CN105021605A - 一种用于溶解氧检测的产品及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于氧化酶催化的氧化还原反应来检测溶解氧的试纸及试剂盒，包括与氧气反应生成过氧化氢的氧化酶及相应酶底物，以及与过氧化氢反应生成有颜色或带荧光的化合物的显色剂，其中，氧化酶及相应酶底物、显色剂可负载在载体上，制备成试纸。通过选择和设计稳定性好的氧化酶来催化相应酶底物与溶解氧反应，消耗氧分子，形成活性分子过氧化氢；所生成的过氧化氢将显色剂氧化成带颜色或荧光的产物，根据产物的颜色深浅或荧光的强弱来检测待测液中溶解氧的浓度。该试纸、试剂盒及方法可用于测定水介质中的溶解氧含量，可应用于水产养殖、生物医学、环境监测等领域，操作简单，制作成本低，易于推广。
Description
技术领域
本发明涉及溶解氧测定领域，特别涉及一种采用生物氧化酶测定溶解氧的试纸、试剂盒及方法。
背景技术
水中的溶解氧是水生动植物生存的最基本条件，也是其它行业必须监控的重要参数。溶解氧的测定在水产养殖、临床医学、环境保护、食品卫生等各个行业都具有重要意义。以水产养殖为例，鱼类生活在水中，用鳃进行气体交换，故水中溶氧的多少直接影响着鱼类的新陈代谢。当水中的溶氧量充足时，鱼摄食旺盛，消化率高，生长快。当水中的溶氧量过少时，鱼的正常活动就会受到影响，严重缺氧时可引起鱼的死亡。对于大部分鱼类来说，要求水中溶氧量不应低于4mg/L，低于2mg/L，就会产生轻度浮头；当降至0.6-0.8mg/L时，就会产生严重浮头；当降至0.3mg/L以下时，鱼就会开始死亡。目前测定溶解氧所用的方法包括碘量法(碘量法测定水中的溶解氧，国标BG7489-87.，Lide,David R.,CRC Handbook of Chemistry and Physics 87th,Boca Raton,Fl:CRC Press,2006,ISBN 0-8493-0487-3)、电极法(Clark Jr,LC；Wolf,R；Granger,D；Taylor,Z(1953).Journal of applied physiology,6(3):189–93.，Severinghaus,JW；Astrup,PB(1986).Journal of clinical monitoring,2(2):125–39)、分光光度法(Zollinger,H.,Color Chemistry:Syntheses,properties and applications of organic dye and pigments,Wiley-VCH,2004.，Goodfellow,G.I.Webber,H.M.,Analyst,1979,104,1105-1118)和荧光光学传感器(Hamlin,P.A.,Lambert,J.L.,Anal.Chem.,1971,63,618-620.，Wang,X.D.,Wolfbeis,O.S.Chem.Soc.Rev.2014,43,3666-3761)等。碘量法需要繁杂的滴定操作，非专业人员很难完成。其它三种方法要求与昂贵和复杂的仪器相配套，不适合野外和非专业人员使用。本发明涉及一种水中的溶解氧的简便和快速检测方法及产品，借助一种氧化酶及其相应的底物，通过氧化反应消耗水中的溶解氧，产生等当量的过氧化氢，所产生的过氧化氢再把成色分子或基团氧化成有色产物，通过观察产物的颜色变化或荧光变化，得出样品中的溶解氧含量。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种便携、效率高、灵敏度好的用于溶解氧检测的简便快速的产品。
本发明的另一个目的是提供一种简便、快速、准确率高的溶解氧检测方法及其在水环境中溶解氧检测中的应用。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于溶解氧测定的试纸，其特征在于：包括与氧气反应生成过氧化氢的氧化酶及相应酶底物，以及与过氧化氢反应生成有颜色或带荧光的化合物的显色剂；其中，所述氧化酶及相应酶底物，显色剂负载在载体上，制备成试纸。
优选的，所述氧化酶及相应酶底物选自以下组中的一种或多种：葡萄糖氧化酶及葡萄糖、乳酸氧化酶及乳酸、L-氨基酸氧化酶及L-氨基酸、D-氨基酸氧化酶及D-氨基酸、L-α-羟基酸氧化酶及L-α-羟基酸、尿酸氧化酶及尿酸、醇类氧 化酶及醇、醛类氧化酶及醛等。更优选的，所述醇类氧化酶及醇包括但不限于：胆固醇氧化酶及胆固醇、乙醇氧化酶及乙醇等；所述醛类氧化酶及醛包括但不限于：乙二醛氧化酶及乙二醛、视黄醛氧化酶及视黄醛、牛醛氧化酶及牛醛等。
优选的，所述显色剂为其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8独立的选自H、C1-C3的烷基、NH2，更优选的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8独立的选自H、CH3、NH2，最优选的，显色剂为4,4'-二氨基联苯，3,5,3',5'-四甲基-4,4'-二氨基联苯，3,4,3',4'-四氨基联苯，3',3'-二甲基-4,4'-二氨基联苯等；
