CN107653298A - 腺苷脱氨酶测定试剂盒 - Google Patents

腺苷脱氨酶测定试剂盒 Download PDF

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林耀文
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Abstract

本发明属于医学及生物化学技术领域，具体是一种腺苷脱氨酶检测试剂盒。该试剂盒由试剂R1和试剂R2组成，试剂R1包括：生物缓冲剂、防腐剂、过氧化物酶、4‑氨基安替比林、嘌呤核甘磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶和水；试剂R2包括：生物缓冲剂、防腐剂、腺苷、N‑乙基‑N‑(2‑羟基‑3‑磺丙基)‑3‑甲基苯胺和水。该腺苷脱氨酶检测剂盒采用连续监测法来进行测定，主波长为550nm，具有快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好等优点。

Description

腺苷脱氨酶测定试剂盒
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体是一种测定腺苷脱氨酶的试剂盒。
背景技术
腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)是嘌呤核苷代谢中重要的酶类，是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶。其活性是反映肝损伤的敏感指标，可作为肝功能常规检查项目之一，与ALT或GGT等组成肝酶谱能较全面地反映肝脏病的酶学改变。血清中的ADA活性测定可用于：判断急性肝损伤及残留病变；协助诊断慢性肝病；有助于肝纤维的诊断；有助于黄疸的鉴别。此外，ADA活性缺乏与重症联合免疫缺陷病 (SCID)有关，作为核酸代谢重要的酶类，ADA缺乏可导致核酸代谢障碍，影响到胸腺的发育，从而引起免疫功能缺陷。脑脊液ADA检测可作为中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断的重要指标。ADA在良恶性难辨的渗出液鉴别诊断上也具有重要价值。因此，测定血液、体液中的ADA及其同工酶水平对这些疾病的鉴别、诊断、治疗及免疫功能的研究日趋受到临床重视。
近十几年来，随着对ADA的深入研究，检测方法也不断发展。目前比色法已发展了五代。
第一代ADA测试：ADA将腺苷(Adenosine)脱氨产生次黄苷(Inosine)和氨(NH3)。通过动态测量腺苷265nm处吸光度下降的速度，测算ADA的活性大小。但是该法高底物浓度造成吸光度过高，仅适用于腺苷浓度低于40.00μmol/L。如此低的底物浓度达不到底物饱和要求，造成ADA活性检测失真。因此，该法不适用于临床应用。
第二代ADA测试：原理为腺苷脱氨酶催化腺嘌呤核苷水解，产生次黄嘌呤核苷和氨。然后用Berthelot显色反应测定反应过程中产生氨的量，从而计算血清ADA活性单位。该法所需试剂易配制，仪器简单，但灵敏度低，易受外源性NH3影响，空白过高，不能直接测定红细胞ADA活性。
基于同样的原因，ADA偶联谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase，GLDH)反应通过测量340nm处NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reducedform，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，还原型辅酶II)吸光度下降的速度来计算ADA 活性。该法也因血清含氨干扰，以及测试系统中过高的NADPH造成非特异性氧化，而不能准确计算ADA活性。
第三代ADA测试：通过ADA偶联嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleosidephosphorylase，PNP)和黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XOD)反应连续监测法。通过测量293nm处尿酸盐吸光度上升的速度来测算ADA活性。但是，293nm时血清吸光度太高，造成临床应用不便。
第四代ADA测试：通过ADA偶联PNP，XOD，过氧化氢酶(Catalase)和醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase)，借助过氧化氢(H2O2)反应测量334nm处NADPH吸光度上升的速率来测算ADA活性。该法克服了以往ADA测试的困难，但是，该法剂成本高，阻碍实际临床使用。
第五代ADA测试：ADA酶解腺苷(Adenosine)脱氨产生次黄苷(Inosine)；再通过PNP的作用，生成次黄嘌呤(Hypoxanthine)；后者在XOD氧化下生成尿酸(Uric Acid) 和过氧化氢(H2O2)；最后在过氧化物酶(Peroxidase，POD)的作用下H2O2再与N-乙基 -N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(EHSPT)、4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine， 4-AAP)反应，生成紫红色的有色醌(Ouinone dye)。通过动态测量有色醌550nm处吸光度上升的速度来测算ADA的活性。其原理反应方程式如下：
