CN101709324A - 一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法及其配用的试剂盒和其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种定标测定腺苷脱氨酶的方法、配用的试剂盒和其用途，本发明用腺苷脱氨酶脱脱氢酶法检测试剂盒确定腺苷脱氨酶标准品的活性，再应用Trinder氏法以标准品的活性为参照，定量测定生物样本中腺苷脱氨酶的活性。本发明优点在于解决了Trinder氏法的缺陷，提高了精确度，减少了仪器误差以及增强了腺苷脱氨酶正常参考范围数据的可比性且通过测定腺苷脱氨酶的活性用于判断急性肝损伤及残留病变、协助诊断慢性肝病和肝纤维的诊断、黄疸的鉴别、结核性胸腹水诊断、中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断以及伤寒引发的高热诊断等，适合在医院中进行推广使用。
Description
技术领域
本发明属于医学检验测定技术领域，具体涉及一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法及其配用的试剂盒和其用途。
背景技术
现有技术中用Trinder氏法定量测定腺苷脱氨酶活性在临床化学检验上较为普遍，但是，Trinder氏法缺点在于没能使用一种公认的标准法测定的腺苷脱氨酶标准品，从而造成测试精确度下降、不同实验室应用不同生化分析仪引起的仪器误差，此外还是腺苷脱氨酶正常参考范围数据混乱、不可比拟性的主要原因。
腺苷脱氨酶脱氢酶法应用腺苷脱氨酶解腺嘌呤核苷酸生成次黄嘌呤核苷和氨，氨和α-酮戊二酸以及还原性辅酶在谷氨酸脱脱氢酶的作用下反应生成谷氨酸及辅酶，在340nm处检测NADH的消耗速率来测定腺苷脱氨酶活性通过制定氨标准曲线，可定量腺苷脱氨酶活性，腺苷脱氨酶活性定义为在腺苷脱氨酶脱氢酶法条件下37℃每分钟产生一个μmol氨所需腺苷脱氨酶的量，其原理反应方程式如下：
但是腺苷脱氨酶脱氢酶法可定量测定腺苷脱氨酶活性，但此法易受外源性氨的干扰，不适于临床生化检验。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，而提供一种在Trinder氏法中加入腺苷脱氨酶标准品，用腺苷脱氨酶脱氢酶法确定腺苷脱氨酶标准品的活性，再应用Trinder氏法以腺苷脱氨酶标准品的活性为参照，定量测定生物样本中腺苷脱氨酶活性，从而保证精确度高，测定速度快，且减少了仪器误差以及增强了腺苷脱氨酶正常参考范围数据的可比性的定标测定腺苷脱氨酶活性的方法。
本发明的另一个目的是提供用以实现定标测定腺苷脱氨酶活性的方法的配用的试剂盒。
本发明的第三个目的是用以实现定标测定腺苷脱氨酶活性的方法的配用的试剂盒的用途，以提供腺苷脱氨酶的活性测定用于急性肝损伤及残留病变的诊断以及协助慢性肝病及肝纤维化的诊断。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是：包括以下步骤：
步骤一是确定腺苷脱氨酶标准品的活性；
步骤二是再通过腺苷脱氨酶、嘌呤核苷酸化酶、黄嘌呤氧化酶及过氧化物酶酶解生成醌化合物；
步骤三是以连续监测醌化合物在546nm处吸光度的上升速率结合标准品的活性为参照，定量测定生物样本中腺苷脱氨酶的活性。
采取的措施还包括：
在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的步骤一中具体操作为将腺苷脱氨酶样本与试剂RI同时加入，并孵育180秒，然后加入试剂RII，再孵育420秒加入试剂RIII，在340nm处定量测定吸光度，并用不同浓度氨代替底物腺苷，按上述方法在340nm处用测试仪定量测定吸光度，以此画出标准曲线，有腺苷脱氨酶标准品的吸光度从标准曲线上求出对应的氨浓度，并将其除以反应时间既得出腺苷脱氨酶标准品活性。
在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的试剂RI包括0.015mol/L的a-酮戊二酸、0.30×10-3mol/L的还原型辅酶I二钠盐、1.50×10-3mol/L的腺嘌呤核苷二磷酸单钠盐以及0.10mol/L的且pH值为7.20的磷酸缓冲液，所述的试剂RII为200U/ml的谷氨酸脱脱氢酶，所述的试剂RIII包括1.20×10-2mol/L的腺苷，2.00×10-5mol/L的乙二胺四乙酸二钠，其中所述的试剂RII和试剂RIII均用pH7.20磷酸缓冲液配置。