或者所述的显色剂为由4-氨基安替比林与组成试剂对，其中R9选自OH或NH2，R10、R11、R12、R13、R14独立的选自H、卤素、羧基、磺酸基、羟基和甲氧基。优选的，所述的为苯酚、苯胺、羧基苯酚、羧基苯胺。
优选的，所述载体为纤维素及其衍生物纸张，例如实验室常规滤纸。
优选的，所述载体上还负载催化剂和/或缓冲液；所述催化剂包括辣根过氧化物酶、铁基化合物等能够催化过氧化氢与显色剂反应的物质；所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、醋酸-醋酸盐缓冲液、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。
优选的，所述载体上氧化酶的负载量为0.5-50U，更优选的，为3-20U。本领域技术人员知晓，载体上氧化酶的负载量不限于上述具体数值，可以根据具体测量中测试瓶的体积进行适当调整。
优选的，所述试纸的制备方法如下：将氧化酶加入水中至全部溶解，得到溶液一；将酶底物、显色剂加入水中至全部溶解，得到溶液二；向滤纸上滴加溶液一，室温晾干，得到试纸一；另取滤纸，滴加溶液二，30℃～45℃下至滤纸烘干，得到试纸二。更优选的，烘干时间小于12小时。
本领域技术人员知晓，在制备试纸时，溶液一和/或溶液二中还可包括催化剂和/或缓冲液。
本发明还提供一种用于溶解氧测定的比色卡，所述比色卡通过如下步骤制备：
(1)向盛有水的容器中分别通入不同氧气浓度的气体，持续通入气体直至水中溶解氧浓度测量值稳定；
(2)取步骤(1)水样分别加入相同体积溶解氧测试瓶中，水样加满测试瓶，测试瓶中无气泡，盖紧瓶盖，摇晃后静置2-5min，观察颜色变化；所述测试瓶内置有试纸；
(3)记录不同溶解氧浓度的水样颜色制作成溶解氧比色卡。
具体的，可通过如下步骤制备：取8个200mL烧杯，加入自来水，向水中分别通入不同氧气浓度的气体：纯氮气，2.5％氧气+97.5％氮气混合气体，5％氧气+95％氮气混合气体，10％氧气+90％氮气混合气体，15％氧气+85％氮气混合气体，压缩空气(20.8％氧气)，35％氧气+65％氮气混合气体和氧气，持续通入气体10-30min；用仪器测试水中的溶解氧浓度，直至测量值稳定；每个烧杯中取水样分别加入相同体积溶解氧测试瓶中，水样加满测试瓶，测试瓶中无气泡，盖紧瓶盖，将瓶子上下翻转，摇晃，静置5分钟，观察颜色变化；所述测试瓶内放置有负载氧化酶、相应酶底物及显色剂的试纸，所述氧化酶能够催化酶底物与氧气反应生成过氧化氢；所述显色剂能与过氧化氢反应生成有颜色或带荧光的化合物；拍摄5min时不同溶解氧浓度的水样，将照片制作成溶解氧比色卡。
本领域技术人员知晓，上述容器的体积及个数、氧气浓度、静置及拍摄时间等的具体参数仅用于示例性说明本发明溶解氧比色卡的制作方法，并不用于限定本发明。本领域技术人员可以依据实际需求作适应性调整和改动。
此外，本发明还提供一种用于溶解氧测定的试剂盒，包括氧化酶及相应酶底物，显色剂；其中所述氧化酶能够催化酶底物与氧气反应生成过氧化氢；所述显色剂能与过氧化氢反应生成有颜色或带荧光的化合物。
优选的，所述氧化酶及相应酶底物选自以下组中的一种或多种：葡萄糖氧化酶及葡萄糖、乳酸氧化酶及乳酸、L-氨基酸氧化酶及L-氨基酸、D-氨基酸氧化酶及D-氨基酸、L-α-羟基酸氧化酶及L-α-羟基酸、尿酸氧化酶及尿酸、醇类氧化酶及醇、醛类氧化酶及醛等。更优选的，所述醇类氧化酶及醇包括但不限于：胆固醇氧化酶及胆固醇、乙醇氧化酶及乙醇等；所述醛类氧化酶及醛包括但不限于：乙二醛氧化酶及乙二醛、视黄醛氧化酶及视黄醛、牛醛氧化酶及牛醛等。
优选的，所述显色剂为其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8独立的选自H、C1-C3的烷基、NH2，更优选的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8独立的选自H、CH3、NH2，最优选的，显色剂为4,4'-二氨基联苯，3,5,3',5'-四甲基-4,4'-二氨基联苯，3,4,3',4'-四氨基联苯，3',3'-二甲基-4,4'-二氨基联苯等；
或者所述的显色剂为由4-氨基安替比林与组成试剂对，其中R9选自OH或NH2，R10、R11、R12、R13、R14独立的选自H、卤素、羧基、磺酸基、羟基和甲氧基。优选的，所述的为苯酚、苯胺、羧基苯酚、羧基苯胺。
优选的，所述试剂盒还包括催化剂和/或缓冲液；所述催化剂包括辣根过氧化物酶、铁基化合物等能够催化过氧化氢与显色剂反应的物质；所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、醋酸-醋酸盐缓冲液、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。