从反应原理可知NH4 +对该法无显著影响。反应具有较强的抗干扰能力，目前医院主要应用基于第五代ADA测试原理的检测试剂进行血清等标本中ADA活性的测定，具有方便、快速的优点。
虽然目前基于上述第五代的ADA检测方法及试剂已在临床得到一定应用，但仍存在以下缺点：
检测ADA的灵敏度不足，血清中ADA的含量较少，文献报道正常人群血清ADA参考值大多在4-20U/L之间，癌症病人及缺铁性贫血患者血清中的ADA活性显著降低，因此样品中低值ADA活性的准确定量不容忽视。目前已有的ADA检测试剂盒难以对低值ADA 活性进行准确定量。虽然一些高灵敏度的检测方法如分子荧光分析法可以用于痕量物质的检测，但在ADA活性检测方法学上的应用尚未展开，且不具有临床实用性。
另一方面，该类试剂盒开启后在2-8℃保存的稳定性较差，一般仅能稳定保存4周，其中主要原因有：4-氨基安替比林容易被氧化，从而使得显色能力减退；试剂盒中有多种酶，酶类的稳定性易受到影响。该类试剂盒稳定性较差降低了其在临床上的实用性。
因此，有必要开发一种同时具有高灵敏度和宽线性范围且具有较强稳定性的腺苷脱氨酶检测剂盒。
发明内容
针对现有腺苷脱氨酶检测剂盒在测试过程中存在的上述缺陷，本发明提供一种快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好、液体双试剂操作简便适用于临床全自动生化分析的腺苷脱氨酶检测剂盒。
本发明涉及一种腺苷脱氨酶检测剂盒，包含试剂R1、试剂R2和校准品，其中试剂R1包含生物缓冲剂、防腐剂、过氧化物酶、4-氨基安替比林、嘌呤核甘磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶和水；；试剂R2包含生物缓冲剂、防腐剂、腺苷、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺和水；校准品为腺苷脱氨酶冻干品，临用前用生理盐水溶解后使用。
其中，所述的生物缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷、MES、磷酸盐、MOPSO中的一种或几种；所述的防腐剂选自叠氮化钠或硫柳汞中的一种或几种。
优选地，每1升试剂R1中各组分的用量为：生物缓冲剂5-100g，防腐剂0.2-10g，过氧化物酶200-800U，4-氨基安替比林0.5-5mmol，嘌呤核甘磷酸化酶50-200U，黄嘌呤氧化酶100-500U；每1升试剂R2中各组分的用量为：生物缓冲剂5-100g，防腐剂0.2-10g，腺苷5-20mmol，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺0.5-5mmol。
在一个具体的实施方案中，每1升试剂R1中各组分的用量为：三羟甲基氨基甲烷6.057g，叠氮钠1g，过氧化物酶600U，4-氨基安替比林2mmol，嘌呤核甘磷酸化酶100U，黄嘌呤氧化酶200U；每1升试剂R2中各组分的用量为：三羟甲基氨基甲烷6.057g，叠氮钠1g，腺苷10mmol，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺2mmol。
优选地，试剂R2中还同时包含曲拉通X-100和Span-60。
在一个优选的实施方案中，试剂R2中曲拉通X-100的用量为0.2％，Span-60的用量为0.2％。
优选地，试剂R1中还有聚六亚甲基胍和乙二醇，试剂R2中还有聚六亚甲基胍。
在一个优选的实施方案中，试剂R1中聚六亚甲基胍的用量为0.5％，乙二醇的用量为6％，试剂R2中聚六亚甲基胍的用量为0.5g/l。
本发明还提供了试剂盒的使用方法：
本试剂盒适用于杜邦AR、日立7080/7170/7600/7180、迈瑞BS320、迪瑞CS600、东芝TBA40FR、贝克曼AU680、罗氏C501等全自动生化分析仪。
使用时，检测主波长为550nm，次波长为800nm，测定方法为：180μl试剂R1加入5μl样本，于37℃温育1.5-3min后加入90μl试剂R2，2min后开始读数，计算吸光度变化率，监测区间为3min。
优选地，检测参考区间是基于中国人群建立的，对健康个体进行检测，通过正态分布法进行统计，得出参考范围为4-20U/L。本发明检测方法的检测参考区间基于中国人群建立，对中国人群有更好的适应性。
具体而言，本发明的发明构思是：
(1)通过试剂盒中各种试剂的比例进行研发和优化，本发明的试剂盒具有较宽的线性检测范围0-320U/L。
(2)通过考察烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚、Brij聚氧乙烯月桂基醚系列、Span失水山梨醇高级脂肪酸系列、Tween失水山梨醇聚氧乙烯系列、曲拉通X-100、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚等不同类型非离子型表面活性剂对测定体系的影响，本发明发现，通过向试剂中同时加入曲拉通X-100和Span-60可使反应灵敏度显著增加，并显著改善了PNP、XOD、POD等酶的稳定性。
(3)通过向试剂R1中添加聚六亚甲基胍和乙二醇，同时向试剂R2中添加聚六亚甲基胍，意料不到地使该试剂盒的稳定性显著提高。