在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的腺苷脱氨酶样本为10μL，试剂I为200μL，试剂II为20μL，试剂III为50μL，腺苷脱氨酶样本与试剂I同时加入，在第180秒加入试剂II，在第420秒加入试剂III，且温度反应温度控制37℃。
在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的波长的主波长为340nm，副波长为430nm。
在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的步骤三中的计算按以下公式进行计算：
测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)，
ΔA1/min代表测试时间第1min吸光度变化率
ΔA2/min代表测试时间第2min吸光度变化率
………………………………………
ΔAt/min代表测试时间第tmin吸光度变化率
t为测试时间
样本腺苷脱氨酶活性＝(ΔAX/ΔC)×Ec
其中：ΔAX＝样本ΔA/min
ΔAC＝标准品ΔA/min
Ec＝腺苷脱氨酶标准品的活性。
一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法配用的试剂盒，所述的试剂盒由以下成分组成：包括试剂R1、试剂R2、腺苷脱氨酶标准品、腺苷脱氨酶异常血清以及700测试/盒，所述的试剂R1包括80mol/L的甘氨酸缓冲液、2mol/L的N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、0.5KU/L的嘌呤核苷磷酸化酶、0.8KU/L的黄嘌呤氧化酶以及0.6KU/L的过氧化物酶，所述的试剂R2包括10mol/L的腺嘌呤核苷、2mol/L的4-氨基安替比林以及50mol/L且pH值为4.0的Tris-HCL缓冲液，所述的腺苷脱氨酶标准品为人源基因重组蛋白，腺苷脱氨酶异常血清为人源基因重组蛋白和人血清。
在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法配用的试剂盒中，所述的试剂盒包含试剂R1为130ml，试剂R2为70ml，腺苷脱氨酶标准品2ml/1瓶，腺苷脱氨酶异常血清1ml/1瓶。
一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法配用的试剂盒的用途，该测定用于判断急性肝损伤及残留病变、协助诊断慢性肝病和肝纤维的诊断、黄疸的鉴别、结核性胸腹水诊断、中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断以及伤寒引发的高热诊断。
在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法配用的试剂盒的用途中，所依据的原理反应方程式如下：
与现有技术相比，本发明的优点在于用腺苷脱氨酶脱氢酶法确定腺苷脱氨酶标准品的活性，再应用Trinder氏法以腺苷脱氨酶标准品的活性为参照，定量测定生物样本中腺苷脱氨酶活性，本发明解决了Trinder氏法的缺陷，提高了测试精确度、减少了仪器误差和增强了腺苷脱氨酶正常参考范围数据的可比性，也方便了通过测定腺苷脱氨酶的活性用于判断急性肝损伤及残留病变、协助诊断慢性肝病和肝纤维的诊断、黄疸的鉴别、结核性胸腹水诊断、中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断以及伤寒引发的高热诊断等，适合在医院中进行推广使用。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
1、腺苷脱氨酶标准品和其活性的确定
(1)腺苷脱氨酶标准品活性0-150U/L人源基因重组腺苷脱氨酶
(2)腺苷脱氨酶标准品活性的确定
试剂组成：
试剂RI：包括0.015mol/L的a-酮戊二酸、0.30×10-3mol/L的还原型辅酶I二钠盐、1.50×10-3mol/L的腺嘌呤核苷二磷酸单钠盐以及0.10mol/L的且pH值为7.20的磷酸缓冲液；
试剂RII：为200U/ml的谷氨酸脱脱氢酶；
试剂RIII：包括1.20×10-2mol/L的腺苷，2.00×10-5mol/L的乙二胺四乙酸二钠，其中试剂RII和试剂RIII均用pH7.20磷酸缓冲液配置。
试验参数及操作步骤：
样本10μL，试剂I200μL，试剂II20μL，试剂III50μL；