优选的，所述氧化酶、底物、显色剂、催化剂和/或缓冲液可负载在载体纤维素及其衍生物纸张上(例如实验室常规滤纸)，制备成试纸。本领域技术人员知晓，所述载体不限于纸张，也可为凝胶、微珠等形式，例如天然高分子化合物：壳聚糖及其衍生物、海藻酸钠、琼脂糖及其衍生物等；合成高分子聚合物：聚乙烯、聚苯乙烯、PMMA、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯等；无机物：玻璃、硅胶、介孔分子筛等。本领域技术人员可以理解，所述氧化酶、底物和/或显色剂也可以溶液的形式保存在水中，选择合适的载体为了提高氧化酶、底物或显色剂的保存时间。
优选的，所述试剂盒还包括带瓶盖的测试瓶，所述测试瓶容量为0.5-10mL，更优选的为1-5mL，最优选的为2mL。本领域技术人员知晓，测试瓶的体积可以依据实际需求进行选取，本发明对此不作限定。
优选的，所述试剂盒还包括用于溶解氧测定的比色卡。
本发明提供一种溶解氧的检测方法，包括如下步骤：将与氧气反应生成过氧化氢的氧化酶及相应酶底物与待测样品相接触；将与过氧化氢反应生成有颜色或带荧光的化合物的显色剂与待测样品相接触；根据接触后待测样品的颜色深浅或荧光的强弱判断溶解氧的浓度；其中，所述的氧化酶及相应酶底物和所述的显色剂同时或者顺序与检测样品接触。
优选的，所述氧化酶及相应酶底物选自以下组中的一种或多种：葡萄糖氧化酶及葡萄糖、乳酸氧化酶及乳酸、L-氨基酸氧化酶及L-氨基酸、D-氨基酸氧化酶及D-氨基酸、L-α-羟基酸氧化酶及L-α-羟基酸、尿酸氧化酶及尿酸、醇类氧化酶及醇、醛类氧化酶及醛等。更优选的，所述醇类氧化酶及醇包括但不限于：胆固醇氧化酶及胆固醇、乙醇氧化酶及乙醇等；所述醛类氧化酶及醛包括但不限于：乙二醛氧化酶及乙二醛、视黄醛氧化酶及视黄醛、牛醛氧化酶及牛醛等。
优选的，所述显色剂为其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8独立的选自H、C1-C3的烷基、NH2，更优选的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8独立的选自H、CH3、NH2，最优选的，显色剂为4,4'-二氨基联苯，3,5,3',5'-四甲基-4,4'-二氨基联苯，3,4,3',4'-四氨基联苯，3',3'-二甲基-4,4'-二氨基联苯等；
或者所述的显色剂为由4-氨基安替比林与组成试剂对，其中R9选自OH或NH2，R10、R11、R12、R13、R14独立的选自H、卤素、羧基、磺酸基、羟基和甲氧基。优选的，所述的为苯酚、苯胺、羧基苯酚、羧基苯胺。
优选的，采用目视、分光光度计或荧光光谱仪进行检测。
在一个具体的实施方式中，采用目视法检测溶解氧浓度，将水样加入溶解氧测试瓶中，加满，测试瓶中无气泡，盖紧瓶盖，摇晃后静置2-5min，根据显示颜色的深浅判断水样中溶解氧浓度的大小；所述测试瓶内置有氧化酶及相应酶底物、显色剂。
优选的，所述氧化酶、底物和/或显色剂负载在载体纤维素及其衍生物纸张上(例如实验室常规滤纸)，制备成试纸。
优选的，检测温度不高于35℃，更优选的，检测温度为10-35℃。
优选的，测试瓶内所述氧化酶的浓度不小于1U/mL。
优选的，所述水样中硫氢根浓度小于1mg/L。
此外，本发明还提供一种试剂盒在水中溶解氧测定中的应用。尤其用于水产养殖、生物医学、环境监测中水中溶解氧的测定。
本发明有益效果：
本发明利用氧化酶催化酶底物氧化过程消耗水中的溶解氧，生成活性过氧化氢，进而与显色剂反应生成有色产物；产物颜色的深浅直接与溶解氧浓度相关。试剂盒制作简单，成本低，便携，易于推广；此外，检测方法简便、快速，效率高、灵敏度好。
附图说明
图1溶解氧检测比色卡
图2不同氧化酶浓度下溶解氧测定显色效果图
图3不同水环境温度下溶解氧测定显色效果图
图4-1、4-2氯化钙对加速氧化酶的酶促反应测定显色效果图
图5不同干燥条件下的试纸溶解氧测定显色效果图
图6-1、6-2试纸在测试瓶中固定位置溶解氧测定显色效果图
图7-1、7-2硫氢根存在下溶解氧测定显色效果图
图8不同盐度下溶解氧测定显色效果图
图9-1至9-6溶解氧显色剂盒的稳定性评价显色效果图
图10-1至10-6实际水样中溶解氧测定显色效果图
图114-氨基安替吡-3-二甲基氨基苯甲酸钠-显色体系在不同溶解氧溶液中的吸收光谱
图12硫酸亚铁-苯胺(Fenton)显色体系在不同溶解氧溶液中的吸收光谱
具体实施方式
本发明基于生物氧化酶催化酶底物与溶解氧反应，消耗氧分子，以氧作为受氢体，产生活性过氧化氢；生成的过氧化氢再与成色基团或荧光前体反应，形成有颜色或带荧光的化合物；溶解氧浓度的高低与过氧化氢的量直接相关，通过检测颜色深浅或荧光强度来检测样品中的溶解氧浓度。
下面结合具体实施例及说明书附图对本发明作进一步说明。
需要注意的是，本发明具体实施例中试剂盒使用了具体的检测试纸只是出于方便理解的目的，本领域技术人员可根据具体测试需求进行必要的改动来制备可用于本发明的溶解氧检测试剂盒。
需要注意的是，本发明具体实施例中根据肉眼观察溶液颜色的深浅进行水样中溶解氧浓度大小的判断，而非具体溶解氧浓度值的确定。这只是出于方便理解和操作简易的目的，本领域技术人员可根据这个具体的测试结果进行必要的改动，例如测定溶液吸光度值的变化或者荧光值的变化，对溶解氧浓度进行定量检测。