综上所述，本发明与现有技术相比，具有如下优点。
(1)本发明通过优化试剂盒中各试剂的配比，本发明的试剂盒具有较宽的线性检测范围0-320U/L，显著优于现有技术。
(2)本发明通过向试剂R2中同时加入曲拉通X-100和Span-60，使得试剂盒的灵敏度显著增加，并显著改善了PNP、XOD、POD等酶的稳定性。
(3)本发明通过向试剂R1中添加聚六亚甲基胍和乙二醇，同时向试剂R2中添加聚六亚甲基胍，意料不到地使该试剂盒的稳定性显著提高，增加了本发明试剂盒用于临床诊断的实用性。
附图说明
图1本发明腺苷脱氨酶检测试剂盒的稳定性；
现结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明的试剂盒中所用主要试剂
测试条件与方法
仪器：日立7080全自动生化分析仪
参数：
主波长 550nm 样品(S) 5μL
次波长 800nm 试剂1(R1) 180μL
反应温度 37℃ 试剂2(R2) 90μL
反应方向 升反应 反应类型 速率法
操作步骤：
实施例1
试剂R1：pH7.4
三羟甲基氨基甲烷 6.057g
叠氮钠 1g
过氧化物酶 600U
4-氨基安替比林 2mmol
嘌呤核甘磷酸化酶 100U
黄嘌呤氧化酶 200U
试剂R2：pH7.4
三羟甲基氨基甲烷 6.057g
叠氮钠 1g
腺苷 10mmol
N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺 2mmol
校准品：
腺苷脱氨酶冻干品，临用前用生理盐水溶解后使用，分别稀释为终浓度20U/L，40U/L，80U/L，160U/L，240U/L，320U/L，
实施例2
试剂R1：pH7.4
三羟甲基氨基甲烷 6.057g
叠氮钠 1g
过氧化物酶 600U
4-氨基安替比林 2mmol
嘌呤核甘磷酸化酶 100U
黄嘌呤氧化酶 200U
试剂R2：pH7.4
三羟甲基氨基甲烷 6.057g
叠氮钠 1g
腺苷 10mmol
N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺 2mmol
曲拉通X-100 0.2％
Span-60 0.2％
校准品：
腺苷脱氨酶冻干品，临用前用生理盐水溶解后使用，分别稀释为终浓度20U/L，40U/L，80U/L，160U/L，240U/L，320U/L，
实施例3
试剂R1：pH7.4
三羟甲基氨基甲烷 6.057g
叠氮钠 1g
过氧化物酶 600U
4-氨基安替比林 2mmol
嘌呤核甘磷酸化酶 100U
黄嘌呤氧化酶 200U
聚六亚甲基胍 0.5g/l
乙二醇 6％
试剂R2：pH7.4
三羟甲基氨基甲烷 6.057g
叠氮钠 1g
腺苷 10mmol
N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺 2mmol
曲拉通X-100 0.2％
Span-60 0.2％
聚六亚甲基胍 0.5g/l
校准品：
腺苷脱氨酶冻干品，临用前用生理盐水溶解后使用，分别稀释为终浓度20U/L，40U/L，80U/L，160U/L，240U/L，320U/L，
实施例4
试剂R1：pH7.4
三羟甲基氨基甲烷 6.057g
叠氮钠 1g
过氧化物酶 600U
4-氨基安替比林 2mmol
嘌呤核甘磷酸化酶 100U
黄嘌呤氧化酶 200U
聚六亚甲基胍 0.5g/l
试剂R2：pH7.4
三羟甲基氨基甲烷 6.057g
叠氮钠 1g
腺苷 10mmol
N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺 2mmol
曲拉通X-100 0.2％
Span-60 0.2％
聚六亚甲基胍 0.5g/l
校准品：
腺苷脱氨酶冻干品，临用前用生理盐水溶解后使用，分别稀释为终浓度20U/L，40U/L，80U/L，160U/L，240U/L，320U/L，
实施例5腺苷脱氨酶试剂盒标准曲线
采用标准品，选择7点校准，腺苷脱氨酶含量分别为0、20、40、80、160、240、 320U/L，以实施例3的试剂盒为例，按照上述步骤测定腺苷脱氨酶试剂盒的校准曲线，得实施例3的试剂盒的线性范围为0-320U/L(R2≥0.999)。在该数值范围(0-320U/L) 内，实施例1、2、4的试剂盒也表现出良好的线性
实施例6灵敏度
测定空白液和3个不同腺苷脱氨酶浓度含量样品，每个样品测10次，计算平均值(M)和标准差(SD)，以样品吸光度-3SD大于空白吸光度+3SD的样品浓度作为腺苷脱氨酶检测试剂盒的最低检测灵敏度。
在实施例1的试剂盒基础上，向试剂R2分别添加烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚、Brij聚氧乙烯月桂基醚系列、Span失水山梨醇高级脂肪酸系列、Tween失水山梨醇聚氧乙烯系列、曲拉通X-100、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚等不同类型非离子型表面活性剂，来测试非离子型表面活性剂对测定体系的影响。在实验过程中不仅对单独添加各非离子型表面活性剂进行了实验，针对有潜力提高试剂盒灵敏度的添加剂，还做了梯度浓度的实验，并做了两种添加剂相组合的实验，因实验数据量巨大且大多数添加剂都没实现提高试剂盒灵敏度的结果，因此选部分实验结果如下表所示。