样本与试剂同时加入，第180S加入试剂II，第420S加入试剂III；
反应温度37℃
空白时间：开始第240秒，结束第360秒
反应时间：开始第540秒，结束第660秒
波长：主波长340nm副波长430nm
测试仪：贝克曼CX7全自动生化分析仪
腺苷脱氨酶活性(U/L)定义为在腺苷脱氨酶脱氢酶法条件下37℃每分钟产生一个μmol氨所需腺苷脱氨酶的量，参照腺苷脱氨酶脱氢酶法，具体操作为将10μL的腺苷脱氨酶样本与200μL的试剂RI同时加入，并孵育180秒，然后加入20μL的试剂RII，再孵育420秒加入50μL的试剂RIII，在340nm处定量测定吸光度，并用不同浓度氨代替底物腺苷，按上述方法在340nm处用测试仪定量测定吸光度，以此画出标准曲线，有腺苷脱氨酶标准品的吸光度从标准曲线上求出对应的氨浓度，并将其除以反应时间既得出腺苷脱氨酶标准品活性(U/L)。
一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法配用的试剂盒，试剂盒由以下成分组成：包括试剂R1130ml、试剂R270ml、腺苷脱氨酶标准品2ml/1瓶、腺苷脱氨酶异常血清1ml/1瓶以及700测试/盒，
试剂R1：包括80mol/L的甘氨酸缓冲液、2mol/L的N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、0.5KU/L的嘌呤核苷磷酸化酶、0.8KU/L的黄嘌呤氧化酶以及0.6KU/L的过氧化物酶；
试剂R2：包括10mol/L的腺嘌呤核苷、2mol/L的4-氨基安替比林以及50mol/L且pH值为4.0的Tris-HCL缓冲液；
腺苷脱氨酶标准品：人源基因重组蛋白；
腺苷脱氨酶异常血清：人源基因重组蛋白和人血清。
试剂配置：
腺苷脱氨酶试剂为液体试剂，可直接上机使用。
腺苷脱氨酶标准品和腺苷脱氨酶质控血清是冻干品，需要用一定蒸馏水溶解方可使用。
试剂的稳定与贮存期
试剂30℃下可避光保存一周，室温18～19℃下一月，2～8℃一年，严禁冷冻。溶化后的腺苷脱氨酶质控血清30℃下可至少保存二周，2～8℃或冷冻保存期更长。
试验参数与操作步骤：
温度 37℃
波长 546nm
比色杯光径 1.0cm
测试方法 速率法
反应方向 正
予孵育 0.05ml样品+1.8mlR1(或依比例混匀)
予孵育时间 5分钟
启动反应 加0.9ml R2(或依比例混匀)
样品/试剂 1∶54
延迟时间 7分钟
测试时间 2分钟
空白参照 水
总反应时间 9分钟
测试仪 HITACHI 7100全自动生化分析仪
2、样本腺苷脱氨酶活性的测定：
参照Trinder氏法用腺苷脱氨酶标准品的活性为参照，定量测定生物样本中的腺苷脱氨酶活性，应用腺苷脱氨酶偶联嘌呤核苷磷酸化酶，黄嘌呤氧化酶和过氧化物酶反应连续检测法，腺苷脱氨酶酶解腺苷脱氨产生次黄苷；再通过偶联嘌呤核苷磷酸化酶的作用，生成次黄嘌呤；后者在黄嘌呤氧化酶氧化下生成尿酸和过氧化氢，最后在过氧化物酶的作用下过氧化氢再与N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐以及4-氨基安替比林(4-AA)反应，生成紫红色的有色醌化合物，并通过动态测量有色醌546nm处吸光度上升的速度来测算腺苷脱氨酶的活性，一个单位腺苷脱氨酶活性(U/L)定义为在条件37℃下每分钟将1μmol腺嘌呤核苷酸酶解成为次黄嘌呤核苷，所依据的原理是：
(2.3)计算：
测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)，
ΔA1/min代表测试时间第1min吸光度变化率
ΔA2/min代表测试时间第2min吸光度变化率
………………………………………
ΔAt/min代表测试时间第tmin吸光度变化率
t为测试时间
样本腺苷脱氨酶活性＝(ΔAX/ΔAC)×Ec
其中：ΔAX＝样本ΔA/min
ΔAC＝标准品ΔA/min
Ec＝腺苷脱氨酶标准品的活性
注意事项：
1.试剂和样品用量可因仪器不同，按比例增减。
2.若样品腺苷脱氨酶＞150U/L，须用生理盐水稀释样品，结果乘以稀释倍数。
3.如保存不当，试剂发现有浑浊时，应弃用。
试剂性能：
线性范围：0～150U/L，(r2＞0.995)
精密度：批内CV≤6.0％；批间CV≤10.0％；
特异性：血清、30mg/d胆红素、200mg/dl血红蛋白、500mg/dl甘油三酯和4mg/dl抗坏血酸对本法无干扰。
参考值：
正常人血清腺苷脱氨酶活性参考值范围在0～15U/L，根据自身实验条件自行订定正常人血清腺苷脱氨酶活性范围。