需要注意的是，本发明具体实施例中根据肉眼观察溶液颜色的深浅进行水样中溶解氧浓度大小的判断，主要是通过颜色的深浅进行判断，实施例中具体的颜色的命名不用于限定本发明，本领域技术人员可以知晓，同一颜色的不同称呼或在不同拍摄条件和/或显示器会导致颜色命名结果差异(品红、玫红、紫红、紫色、橙红等)，这并不影响本发明溶解氧浓度大小的判断。
实施例1：
1.称取0.27g磷酸二氢钾，0.28g磷酸氢二钠，2.4mg辣根过氧化物酶，3mg葡萄糖氧化酶，5.5mg牛血清白蛋白，加入5mL水至全部溶解，得到溶液一；
2.称取0.9g葡萄糖，0.28g磷酸氢二钠和0.27g磷酸二氢钾，0.12g 4-氨基安替吡啉，0.13g 3-二甲基氨基苯甲酸钠，加到5mL水中,搅拌使其完全溶解，得到溶液二；
3.剪下0.6cm*1.2cm大小的滤纸，塞入测试瓶盖中，向滤纸上加溶液一50μL。室温晾干滤纸。制作成的试纸一段呈现淡棕色，称为试纸一；
4.剪下2.5cm*1.0cm大小的滤纸，塞入容积为2mL的测试瓶中，向滤纸上加溶液二50μL，然后将测试瓶放入45℃烘箱中至滤纸烘干。制作成的试纸 略微呈黄色，称为试纸二；
5.将试纸一放入放入装有试纸二的测试瓶中，旋上测试瓶盖。
本领域技术人员知晓，上述试剂用量的具体数值并不用于限定本发明，其仅用于示例性说明试剂的配比，本领技术人员可以依据实际需求进行调整。试瓶的容积不限于2mL，可以依据实际需求选择其它尺寸，例如0.5mL、1mL、5mL、10mL等。此外，试纸也可选择其它尺寸，本发明对此不作限定。
实施例2：
1.称取0.27g磷酸二氢钾，0.28g磷酸氢二钠，2.4mg辣根过氧化物酶，3mg葡萄糖氧化酶，5.5mg牛血清白蛋白，加入5mL水至全部溶解，得到溶液一；
2.称取0.9g葡萄糖，0.28g磷酸氢二钠和0.27g磷酸二氢钾，0.25g 3,5,3’5’-四甲基-4,4'-二氨基联苯的DMSO溶液(10mg/mL)，加到5mL水中，搅拌使其完全溶解，得到溶液二；
3.剪下0.6cm*1.2cm大小的滤纸，塞入测试瓶盖中，向滤纸上加溶液一50μL。室温晾干滤纸。制作成的试纸一端呈现淡棕色，称为试纸一；
4.剪下2.5cm*1.0cm大小的滤纸，塞入测试瓶中，向滤纸上加溶液二50μL，然后将测试瓶放入45℃烘箱中至滤纸烘干。制作成的试纸略微呈黄色，称为试纸二；
5.将试纸一放入放入装有试纸二的测试瓶中，旋上测试瓶盖。
实施例3：
1.称取0.55g磷酸二氢钾，0.56g磷酸氢二钠，2.4mg辣根过氧化物酶，3mg葡萄糖氧化酶，5.5mg牛血清白蛋白，加入5mL水至全部溶解，得到溶液一；
2.称取0.9g葡萄糖，0.29g硫酸亚铁，0.50g苯胺的DMSO溶液(20mg/mL)，加到5mL水中，搅拌使其完全溶解，得到溶液二；
3.剪下0.6cm*1.2cm大小的滤纸，塞入测试瓶盖中，向滤纸上加溶液一50μL。室温晾干滤纸。制作成的试纸一段呈现淡棕色，称为试纸一；
4.剪下2.5cm*1.0cm大小的滤纸，塞入测试瓶中，向滤纸上加溶液二50μL，然后将测试瓶放入45℃烘箱中至滤纸烘干。制作成的试纸略微呈黄色，称为试纸二；
5.将试纸一放入放入装有试纸二的测试瓶中，旋上测试瓶盖。
实施例4：
1.称取0.27g磷酸二氢钾，0.28g磷酸氢二钠，2.4mg辣根过氧化物酶，2.8mg乳酸氧化酶，5.5mg牛血清白蛋白，加入5mL水至全部溶解，得到溶液一；
2.称取0.62g乳酸，0.28g磷酸氢二钠和0.27g磷酸二氢钾，0.12g 4-氨基安替吡啉，0.13g苯酚，加到5mL水中，搅拌使其完全溶解，得到溶液二；
3.剪下0.6cm*1.2cm大小的滤纸，塞入测试瓶盖中，向滤纸上加溶液一50μL。室温晾干滤纸。制作成的试纸一段呈现淡棕色，称为试纸一；
4.剪下2.5cm*1.0cm大小的滤纸，塞入测试瓶中，向滤纸上加溶液二50μL，然后将测试瓶放入45℃烘箱中至滤纸烘干。制作成的试纸略微呈黄色，称为试纸二；
5.将试纸一放入放入装有试纸二的测试瓶中，旋上测试瓶盖。
实施例5：
1.称取0.54g磷酸二氢钾，0.56g磷酸氢二钠，2.4mg辣根过氧化物酶，2.8mg乳酸氧化酶，5.5mg牛血清白蛋白，加入5mL水至全部溶解，得到溶液一；
2.称取0.62g乳酸，0.29g硫酸亚铁，0.50g苯胺的DMSO溶液(20mg/mL)， 加到5mL水中，搅拌使其完全溶解，得到溶液二；
3.剪下0.6cm*1.2cm大小的滤纸，塞入测试瓶盖中，向滤纸上加溶液一50μL。室温晾干滤纸。制作成的试纸一段呈现淡棕色，称为试纸一；
4.剪下2.5cm*1.0cm大小的滤纸，塞入测试瓶中，向滤纸上加溶液二50μL，然后将测试瓶放入45℃烘箱中至滤纸烘干。制作成的试纸略微呈黄色，称为试纸二；
5.将试纸一放入放入装有试纸二的测试瓶中，旋上测试瓶盖。
实施例6：水中溶解氧测试方法
采用本发明实施例1-5的试剂盒对自来水中的溶解氧进行测定。用滴管快速将水样加到溶解氧测试瓶中，加满，测试瓶中无气泡，迅速盖紧瓶盖，将瓶子上下翻转，摇晃5次，静置5min，将测试瓶放置于白色背景下，根据显示的颜色的深浅判断水样中溶解氧浓度的大小。
