CN109541238A - 直接胆红素测定方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种直接胆红素测定方法及试剂盒，其中直接胆红素测定方法是利用氧化酶和其底物反应生成过氧化氢，再使过氧化氢和过氧化物酶反应释放氧气，将溶液中的直接胆红素氧化成胆绿素，进而使得吸收峰在450nm处发生下降，记录下降程度计算得出直接胆红素含量。本发明采用价格便宜、易于获得且稳定性良好的能够产生过氧化氢的其他氧化酶及其底物替代直接胆红素氧化酶，相对于原直接胆红素氧化酶的测定方法，成本大大降低，且检测方法所得的实验数据证实其分析灵敏度、准确性和重复性俱佳，检测试剂的使用安全性高，对环境的污染小，具有较好的实用性。

Description

直接胆红素测定方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是指一种直接胆红素测定方法及试剂盒。
背景技术
直接胆红素(DBIL)又称结合胆红素，是由间接胆红素进入肝后受肝内葡萄糖醛酸基转移酶的作用与葡萄糖醛酸结合生成的。直接胆红素溶于水，与偶氮试剂呈直接反应，能通过肾随尿排出体外。肝脏对胆红素的代谢起着重要作用，包括肝细胞对血液中间接胆红素的摄取、结合和排泄三个过程。血清直接胆红素的升高，说明经肝细胞处理后胆红素从胆道的排泄发生障碍。直接胆红素的测定有助于黄疸类型的诊断和鉴别诊断。直接胆红素增高：主要见于阻塞性黄疸、肝细胞性黄疸、肝癌、胰头癌、胆石症、胆管癌等。
常见的直接胆红素检测方法有重氮法、钒酸氧化法、氧化酶法等。这四种方法各存在优缺点，其中，氧化酶法具有较好的线性和重复性，抗干扰能力强，是比较理想的检测方法，但由于直接胆红素氧化酶价格昂贵，成本较高，试剂盒价格贵，不利于大规模应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、稳定性好、分析灵敏度高，准确度高的直接胆红素测定方法及试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供的直接胆红素测定方法，是利用氧化酶和其底物反应生成过氧化氢，再使过氧化氢和过氧化物酶反应释放氧气，将溶液中的直接胆红素氧化成胆绿素，进而使得吸收峰在450nm处发生下降，记录下降程度计算得出直接胆红素含量。
上述方法中，所述氧化酶和其底物分别为葡萄糖氧化酶和葡萄糖，尿酸酶和尿酸，胆固醇氧化酶和胆固醇，肌氨酸氧化酶和肌氨酸，乳酸氧化酶和乳酸，酒精氧化酶和甲醇，抗坏血酸氧化酶和抗坏血酸，胆碱氧化酶和胆碱，丙酮酸氧化酶和丙酮酸。上述这些酶和底物可以单独或混合使用。除了上述这些，其他可以产生过氧化氢的底物和酶均在本发明的应用之列，能否适用考虑的因素仅在于是否会对检测过程产生不需要的副反应及成本问题。
本发明还提供了一种直接胆红素测定试剂盒，其特征在于：包括底物试剂和酶试剂；
所述底物试剂包括受氧化酶作用后生成过氧化氢的氧化酶底物、底物缓冲液；
所述酶试剂包括氧化酶、过氧化物酶及酶缓冲液；
所述氧化酶底物、氧化酶、过氧化物酶三者的量相互匹配。
优选地，所述底物试剂的pH范围为3.0～5.0，此pH范围为直接胆红素测试反应的最适pH范围，故选择此范围为最佳的pH值范围。
优选地，所述酶试剂的pH范围为6.0～9.0，由于大部分产生过氧化氢的酶的最适反应pH值在此范围内，且此范围也为过氧化物酶得稳定范围。
本发明方法在实施过程中，先是待测品和底物试剂反应，在添加酶试剂之后整个反应体系的最佳反应环境pH值为3.7～4.5。
优选地，所述底物试剂中氧化酶底物浓度为0.5～50mM，底物试剂在反应中需要过量以产生足够的过氧化氢。直接胆红素测试反应中，直接胆红素测试上限小于0.5mM，故试剂中最少需要0.5mM底物，底物添加过高会使测试成本增加，因此，我们把范围定在0.5～50mM。
优选地，所述酶试剂中氧化酶浓度为1～100KU/L，过氧化物酶浓度为1～50KU/L。酶在试剂中起催化作用，为保证反应能够在测试时间内到达反应终点，最好添加超过量的酶以保证反应的正常进行。实施例中使用的低浓度的酶可以保证反应正常进行。但是酶添加过多会使测试成本偏高，一般来说和底物用量相匹配。
优选地，所述底物试剂和所述酶试剂还包含防腐剂和/或表面活性剂。
优选地，所述防腐剂的浓度为0.01-0.2％。
防腐剂可以选自叠氮化钠，Proclin300，Krovin750等，现有技术中公布的可用于该类检测试剂的防腐剂均能采用。
优选地，所述表面活性剂的浓度为0.01％-8％。
表面活性剂可以选自聚乙二醇，TritonX-100，Tween20等，现有技术中公布的可用于该类检测试剂的表面活性剂均能采用。
本发明的原理：直接胆红素本身有明显颜色且易于被氧化而产生带有明显颜色的胆绿素，胆绿素进一步被氧化生产一种紫色化合物。使用氧化酶与其相应的底物发生氧化还原反应，产生过氧化氢，在过氧化物酶的作用下过氧化氢释放氧，将直接胆红素氧化生成胆绿素并进一步生产紫色化合物，吸收峰由直接胆红素的450nm左右转移到产物的630nm左右，450nm的吸收的下降程度与样品中的直接胆红素含量成正比。
本发明的有益效果：本发明采用价格便宜、易于获得且稳定性良好的其他氧化酶及其底物替代直接胆红素氧化酶，相对于原直接胆红素氧化酶的测定方法，成本大大降低，且检测方法所得的实验数据证实其分析灵敏度、准确性和重复性俱佳，检测试剂的使用安全性高，对环境的污染小。具有较好的实用性。
附图说明
图1为直接胆红素标准品经本发明试剂盒检测所得的标准曲线。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，实施例仅为举例，不用于限制本发明。下述实施例中的实验材料，如无特殊说明，均可以通过常规的商业途径购得。下述实施例中所采用的方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例
1)直接胆红素测定试剂盒
底物试剂：100mM柠檬酸缓冲液pH3.7，葡萄糖2mM，Proclin300 0.01％；
酶试剂：10mM磷酸缓冲液pH7.0，葡萄糖氧化酶36KU/L，过氧化物酶12KU/L，聚乙二醇6000为1％wt，Proclin300 0.0.01％wt。
2)试剂盒线性检测
准备直接胆红素标准品，利用步骤1)的直接胆红素测定试剂盒进行检测，检测方法为将底物试剂和样本在37℃孵育5min后，读数A1，加入酶试剂，反应5min后读数A2，计算A2-A1即为最终反应度。
反应产物适用于半自动及全自动生化分析仪检测。测试参数：波长450nm，终点法，试剂与加样量比例为24:1。底物试剂和酶试剂均为过量添加的。
用本发明试剂盒采用两点校准方式进行校准曲线绘制后，进行线性测试，校准曲线和线性测试结果分别见图1和表1。
表1.直接胆红素标准品检测结果线性表
3)试剂盒的重复性检测：
利用步骤1)的直接胆红素测定试剂盒对同一样品-进行多次检测，结果如下表。
表2.直接胆红素标准品检测结果重复性比较表
实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得到所需的测定结果，试剂可测有效(R≥0.999)线性范围可达500μmol/L，试剂测试的精密度(重复性)变异系数≤5％。本发明精密度好，线性范围宽广，组以便于推广应用。