依据上面的原理，一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法配用的试剂盒的用途是对腺苷脱氨酶活性的测定，腺苷脱氨酶将腺苷脱氨产生次黄苷和氨，腺苷脱氨酶广泛存在人体各组织中，尤以小肠、肝、脾最多，血液细胞内酶活性为血清中的40~70陪，故测定时应避免溶血。血清腺苷脱氨酶的正常参考值为0～15U/L。腺苷脱氨酶异常增高见于：
1、肝脏病-腺苷脱氨酶活性是反映肝损伤的敏感指标，可作为肝功能常规检查项目之一与ALT或GGT等组成肝酶谱能较全面地反映肝脏病的酶学改变。血清中腺苷脱氨酶活性的测定可：
1.1用于判断急性肝损伤及残留病变：急性黄疸性肝炎，干细胞出现损伤，在黄疸尚未出现前，可见增高。因腺苷脱氨酶分子量较ALT小，当肝细胞轻度受损时腺苷脱氨酶比ALT先释入血内。腺苷脱氨酶在反应急性肝病的残存病变时优于ALT。
1.2协助诊断慢性肝病和有助于肝纤维的诊断：慢性肝炎活动期，慢性迁延性肝炎和肝硬化腺苷脱氨酶身高明显。腺苷脱氨酶在反应慢性肝损伤时优于ALT.慢性肝病，尤其是肝硬变时腺苷脱氨酶阳性率高达90％，其酶活性以肝硬变＞慢性肝炎，并随肝纤维化程度增加而递增，失代偿期肝硬变腺苷脱氨酶活性明显高于代偿期肝硬变。
1.3有助于黄疸的鉴别：溶血性黄疸，肝细胞性黄疸腺苷脱氨酶升高。但阻塞性黄疸时腺苷脱氨酶升高不明显，因此在判断黄疸性质时有一定的鉴别价值。
2、结核性胸腹水-结核性胸水中腺苷脱氨酶活性明显高于其他原因引起的胸水，因此可测定胸水中的腺苷脱氨酶来进行鉴别诊断。
3、伤寒-由伤寒引发高热血清腺苷脱氨酶活性显著升高。而高烧有及他原因造成腺苷脱氨酶却不增高。
4、脑膜炎-脑脊液腺苷脱氨酶检测可作为中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断的重要指标，结核性脑膜炎腺苷脱氨酶活性显著增高，病毒性脑炎不增高。
本发明的优点在于用腺苷脱氨酶脱氢酶法确定腺苷脱氨酶标准品的活性，再应用Trinder氏法以腺苷脱氨酶标准品的活性为参照，定量测定生物样本中腺苷脱氨酶活性，本发明解决了Trinder氏法的缺陷，提高了测试精确度、减少了仪器误差和增强了腺苷脱氨酶正常参考范围数据的可比性，也方便了通过测定腺苷脱氨酶的活性用于判断急性肝损伤及残留病变、协助诊断慢性肝病和肝纤维的诊断、黄疸的鉴别、结核性胸腹水诊断、中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断以及伤寒引发的高热诊断等，适合在医院中进行推广使用。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神所定义的范围。
Claims (10)
1.一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是：包括以下步骤：
步骤一是确定腺苷脱氨酶标准品的活性；
步骤二是再通过腺苷脱氨酶、嘌呤核苷酸化酶、黄嘌呤氧化酶及过氧化物酶酶解生成醌化合物；
步骤三是以连续监测醌化合物在546nm处吸光度的上升速率结合标准品的活性为参照，定量测定生物样本中腺苷脱氨酶的活性。
2.根据权利要求1所述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是：所述的步骤一中具体操作为将腺苷脱氨酶样本与试剂RI同时加入，并孵育180秒，然后加入试剂RII，再孵育420秒加入试剂RIII，在340nm处定量测定吸光度，并用不同浓度氨代替底物腺苷，按上述方法在340nm处用测试仪定量测定吸光度，以此画出标准曲线，有腺苷脱氨酶标准品的吸光度从标准曲线上求出对应的氨浓度，并将其除以反应时间既得出腺苷脱氨酶标准品活性。
3.根据权利要求2所述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是：所述的试剂RI包括0.015mol/L的a-酮戊二酸、0.30×10-3mol/L的还原型辅酶I二钠盐、1.50×10-3mol/L的腺嘌呤核苷二磷酸单钠盐以及0.10mol/L的且pH值为7.20的磷酸缓冲液，所述的试剂RII为200U/ml的谷氨酸脱脱氢酶，所述的试剂RIII包括1.20×10-2mol/L的腺苷，2.00×10-5mol/L的乙二胺四乙酸二钠，其中所述的试剂RII和试剂RIII均用pH7.20磷酸缓冲液配置。