其中，采用本发明实施例1中试剂盒测定自来水中溶解氧，在5min时，溶液显紫红色，在波长为550nm处具有最大吸收峰；采用本发明实施例2中试剂盒测定自来水样中溶解氧，在5min时，溶液显蓝色，在波长为655nm处具有最大吸收峰；采用本发明实施例3、5中试剂盒测定自来水样中溶解氧，在5min时，溶液显蓝色，在波长为720nm处具有最大吸收峰；采用本发明实施例4中试剂盒测定自来水样中溶解氧，在5min时，溶液显红色，在波长为510nm处具有最大吸收峰。
实施例7:溶解氧比色卡的制作
溶解氧系列溶液的制备：取6个200mL烧杯，加入自来水。向其中5个烧杯的水中分别通入不同氧气浓度的气体：纯氮气，5％氧气+95％氮气混合气体，10％氧气+90％氮气混合气体，15％氧气+85％氮气混合气体，35％氧气+65％氮气混合气体，持续通入气体约30min。用德国muLti3420仪器测试水中的溶解氧浓度，直至测量值稳定。每个烧杯中取水样分别加入实施例1试剂盒中的溶解氧测试瓶中，加满，不能有气泡，迅速盖紧瓶盖，将瓶子上下翻转，摇晃5次，静置5分钟，观察颜色变化。拍摄5min时不同溶解氧浓度的水样，将照片制作成溶解氧比色卡，参照附图1，随着溶解氧浓度的增加，溶液颜色逐渐增加。
本领域技术人员知晓，测试瓶的体积以及反应时间不仅限于实施例7中所列具体数值，可以根据实际需求进行调整，实际检测与其保持一致即可。
本领域技术人员知晓，本实施例中比色卡制作以实施例1中试剂盒为例，该制作方法也适用于本发明其它试剂盒中比色卡的制作。
实施例8：不同氧化酶浓度对溶解氧测定影响的对比实验
酶浓度是影响酶促反应速率的主要因素之一，氧化酶的浓度通过影响底物和氧气与氧化酶的接触而影响酶促反应速率。适宜的生物氧化酶的浓度，一方面可实现在短短几分钟内催化氧化还原反应的进行，快速检测水中溶解氧的浓度；另一方面则有利于降低溶解氧试剂盒的成本，便于产品的推广普及。本发明对不同氧化酶酶浓度对溶解氧测定影响进行考察。
按实施例1步骤制备试剂盒，其中测试瓶中试纸上葡萄糖氧化酶的用量分别为1U、2U和4U。在三个测试瓶中分别充入2mL自来水水样，自来水样为充入不同浓度的氧气达到平衡后的水样，保证测试瓶中无气泡，迅速盖紧瓶盖，将瓶子上下翻转，静置，分别在氧化还原反应进行1min、5min时拍摄照片。其中附图2中A组均为氧化还原反应1min时拍摄的照片，图2中B组均为氧化还原反应5min拍摄的照片。附图2中A1和附图2中B1测试瓶中试纸上葡萄糖氧化酶的用 量为1U，从左至右的3瓶中水样溶解氧浓度为1.2mg/L、4.5mg/L、7.6mg/L；附图2中A2和附图2中B2测试瓶中试纸上葡萄糖氧化酶的用量为2U，从左至右的3瓶中水样溶解氧浓度为0.2mg/L、4.3mg/L、7.4mg/L；附图2中A3和附图2中B3测试瓶中试纸上葡萄糖氧化酶的用量为4U，从左至右的3瓶中水样溶解氧浓度为0.2mg/L、4.3mg/L、7.4mg/L。测试结果如下述表1所示：
表1不同氧化酶浓度下溶解氧测定显色对比
其中，上述表1中“-”表示无色或浅粉色，“+”表示浅紫红，“++”表示紫红，“+++”表示深紫红；“+”的数量用于表示颜色的深浅程度。
由测试结果可知，生物氧化酶的用量为1U/2mL时，参见附图2中A1和2中B1，氧化还原反应在1min可观测到溶液颜色的变化，随着溶解氧溶度的增加，从左到右颜色呈浅粉、浅紫红、紫红，逐渐加深，在5min时颜色鲜艳，此时可根据颜色的深浅程度的不同进行溶解氧浓度大小的判读。由附图2中B1可知，溶解氧浓度为4.5mg/L的水样和7.6mg/L的水样的颜色深浅程度接近，用肉眼不易判读其溶解氧浓度的大小。说明生物氧化酶的用量不足，当溶解氧浓度较高时(例如>4.5mg/L)，水样中的溶解氧已经消耗完生物氧化酶，氧化还原反应产生的过氧化氢的量为一定量，故消耗的显色剂也为一定量，从而产生的有色产物所显示出的溶液颜色深浅相同，从而无法判断溶解氧浓度的大小。
当生物氧化酶的用量为2U/2mL时，参见附图2中A2和附图2中B2，氧化还原反应在1min已经开始，在5min可根据溶液颜色的深浅对溶液中溶解氧浓度的大小进行判断。
当生物氧化酶的用量在4U/2mL时，参见附图2中A3和附图2中B3，氧化还原反应的速度由于生物氧化酶的大量加入而变快，在1min时颜色变化强烈，在5min时颜色的深浅同样可以显示水样中溶解氧浓度的大小。
从上述检测结果可知，当生物氧化酶的用量达到为2U/2mL时，即可达到检测溶解氧浓度的目的。本领域技术人员知晓，当氧化酶的用量继续增大，同样能够实现本发明检测目的。
实施例9：不同水环境温度对溶解氧测定影响的对比实验
本发明通过测试10～35℃温度范围内(基本涵盖了自然条件下实际水所处的环境)溶解氧测试瓶检测水样中溶解氧浓度的能力，确定溶解氧检测方法的适用温度范围。
将本发明实施例6溶解氧测试方法应用于不同温度的水样进行溶解氧浓度的测试。所采用的试剂盒按照本发明实施例1步骤制备。参见附图3第一行至第6行图片，测试水样的温度分别为10.0℃、15.0℃、20.3℃、25.3℃、30.2℃、34.8℃。测试瓶中水样为充入不同浓度的氧气达到平衡的自来水水样，水样均为2mL体积，从左至右的3瓶中水样溶解氧浓度为分别为0.5mg/L、3.0mg/L、6.75mg/L，反应时间分别为1min、2min、3min、5min。
