主要通过对miRNA目的基因启动子区的CPG岛异常甲基化来发挥作用。因此，miRNA可通过对靶基因的调控发挥癌基因或抑癌基因的作用。miRNA的表达量会在生理样本和病理样本中出现差别，例如肿瘤样本中的某些miRNA的表达量会升高，而有另一些miRNA的表达量会降低。
目前，将miRNA作为分子标记，使用能够检测miRNA的分子标记检测物来检测待测样本中特定miRNA的表达量，能够有助于判断待测样本的疾病种类和程度。但是，现有的miRNA作为分子标记用于检测肝癌的病理学分期和不良预后时，准确率还比较低。
发明内容
本发明的目的是克服现有的miRNA作为分子标记用于检测肝癌的病理学分期和不良预后时，准确率还比较低的缺陷，提供一种能够以准确率较高的检测肝癌的病理学分期和不良预后的方案。
为了实现上述目的，本发明提供了一种分子标记检测物在制备检测肝癌的试剂盒中的用途，其中，所述分子标记检测物包括能够特异性地检测miR-19a的检测物和能够特异性地检测细胞周期蛋白D1的检测物。
优选地，所述能够特异性地检测miR-19a的检测物包括序列为SEQ ID NO.1的第一正向引物和序列为SEQ ID NO.2的第一反向引物，所述能够特异性地检测细胞周期蛋白D1的检测物包括序列为SEQ ID NO.3的第二正向引物和序列为SEQ ID NO.4的第二反向引物。
通过上述技术方案，本发明能够将检测肝癌的病理学分期和不良预后的准确率显著地提高。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是对130例病例进行随访，结合miR-19a和Cyclin D1的检测结果，进行五年总体生存分析的结果。
图2是对130例病例进行随访，结合miR-19a和Cyclin D1的检测结果，进行五年无病生存分析的结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种分子标记检测物在制备检测肝癌的试剂盒中的用途，其中，所述分子标记检测物包括能够特异性地检测miR-19a的检测物和能够特异性地检测细胞周期蛋白D1的检测物。
其中，所述能够特异性地检测miR-19a的检测物可以为特异性地针对miR-19a进行加尾法qRT-PCR检测或茎环法qRT-PCR检测的引物；能够特异性地检测细胞周期蛋白D1的检测物可以为特异性地针对细胞周期蛋白D1进行qRT-PCR检测的引物。
优选地，所述能够特异性地检测miR-19a的检测物包括序列为SEQ ID NO.1的第一正向引物和序列为SEQ ID NO.2的第一反向引物，所述能够特异性地检测细胞周期蛋白D1的检测物包括序列为SEQ ID NO.3的第二正向引物和序列为SEQ ID NO.4的第二反向引物。
其中，本发明的试剂盒可以按照包含如下步骤的方法使用：(1)从待测肝脏组织样本中提取RNA，得到RNA样本；(2)使用所述能够特异性地检测miR-19a的检测物，对所述RNA样本中的miRNA进行加尾法qRT-PCR检测或进行茎环法qRT-PCR检测；(3)使用能够特异性地检测细胞周期蛋白D1的检测物，对所述RNA样本中的细胞周期蛋白D1的mRNA进行qRT-PCR检测；如果待测肝脏组织样本中miR-19a的表达量下降且细胞周期蛋白D1的表达量上升，则指示待测肝脏组织来自肝癌患者。
其中，所述肝脏组织样本可以来自于肝穿刺样本，也可以来源于手术样本。其中，提取RNA样本的试剂和步骤可以使用英杰(Invitrogen)公司的商业化试剂盒并参照其说明书进行操作。其中，对miRNA的加尾法qRT-PCR检测以及茎环法qRT-PCR检测所用的试剂和方法可以使用凯杰(Qiagen)公司或普洛麦格(Promega)公司的商业化试剂盒并参照其说明书进行操作。其中，进行qRT-PCR的方法可以参照罗氏(Roche)公司的商业化试剂盒并参照其说明书进行操作。其中，待测肝脏组织样本中miR-19a的表达量下降是指待测肝脏组织样本中miR-19a的表达量与正常肝脏组织样本中miR-19a的表达量相比，待测肝脏组织样本中miR-19a的表达量为正常肝脏组织样本中miR-19a的表达量的二分之一以下。其中，待测肝脏组织样本中细胞周期蛋白D1的表达量上升是指待测肝脏组织样本中细胞周期蛋白D1的表达量与正常肝脏组织样本中细胞周期蛋白D1的表达量相比，待测肝脏组织样本中细胞周期蛋白D1的表达量为正常肝脏组织样本中细胞周期蛋白D1的表达量的二倍以上。其中，正常肝脏组织样本是指按照世界卫生组织(World Health Organization(WHO))标准以及国际抗癌学会(International Union against Cancer)标准进行诊断后确认的不表现有肝癌病理特征的肝脏组织样本，例如实体瘤癌旁样本。