Claims (10)

1.一种直接胆红素测定方法，其特征在于：利用氧化酶和其底物反应生成过氧化氢，再使过氧化氢和过氧化物酶反应释放氧气，将溶液中的直接胆红素氧化成胆绿素，进而使得吸收峰在450nm处发生下降，记录下降程度计算得出直接胆红素含量。
2.根据权利要求1所述直接胆红素测定方法，其特征在于：所述氧化酶和其底物分别为葡萄糖氧化酶和葡萄糖，尿酸酶和尿酸，胆固醇氧化酶和胆固醇，肌氨酸氧化酶和肌氨酸，乳酸氧化酶和乳酸，酒精氧化酶和甲醇，抗坏血酸氧化酶和抗坏血酸，胆碱氧化酶和胆碱，丙酮酸氧化酶和丙酮酸。
3.一种直接胆红素测定试剂盒，其特征在于：包括底物试剂和酶试剂；
所述底物试剂包括受氧化酶作用后生成过氧化氢的氧化酶底物、底物缓冲液；
所述酶试剂包括氧化酶、过氧化物酶及酶缓冲液；
所述氧化酶底物、氧化酶、过氧化物酶三者的量相互匹配。
4.根据权利要求3所述直接胆红素测定试剂盒，其特征在于：所述底物试剂的pH范围为3.0～5.0。
5.根据权利要求3所述直接胆红素测定试剂盒，其特征在于：所述酶试剂的pH范围为6.0～9.0。
6.根据权利要求3所述直接胆红素测定试剂盒，其特征在于：所述底物试剂中氧化酶底物浓度为0.5～50mM。
7.根据权利要求3所述直接胆红素测定试剂盒，其特征在于：所述酶试剂中氧化酶浓度为1～100KU/L，过氧化物酶浓度为1～50KU/L。
8.根据权利要求3所述直接胆红素测定试剂盒，其特征在于：所述底物试剂和所述酶试剂还包含防腐剂和表面活性剂。
9.根据权利要求3所述直接胆红素测定试剂盒，其特征在于：所述防腐剂的浓度为0.01～0.2％。
10.根据权利要求3所述直接胆红素测定试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂浓度为0.01～8％。
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