表2：不同水环境温度下溶解氧测定显色对比
其中，上述表2中“-”表示无色或浅粉色，“+”表示浅紫红，“++”表示紫红，“+++”表示深紫红；“+”的数量用于表示颜色的深浅程度。
由附图3结果可知，氧化还原反应在1min内进行，随着时间的增加，溶液颜色不断加深。当温度为10℃时，反应在5min呈现明显的颜色变化，随着温度的增加，2min～5min可根据溶液颜色的深浅对水样中溶解氧浓度的大小进行判断，溶解氧浓度较低时，溶液呈浅粉色，随着浓度增加，溶液颜色变为浅紫红、紫红色。
此外，由附图3结果可知，温度越低，氧化还原反应进行得越慢，但温度达到34.8℃时，生物氧化酶催化的氧化还原反应进行5min时溶液颜色也有所降低。
由此可见，水样的温度通过影响酶活性来影响酶促反应速率，在温度较低时，酶促反应速度随温度的升高而加快；但温度超过一定范围后，酶受热变性占主导 因素，反应速度反而随温度升高而减慢。
实施例10：氯化钙对加速氧化酶的酶促反应的影响
如实施例9所述，在一定温度范围内，酶促反应随着温度的升高而加快，氯化钙溶于水放出大量的热(溶解焓为-176.2caL/g)，将提高水溶液的温度，基于此，本发明考察氯化钙对于加速生物氧化酶的酶促反应的影响。
将本发明实施例6溶解氧测试方法应用于不同温度的水样进行溶解氧浓度的测试。所采用的试剂盒按照本发明实施例1步骤制备。
附图4显示了本发明氯化钙对于加速生物氧化酶的酶促反应的影响。参见附图4-1，从左至右三个测试瓶中加入水样的溶解氧浓度为0.2mg/L、4.3mg/L、7.4mg/L。向测试瓶中加入水样之前，瓶中加入8％试剂总量(质量百分比计)的氯化钙。由检测结果可知，虽然测试瓶中水样的温度明显增加，但是在氧化还原反应进行10min时，水样的颜色较为暗淡，并且水样中呈现浑浊状。由此可见，尽管反应温度增加，但是酶促反应明显受到抑制；并且氯化钙的加入使溶液呈现浑浊，不利于溶液颜色的显现及溶解氧浓度的判读。
参见附图4-2，第1行图片中左测试瓶注入水样之前加入1.5％试剂总重的氯化钙，右测试瓶中注入水样之前加入0.5％试剂总重的氯化钙；第2行图片中左测试瓶注入水样之前加入0.2％试剂总重的氯化钙，右测试瓶注入水样之前加入0.1％试剂总重的氯化钙；第3行图片中左测试瓶注入水样之前加入0.1％试剂总重的氯化钙，右测试瓶中未加氯化钙。由附图4-2检测结果可知，降低氯化钙的量至试剂总重的1.5％、0.5％、0.2％、0.1％和0时，氯化钙的逐次降低并没有对水样中进行的氧化还原反应有显著影响，在与对照试验的直接对比中，氯化钙的加入对于反应时间、氧化还原反应产生的颜色变化没有明显影响。由此可知，基于氯化钙溶解产生的热量用于提高水样温度从而加速氧化酶催化的氧化还原反应是无意义的，此外，一定量的氯化钙的加入可能会导致溶液浑浊，干扰溶解氧浓度的判读。
实施例11：试纸干燥条件对比实验
氧化酶作为一种生物催化剂，易受物理、化学和生物等因素的影响而失活，将氧化酶固定在一些性能优良的载体上，可提高酶的储存稳定性。本发明以滤纸作为氧化酶的载体，考察溶解氧检测方法中所需的酶、酶底物、蛋白、盐等试剂负载在滤纸上制备试纸干燥固定所需的条件。
采用本发明实施例1步骤制备试纸。测试瓶中水样为充入不同浓度的氧气达到平衡的自来水水样，参考附图5，测试瓶从左到右，溶解氧浓度为0.2mg/L、2.8mg/L、6.2mg/L；制备好的试纸在45℃培养箱中分别烘干2天(第一行图片)和烘干过夜(第二行图片)。
参考附图5所示，当试纸在45℃环境中烘干2天后，试纸呈黄色，加入不同溶解氧浓度的水样后均显现一定的背景色，并且溶液颜色的深浅程度不利于对溶解氧浓度的判读。试纸在45℃烘干过夜后，加入不同溶解氧浓度的水样后，几乎观察不到背景色，并且溶液颜色的深浅程度反映溶解氧浓度的大小。故试纸在烘干过程的时间不宜超过12小时。
实施例12：试纸在测试瓶中固定位置对比实验
试纸在测试瓶中可固定于瓶底、固定在瓶盖内及放置在瓶体中(未固定)，当水样加入测试瓶，反复摇动瓶子以释放试纸承载的试剂，试纸固定与否，会影响试剂释放出的快慢以及试剂溶解在水样的速度，从而影响氧化还原反应的速度。本发明摸索试纸放置位置对显色时间的影响。
采用本发明实施例1步骤制备试纸。测试瓶中加入的水样均为新鲜自来水。附图6-1中试纸一置于瓶底，试纸二固定在瓶盖。附图6-2中左瓶试纸二塞在瓶盖上(固定)；右瓶中试纸二放在瓶中(未固定)；两瓶中的试纸一都粘附在瓶底。加入水样后同时反复摇动小瓶。
由附图6-1结果可知，当试纸分别固定在瓶底和瓶盖中时，显色时间延长至10min以上，1-5min几乎无颜色变化。由附图6-2结果可知，固定了试纸的水样在3～5min后才开始显色，并且水样的颜色判读需要在5min以上；而未固定试纸位置的水样在1～2min开始显色，3～5min可判读水样的颜色。由此可见，在制作溶解氧测试试纸的过程中，不能将试纸固定在瓶盖上，否则将延迟显色时间。
实施例13：水中硫氢根、盐度对氧化酶催化的氧化还原反应的影响