所用非离子型表面活性剂添加剂分别为聚乙二醇单烷基醚(Sigma，CAS： 9043-30-5)，曲拉通X-100(FARCO，CAS：9002-93-1)，月桂醇聚醚-4(Sigma，CAS： 68439-50-9)，Brij-O20(Sigma，CAS：9004-98-2)，Brij-30(Sigma，CAS：9002-92-0)， Brij-58(Sigma，CAS：9004-95-9)，Span-20(Sigma，CAS：1338-39-2)，Span-80(Sigma， CAS：1338-43-8)，Span-60(Sigma，CAS：1338-41-6)，Tween-20(Sigma，CAS： 9005-64-5)，Tween-60(Sigma，CAS：9005-67-8)，Tween-80(Sigma，CAS：9005-65-6)。
由上表结果可知，在实施例1的试剂盒的基础上，在试剂R2中同时添加曲拉通 X-100和Span-60可显著提高试剂盒的灵敏度至0.5U/L。对实施例3的试剂盒进行灵敏度检测，实施例3的试剂盒灵敏度也可达到0.5U/L。
实施例7稳定性
将实施例1、2、3、4的腺苷脱氨酶检测试剂盒试剂R1、R2置于2-8℃冷库中，分别在存放前、2-8℃冷库存放1个月、2个月和3个月后对校准品进行测定分析。由图1 可知，通过向试剂盒中同时添加聚六亚甲基胍和乙二醇，使得该试剂盒的稳定性显著提高，增加了本发明试剂盒用于临床诊断的实用性。
实施例8干扰实验
在正常人血清中各自添加一定量的抗坏血酸、胆红素、甘油三酯和血红蛋白，同时加入等体积的去离子水作为无干扰物血清，使用实施例1、2、3、4的腺苷脱氨酶检测试剂盒，同时测定这些样本的浓度。以干扰程度为5％为测定系统对干扰物的最高忍受限，血清中胆红素在90μM以下，甘油三酯在3.35mM以下，血红蛋白在5g/l以下，不影响测定结果。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种腺苷脱氨酶检测试剂盒，其特征在于：由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；所述试剂R1的组分包括：生物缓冲剂、防腐剂、过氧化物酶、4-氨基安替比林、嘌呤核甘磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶和水；所述试剂R2的组分包括：生物缓冲剂、防腐剂、腺苷、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺和水。
2.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的生物缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷、MES、磷酸盐、MOPSO中的一种或几种；所述的防腐剂为叠氮化钠或硫柳汞中的一种或几种。
3.按照权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂R1中各组分的用量为：生物缓冲剂5-100g，防腐剂0.2-10g，过氧化物酶200-800U，4-氨基安替比林0.5-5mmol，嘌呤核甘磷酸化酶50-200U，黄嘌呤氧化酶100-500U；每1升试剂R2中各组分的用量为：生物缓冲剂5-100g，防腐剂0.2-10g，腺苷5-20mmol，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺0.5-5mmol。
4.按照权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂R1中各组分的用量为：三羟甲基氨基甲烷6.057g，叠氮钠1g，过氧化物酶600U，4-氨基安替比林2mmol，嘌呤核甘磷酸化酶100U，黄嘌呤氧化酶200U；每1升试剂R2中各组分的用量为：三羟甲基氨基甲烷6.057g，叠氮钠1g，腺苷10mmol，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺2mmol。
5.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中还有曲拉通X-100和Span-60。
6.按照权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中曲拉通X-100的用量为0.2％，Span-60的用量为0.2％。
7.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中还有聚六亚甲基胍和乙二醇，所述试剂R2中还有聚六亚甲基胍。
8.按照权利要求1-6任何一项的检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和R2的pH值范围均为7.0-8.5。
9.按照权利要求1-6任何一项的检测试剂盒，其特征在于：其在使用时，检测主波长为550nm，次波长为800nm，测定方法为：180μl试剂R1加入5μl样本，于37℃温育1.5-3min后加入90μl试剂R2，2min后开始读数，计算吸光度变化率，检测区间为3min。
10.按照权利要求1-6任何一项的检测试剂盒在测定人血清里腺苷脱氨酶的含量中的应用。
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