4.根据权利要求3所述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是：所述的腺苷脱氨酶样本为10μL，试剂I为200μL，试剂II为20μL，试剂III为50μL，腺苷脱氨酶样本与试剂I同时加入，在第180秒加入试剂II，在第420秒加入试剂III，且温度反应温度控制37℃。
5.根据权利要求4所述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是：所述的波长的主波长为340nm，副波长为430nm。
6.根据权利要求5所述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是：所述的步骤三中的计算按以下公式进行计算：
测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)，
ΔA1/min代表测试时间第1min吸光度变化率
ΔA2/min代表测试时间第2min吸光度变化率
.............................................
ΔAt/min代表测试时间第tmin吸光度变化率
t为测试时间
样本腺苷脱氨酶活性＝(ΔAX/ΔAC)×Ec
其中：ΔAX＝样本ΔA/min
ΔAC＝标准品ΔA/min
Ec＝腺苷脱氨酶标准品的活性。
7.一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法配用的试剂盒，其特征是：所述的试剂盒由以下成分组成：包括试剂R1、试剂R2、腺苷脱氨酶标准品、腺苷脱氨酶异常血清以及700测试/盒，所述的试剂R1包括80mol/L的甘氨酸缓冲液、2mol/L的N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、0.5KU/L的嘌呤核苷磷酸化酶、0.8KU/L的黄嘌呤氧化酶以及0.6KU/L的过氧化物酶，所述的试剂R2包括10mol/L的腺嘌呤核苷、2mol/L的4-氨基安替比林以及50mol/L且pH值为4.0的Tris-HCL缓冲液，所述的腺苷脱氨酶标准品为人源基因重组蛋白，腺苷脱氨酶异常血清为人源基因重组蛋白和人血清。
8.根据权利要求7所述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法配用的试剂盒，其特征是：所述的试剂盒包含试剂R1为130ml，试剂R2为70ml，腺苷脱氨酶标准品2ml/l瓶，腺苷脱氨酶异常血清1ml/l瓶。
9.一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法配用的试剂盒的用途，其特征是：该测定用于判断急性肝损伤及残留病变、协助诊断慢性肝病和肝纤维的诊断、黄疸的鉴别、结核性胸腹水诊断、中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断以及伤寒引发的高热诊断。
10.根据权利要求7所述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法配用的试剂盒的用途，其特征是：所依据的原理反应方程式如下：
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: NINGBO REE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: ZHANG WEN Effective date: 20110915 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20110915 Address after: Jiangbei District, Ningbo City Hing Yonglu 315021 No. 88 Ningbo Ruiyuan Biological Technology Co. Ltd. Applicant after: Ningbo Rui Bio-technology Co., Ltd. Address before: Jiangbei District in Zhejiang province 315021 Hing Ningbo Yonglu No. 88 Ningbo Ruiyuan Biological Technology Co. Ltd. Applicant before: Zhang Wen |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20100519 |