自然环境中的水体各异，例如发臭的河水中硫氢根离子浓度较高；海水的平均含盐浓度为35‰，而淡水的含盐浓度只有0.01～0.5‰，二者相差悬殊。本发明研究干扰物质对氧化酶催化的氧化还原反应的影响，有利于溶解氧检测试剂盒的广泛应用。
采用本发明实施例4溶解氧测试方法进行检测；所采用的测试瓶按照本发明实施例1步骤制备。
1.附图7为本发明硫氢根的干扰实验。左瓶为溶解氧检测试纸法，右瓶为PEG法，硫氢根浓度分别为0，0.125mg/L，0.25mg/L，0.5mg/L，1mg/L，2mg/L，4mg/L。该范围参考“硫氢根检测试验”。
结果可知，随着硫氢根浓度的增加，两种方法的显色时间逐渐延长。参见附图7-1第一行至第7行图片中，硫氢根浓度分别为0，0.125mg/L，0.25mg/L，0.5mg/L，1mg/L，2mg/L，试纸法在硫氢根浓度为1mg/L开始显色；当硫氢根浓度2mg/L时，PEG法显色时间开始于3min。当浓度高至4mg/L(硫氢根检测试验的上限)，参见附图7-2，试纸法显色时间在第5min，而PEG法显色时间大于6min。随着硫氢根浓度的增加，两种方法的颜色判读时间逐渐延长。硫氢根浓度2mg/L时，两种方法的颜色判读时间在5min；当浓度高至4mg/L时，参见附图7-2，试纸法颜色判读时间在6min，PEG法在7min。可见，当硫氢根浓度超过1mg/L时，对生物氧化酶催化的氧化还原反应的显色有干扰。
2.附图8为本发明溶液盐度对显色时间的影响实验。参照附图8第一行至第五行图片，用不同稀释程度(1/16、1/8、1/4、1/2、未稀释)的海水来模拟不同盐度的溶液。左瓶为溶解氧检测试纸法，右瓶为PEG法。
经测定，海水中溶解氧浓度为6.66mg/L。由附图8结果所示，随着盐度的增加，氧化还原反应速度降低，但在5min时溶液颜色仍可显示出溶解氧浓度的大小。可见，当检测时间不小于5min时，溶液中不同盐度对溶解氧检测的影响可忽略不计。
实施例14：溶解氧检测试纸/试剂盒的稳定性评价
本发明对溶解氧检测试剂盒的稳定性进行评估，以期确定试剂盒的有效期及储存温度条件。
附图9-1中所用的试纸在冷藏条件下保存30天，试纸上氧化酶用量为6U/2mL，水样为新鲜自来水，由测试结果可知，溶解氧的浓度可根据水样颜色的深浅变化进行判读。
附图9-2中试纸在冷藏条件下保存70天，试纸上氧化酶用量为6U/2mL，水样为通入不同浓度氧气平衡后的自来水，溶解氧浓度从左到右依次为0.57mg/L、 4.28mg/L、7.15mg/L。由测试结果可知，水样颜色的深浅程度已经不足以反映出溶解氧浓度的大小。
附图9-3中所用的试纸在冷藏条件下保存75天，试纸上氧化酶用量为6U/2mL，水样为新鲜自来水。由测试结果可知，水样经试纸测试后在3min有颜色变化，在5min时4个水样的颜色已经转为背景色，无法进行溶解氧浓度的判读。可见，当氧化酶用量为6U/2mL，承载有氧化酶及相关试剂的试纸在冷藏条件下储存70天失效。
附图9-4和附图9-5中试纸在冷藏条件下分别保存保存86、100天，试纸上氧化酶用量为9U/2mL，水样为通入不同浓度氧气平衡后的自来水，附图9-4，溶解氧浓度从左到右依次为1.5mg/L、3.3mg/L、8.8mg/L；附图9-5，溶解氧浓度依次为4.2mg/L、7.0mg/L、10.1mg/L。测试结果表明，增加试纸承载的氧化酶的用量至9U/2mL，试纸的有效期至少可延长至100天。
附图9-6中所用的试纸在冷冻条件下保存30天，试纸上氧化酶用量为6U/2mL，水样为通入不同浓度氧气平衡后的自来水，溶解氧浓度从左到右依次为2.6mg/L、4.3mg/L、6.9mg/L、8.3mg/L。测试结果表明，将试纸储存在冷冻条件下，其稳定性可延长。
实施例15：实际水样中溶解氧测定
采用本发明实施例1的试剂盒对自然环境水样中的溶解氧进行测定。用滴管快速将水样加到溶解氧测试瓶中，加满，测试瓶中无气泡，迅速盖紧瓶盖，将瓶子上下翻转，摇晃5次，静置5min，将测试瓶放置于白色背景下，根据显示的颜色，参照溶解氧比色卡，与测试瓶中溶液颜色相近的的色标即为水样的溶解氧值。
附图10-1中水样为通入不同浓度氧气平衡后的自来水，溶解氧浓度依次为3.1mg/L、4.3mg/L、8.0mg/L和20mg/L的自来水样。从图中可以看出，溶液的颜色随着水样中溶解氧浓度的增加逐渐加深，依次为粉、浅紫红、紫红和深紫红色，溶液颜色的深浅与溶解氧氧浓度的高低呈现对应关系。附图10-2、10-3、10-4、10-5、10-6中的水样分别为取自大鱼鱼塘、河水、湖水、海水以及鱼苗鱼塘的水样，溶解氧浓度范围为0.78mg/L～8.03mg/L，显色效果及浓度参见下表3。
表3：实际水样中溶解氧浓度测定显色效果
其中，上述表3中“+”，“++”，“+++”，“++++”分别表示从粉红、紫红、深紫红依次加深的颜色，“+”的数量代表颜色的深浅。
实施例16
按实施例1步骤制备试剂盒，采用吸光光度法测定不同溶解氧浓度水样的吸收光谱。附图11为4-氨基安替吡啉-3-二甲基氨基苯甲酸钠显色体系在不同溶解氧值水样中的吸收光谱，水样为通入不同浓度氧气平衡后的自来水，溶解氧浓度 依次为0.1mg/L、1.5mg/L、2.8mg/L、5.0mg/L、6.4mg/L、8.3mg/L、13.1mg/L和20mg/L的自来水样。从图11中可以看出，在550nm处溶液的吸光度随着水样中溶解氧浓度的增加而增加。吸光度数值与溶解氧氧浓度的高低呈现对应关系。