其中，为了进一步增强qRT-PCR的准确性，可以使用内参引物，所述内参引物可以包括能够特异性地检测RNU6的引物和/或能够特异性地检测GAPDH的引物，其中，RNU6是指U6RNA，GAPDH是指甘油醛-3-磷酸脱氢酶。其中，特异性地检测RNU6的引物可以包括序列为SEQ ID NO.5的第三正向引物和序列为SEQ ID NO.6的第三反向引物，所述能够特异性地检测细胞周期蛋白D1的检测物包括序列为SEQ ID NO.7的第四正向引物和序列为SEQ IDNO.8的第四反向引物。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。
制备实施例1
在符合伦理和法律的规定标准下，采集130例自体配对的肝癌肝脏组织样本和癌旁正常组织样本，将这些样本用液氮保存待用。这些样本的临床基本情况如表1所示。
表1
年龄 样本数 肿瘤严重程度 样本数
≤50 72 G1 31
>50 58 G2 76
G3 23
性别 样本数
男 96 肿瘤生长特点 样本数
女 34 小梁型 101
非小梁型 29
血清甲胎蛋白 样本数
阳性 72 肝硬化
阴性 58 是 86
否 44
肿瘤分期 样本数
T1 23 并发肝病 样本数
T2 40 酒精肝 25
T3 52 HBV感染 49
T4 15 HCV感染 35
未知肝病 21
实施例1
使用购自天根生化科技有限公司的miRNA提取试剂盒(商品号DP501)对制备实施例1中的130例自体配对的肝癌肝脏组织样本和癌旁正常组织样本进行miRNA提取，得到它们各自的RNA样本。然后使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒(商品号KR201)对上述RNA样本进行加尾法逆转录，得到miRNA cDNA样本。接着使用miRNA荧光定量检测试剂盒(商品号FP401)以及如表2所示的引物对上述miRNA cDNA样本进行加尾法qRT-PCR扩增，将RNU6和GAPDH进行qRT-PCR的定量检测，检测结果如表3所示。
表2
表3
表3中，miR-19a低表达是指肝癌肝脏组织样本中的miR-19a的表达量下降为癌旁正常组织样本中的miR-19a的表达量的二分之一以下，Cyclin D1高表达是指肝癌肝脏组织样本中的Cyclin D1的表达量上升为癌旁正常组织样本中的Cyclin D1的表达量的二倍以上。miR-19a低表达、Cyclin D1高表达、miR-19a低表达且Cyclin D1高表达中的数值为出现的样本例数，括号内为所占百分比，P是指进行卡方统计检验得到的概率，P值越接近0，则表明在癌旁正常组织和肝癌肝脏组织样本之间的差异在统计上越显著，NS表示完全不显著。根据表3的数据可见，在肿瘤分期的检测中，同时使用miR-19a和Cyclin D1进行检测的P值为0.006，低于单独使用miR-19a和单独使用Cyclin D1的P值，由此说明同时使用miR-19a和Cyclin D1对肝癌进行检测能够将检测肝癌的病理学分期的准确率显著地提高。
对上述130例病例进行随访，结合miR-19a和Cyclin D1的检测结果，进行五年总体生存分析和五年无病生存分析，结果如图1、图2和表4所示。
表4
表4中，HR表示风险比值，95％CI表示95％置信区间，P值是指进行生存分析统计检验得到的概率，P值越接近0，则表明生存分析在统计上越可信。
根据图1、图2和表4的结果可见，在五年总体生存分析和五年无病生存分析的检测中，同时使用miR-19a和Cyclin D1进行检测的P值为0.002和0.003，低于单独使用miR-19a和单独使用Cyclin D1的P值，由此说明同时使用miR-19a和Cyclin D1对肝癌进行检测能够将检测肝癌的不良预后的准确率显著地提高。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (1)

1.一种分子标记检测物在制备检测肝癌的试剂盒中的用途，其中，所述分子标记检测物为特异性地针对miR-19a进行加尾法qRT-PCR检测或茎环法qRT-PCR检测的引物以及特异性地针对细胞周期蛋白D1进行qRT-PCR检测的引物；
所述特异性地针对miR-19a进行加尾法qRT-PCR检测的引物包括序列为SEQ ID NO.1的第一正向引物和序列为SEQ ID NO.2的第一反向引物，所述特异性地针对细胞周期蛋白D1进行qRT-PCR检测的引物包括序列为SEQ ID NO.3的第二正向引物和序列为SEQ ID NO.4的第二反向引物；
其中，所述检测肝癌的试剂盒为检测肝癌的病理学分期和检测肝癌的不良预后的试剂盒。
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