实施例17
按实施例3步骤制备试剂盒，采用吸光光度法测定不同溶解氧浓度水样的吸收光谱。附图12为硫酸亚铁与苯胺(Fenton)显色体系在不同溶解氧值水样中的吸收光谱。水样为通入不同浓度氧气平衡后的自来水，溶解氧浓度依次为0.1mg/L、1.5mg/L、2.8mg/L、5.0mg/L、6.4mg/L、8.3mg/L、13.1mg/L和20mg/L的自来水样。从图12中可以看出，在720nm处溶液的吸光度随着水样中溶解氧浓度的增加而增加。吸光度数值与溶解氧氧浓度的高低呈现对应关系。由此可知，通过分光光度计例如使用便携式光度计，本发明的试剂盒可以用于水中溶解氧浓度的定量分析，本领域技术人员根据实际需求也可采用本发明试剂盒进行定量分析。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一种用于溶解氧测定的试纸，其特征在于：包括与氧气反应生成过氧化氢的氧化酶及相应酶底物，以及与过氧化氢反应生成有颜色或带荧光的化合物的显色剂；其中，所述氧化酶及相应酶底物，显色剂负载在载体上，制备成试纸。
2.如权利要求1所述的用于溶解氧测定的试纸，其特征在于：所述氧化酶及相应酶底物选自以下组中的一种或多种：葡萄糖氧化酶及葡萄糖、乳酸氧化酶及乳酸、L-氨基酸氧化酶及L-氨基酸、D-氨基酸氧化酶及D-氨基酸、L-α-羟基酸氧化酶及L-α-羟基酸、尿酸氧化酶及尿酸、醇类氧化酶及醇、醛类氧化酶及醛。
3.如权利要求2所述的用于溶解氧测定的试纸，其特征在于：所述醇类氧化酶及醇选自以下组中的一种或多种：胆固醇氧化酶及胆固醇、乙醇氧化酶及乙醇；所述醛类氧化酶及醛选自以下组中的一种或多种：乙二醛氧化酶及乙二醛、视黄醛氧化酶及视黄醛、牛醛氧化酶及牛醛。
4.如权利要求1所述的用于溶解氧测定的试纸，其特征在于：所述显色剂为其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8独立的选自H、C1-C3的烷基、NH2；
或者，所述的显色剂为4-氨基安替比林与组成的试剂对，其中R9选自OH或NH2，R10、R11、R12、R13、R14独立的选自H、卤素、羧基、磺酸基、羟基或甲氧基。
5.权利要求1-4任一项所述的用于溶解氧测定的试纸，其特征在于，所述载体上还负载催化剂和/或缓冲液。
6.如权利要求5所述的用于溶解氧测定的试纸，其特征在于，所述催化剂包括辣根过氧化物酶或铁基化合物；所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、醋酸-醋酸盐缓冲液、PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
7.一种用于溶解氧测定的比色卡，其特征在于，所述比色卡通过如下步骤制备：
(1)向盛有水的容器中分别通入不同氧气浓度的气体，持续通入气体直至水中溶解氧浓度测量值稳定；
(2)取步骤(1)水样分别加入相同体积溶解氧测试瓶中，水样加满测试瓶，测试瓶中无气泡，盖紧瓶盖，摇晃后静置2-5min，观察颜色变化；所述测试瓶内置有权利要求1-6任一项所述的试纸；
(3)记录不同溶解氧浓度的水样颜色制作成溶解氧比色卡。
8.一种用于溶解氧测定的试剂盒，其特征在于：包括氧化酶及相应酶底物和显色剂；其中，所述氧化酶催化酶底物与氧气反应生成过氧化氢；所述显色剂与过氧化氢反应生成有颜色或带荧光的化合物。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述氧化酶及相应酶底物，显色剂负载在载体上，制备成试纸。
10.如权利要求8-9任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括带瓶盖的测试瓶。
11.如权利要求8-9任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括权利要求7所述的用于溶解氧测定的比色卡。
12.一种溶解氧的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将与氧气反应生成过氧化氢的氧化酶及相应酶底物与待测样品相接触；将与过氧化氢反应生成有颜色或带荧光的化合物的显色剂与待测样品相接触；根据接触后待测样品的颜色深浅或荧光的强弱判断溶解氧的浓度；其中，所述的氧化酶及相应酶底物和所述的显色剂同时或者顺序与检测样品接触。
13.如权利要求12所述的检测方法，其特征在于：所述的判断溶解氧的浓度采用目视法。
14.如权利要求12或13所述的检测方法，其特征在于：
所述的检测方法的检测温度不高于35℃；
和/或，测试瓶内所述氧化酶的浓度不小于1U/mL；
和/或，水样中硫氢根浓度小于1mg/L。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |