CN107748164A - 一种基于负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法及其应用 - Google Patents

一种基于负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于模拟酶、分析化学技术领域，涉及类过氧化物模拟酶的制备，尤其涉及一种基于负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法及其应用。本发明首先采用模板法和原位还原法制备得到负载型Pd/C类过氧化物酶，然后将定性滤纸置于含有Pd/C类过氧化物酶和TMB的醋酸盐缓冲溶液中浸泡并真空干燥，制得试纸。所述试纸在使用时，先配制一定浓度梯度的过氧化氢溶液，将所得试纸置于溶液中并取出，利用颜色识别器读取试纸上的颜色值R、G、B，并将数据采用组合方式建立与过氧化氢浓度的线性关系，即可用于过氧化氢的检测。本发明所公开的基于Pd/C类过氧化物酶的比色试纸，具有方便携带、操作快速简便、分析成本低的优点，对过氧化氢响应灵敏，有良好的特异性。

Description

一种基于负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于模拟酶、分析化学技术领域，涉及类过氧化物模拟酶的制备，尤其涉及一种基于负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法及其应用。
背景技术
作为信号分子调节物质能量代谢，H2O2是生命体内重要的代谢中间产物，许多物质如葡萄糖通过酶降解反应可生成过氧化氢，通过检测过氧化氢能够间接检测目标物。H2O2还被用于食品、药品、消毒剂、工业漂白剂和家用产品的生产，因而H2O2含量测定在食品、化学、生物学、临床医药和环境保护等领域具有重要意义。
天然酶在催化反应中效率高、专一性强，然而大多数天然酶是蛋白质，其活性极易受到环境因素如pH、温度等的影响，稳定性差、易失活；此外，天然酶的制备、提纯和储存过程中需要特殊的设备，费用较高。近年来，人工模拟酶由于稳定性好、制备简单等优点，在生物化学检测、医学疾病诊断等方面具有良好的应用前景。利用酶催化过氧化氢氧化显色底物发生显色反应可以用来测定过氧化氢浓度。
现有过氧化氢的检测技术包括高效液相色谱法、紫外分光光度法、荧光光谱法等，例如中国专利CN103399073A《一种用于过氧化氢检测的基于聚吡咯涂覆锰纳米线的电化学传感器制备方法》公开了一种基于聚吡咯涂覆锰纳米线的新型电极用于过氧化氢的检测，聚吡咯涂覆锰纳米线能够为H2O2的电化学检测提供一个微环境，导致增强的电流反应。中国专利CN103760160A《一种过氧化氢的比色检测方法》公开了一种利用二硫化钼催化过氧化氢与显色剂的显色反应检测过氧化氢，通过紫外分光光度计或目视比色法来定量或半定量测定过氧化氢浓度。
然而，上述公开的检测方法大多需要昂贵的仪器，操作复杂，还需要专门的技术人员，且费用高、周期长，成本相对较高，无法实现快速、简便检测和普及。因此，开发一种操作简便、快速、成本低廉、准确的过氧化氢检测技术，具有重要的研究价值和实际应用价值。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明的一个目的是公开了一种负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法。
一种负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）配制50 mL质量浓度为2～5%的三乙醇胺水溶液，优选浓度为2.72%，在80℃下搅拌30 min；
（2）将0.76～2.2 g十六烷基三甲基溴化铵和0.336～2.88 g水杨酸钠加入上述溶液中继续搅拌1 h，其中十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸钠的摩尔比为1:1～3，优选比为1:1，再加入6.53～7.93 g正硅酸四乙酯，优选加入7.46 g正硅酸四乙酯，反应1～4 h，优选反应2h，得到的产物用盐酸和甲醇回流，随后离心、洗涤、真空干燥，得到SiO2纳米颗粒；
（3）将0.5～1.2 gSiO2纳米颗粒和0.5～4.8 g盐酸多巴胺均匀分散于200 ml pH值为8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，所述SiO2和盐酸多巴胺的质量比为1:1～4，优选质量比为1:2，加入2 ml的0.25 mol/L K2PdCl4在30℃下搅拌10～36 h，优选24 h，得到的产物离心水洗，冷冻干燥，得到Pd/PDA@SiO2复合材料；
（4）将所制得的Pd/PDA@SiO2复合材料放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在600～800℃下保持1～2 h，优选800℃下保持2 h，冷却至室温，取出得到负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒；
（5）将负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒加入5%HF溶液中搅拌反应8～20 h，其中所述Pd/C@SiO2纳米颗粒与5%HF溶液的质量体积比为1g:200～400ml，优选反应12 h，产物离心、水洗、冷冻干燥，得到负载型Pd/C类过氧化物酶。
本发明的另外一个目的，公开了一种所制得的负载型Pd/C类过氧化物酶的应用，即将其制作成基于Pd/C类过氧化物酶的比色试纸。
一种基于Pd/C类过氧化物酶的比色试纸的制备方法，包括：
（1）量取醋酸盐缓冲溶液，通入氮气以除氧，依次加入分散于醋酸盐缓冲液的0.33 mg/ml负载型Pd/C类过氧化物酶和5 mmol/L的TMB，混合均匀，其中醋酸盐缓冲溶液和负载型Pd/C类过氧化物酶溶液及TMB的体积比为10mL：200 μL：400 μL；
（2）将中速定性滤纸浸泡在溶液中0.2～2 min后取出，在35℃下真空干燥3～10 h，即得。
本发明较优实施例中，所述醋酸盐缓冲液pH为3（0.2 M）。
本发明的第三个目的在于，公开了所述基于Pd/C类过氧化物酶的比色试纸的使用方法，包括如下步骤：
（1）分别量取1～2 ml的醋酸盐缓冲液，各加入0.98 mM的过氧化氢溶液20 μL、40 μL、60 μL、90 μL、125 μL、160 μL、200 μL、260 μL、320 μL、400 μL、500 μL和600 μL，混合均匀，得到的溶液中过氧化氢浓度分别为10 μM、20 μM、30 μM、45 μM、60 μM、80 μM、100 μM、130 μM、160 μM、200 μM、250 μM和300 μM；
（2）在上述不同浓度的过氧化氢溶液中分别放入基于Pd/C类过氧化物酶的比色试纸，等待20秒后取出，待试纸显色，采用颜色识别软件选择试纸中间区域，从而将复杂的颜色转变为简单的RGB数值，通过组合数据构建与过氧化氢浓度梯度的线性关系，得到标准线性回归方程，从而实现对待测过氧化氢浓度的快捷检测分析。
本发明较优实施例中，所述醋酸盐缓冲液pH为3（0.2 M）。
本发明较优实施例中，所述待测过氧化氢的可检测浓度范围为0～300 μM。
在本说明书中，术语“类过氧化物酶”是指具有过氧化物酶催化活性的材料。具体地，本发明的类过氧化物酶以过氧化氢作为电子受体，通过氧化相应底物生成有色物质，用于比色检测。
在本说明书中，术语“TMB”是化合物“3,3’5,5’-四甲基联苯胺”的缩写名称，二者可互换使用。
在本说明书中，术语“Pd/C”是指Pd纳米颗粒负载于C上而形成的类过氧化物酶，二者可互换使用。
有益效果
本发明首先采用模板法和原位还原法制备负载型Pd/C类过氧化物酶，然后将定性滤纸置于含有Pd/C类过氧化物酶和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的醋酸盐缓冲溶液中浸泡并真空干燥，制得试纸。所述检测方法先配制一定浓度梯度的过氧化氢溶液，将试纸插入溶液中并取出，利用颜色识别器读取试纸上的颜色值R、G、B数据采用组合方式建立与过氧化氢浓度的线性关系，从而达到对待测过氧化氢溶液的分析。本发明灵敏度高、选择性好、稳定性高、响应时间快，试纸制备过程简单，经济实用，具有操作快速、简便、检测成本低的优点。
附图说明
图1为制备的类过氧化物酶Pd/C的TEM图（A）、Pd NPs的粒径分布图（B）、BET图（C）和XRD图（D）；
图2为不同反应体系反应15 min时的紫外-可见吸收光谱；
图3为检测温度（A）和缓冲液pH值对类过氧化物酶活性的影响；
图4为H2O2+TMB+Pd/C体系对TMB（A）和H2O2（B）的反应动力学测量；
图5为H2O2+TMB+Pd/C体系在652 nm处的吸光度值与过氧化氢浓度的关系图；
图6为利用制备的传感试纸检测过氧化氢的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明，以使本领域技术人员更好地理解本发明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1
负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法，包括如下步骤：
1）配制50 mL质量浓度为2%的三乙醇胺水溶液，在80℃温度下搅拌30 min；
2）随后将0.76 g十六烷基三甲基溴化铵和0.336 g水杨酸钠加入上述溶液中继续搅拌1h，最后加入6.53 g正硅酸四乙酯，反应1 h，得到的产物用盐酸和甲醇回流，随后离心、洗涤、真空干燥，得到SiO2纳米颗粒；
3）取上述制备的0.5 g SiO2和0.5 g盐酸多巴胺均匀分散于200 ml pH值为8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，随后加入2 ml的0.25 mol/L K2PdCl4在30℃下搅拌12 h，得到的产物离心水洗，冷冻干燥，得到Pd/PDA@SiO2复合材料；
4）将上述干燥的产物放入管式炉中，在氮气气流中进行碳化，在600℃下保持2 h，反应后冷却至室温，取出得到负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒；
5）将上述得到的产物加入80 ml的5%HF溶液中搅拌反应8 h，产物离心、水洗、冷冻干燥，即可得到负载型Pd/C类过氧化物酶。
实施例2
负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法，包括如下步骤：
1）配制50 mL质量浓度为2%的三乙醇胺水溶液，在80℃温度下搅拌30min；
2）随后将0.76 g十六烷基三甲基溴化铵和0.672 g水杨酸钠加入上述溶液中继续搅拌1 h，最后加入6.53 g正硅酸四乙酯，反应2 h，得到的产物用盐酸和甲醇回流，随后离心、洗涤、真空干燥，得到SiO2纳米颗粒；
3）取上述制备的0.5 g SiO2和1.0 g盐酸多巴胺均匀分散于200 ml pH值为8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，随后加入2 ml的0.25 mol/L K2PdCl4在30℃下搅拌24 h，得到的产物离心水洗，冷冻干燥，得到Pd/PDA@SiO2复合材料；
4）将上述干燥的产物放入管式炉中，在氮气气流中进行碳化，在800℃下保持1 h，反应后冷却至室温，取出得到负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒；
5）将上述得到的产物加入120 ml的5%HF溶液中搅拌反应16 h，产物离心、水洗、冷冻干燥，即可得到负载型Pd/C类过氧化物酶。
实施例3
负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法，包括如下步骤：
1）配制50 mL质量浓度为3%的三乙醇胺水溶液，在80℃温度下搅拌30 min；
2）随后将0.76 g十六烷基三甲基溴化铵和1.008 g水杨酸钠加入上述溶液中继续搅拌1 h，最后加入7.93 g正硅酸四乙酯，反应4 h，得到的产物用盐酸和甲醇回流，随后离心、洗涤、真空干燥，得到SiO2纳米颗粒；
3）取上述制备的1.2 g SiO2和2.4 g盐酸多巴胺均匀分散于200 ml pH值为8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，随后加入2 ml的0.25 mol/L K2PdCl4在30℃下搅拌32 h，得到的产物离心水洗，冷冻干燥，得到Pd/PDA@SiO2复合材料；
4）将上述干燥的产物放入管式炉中，在氮气气流中进行碳化，在800℃下保持2h，反应后冷却至室温，取出得到负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒；
5）将上述得到的产物加入120 ml的5%HF溶液中搅拌反应20 h，产物离心、水洗、冷冻干燥，即可得到负载型Pd/C类过氧化物酶。
实施例4
1）配制50 mL质量浓度为2%的三乙醇胺水溶液，在80℃温度下搅拌30 min；
2）将0.76 g十六烷基三甲基溴化铵和2.88 g水杨酸钠加入上述溶液中继续搅拌1 h，最后加入7.93 g正硅酸四乙酯，反应4小时，得到的产物用盐酸和甲醇回流，随后离心、洗涤、真空干燥，得到SiO2纳米颗粒；
3）将0.5 g的SiO2纳米颗粒和0.5 g的盐酸多巴胺均匀分散于200 ml pH值为8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，随后加入2 ml的0.25 mol/L K2PdCl4在30℃下搅拌10 h，得到的产物离心水洗，冷冻干燥，得到Pd/PDA@SiO2复合材料；
4）将所制得的Pd/PDA@SiO2复合材料放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在600℃下保持1 h，冷却至室温，取出得到负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒；
5）将负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒加入80 ml 5%HF溶液中搅拌反应8 h，产物离心、水洗、冷冻干燥，得到负载型Pd/C类过氧化物酶。
实施例5
1）配制50 mL质量浓度为5%的三乙醇胺水溶液，在80℃温度下搅拌30 min；
2）将2.2 g十六烷基三甲基溴化铵和2.88 g水杨酸钠加入上述溶液中继续搅拌1 h，最后加入7.93 g正硅酸四乙酯，反应4小时，得到的产物用盐酸和甲醇回流，随后离心、洗涤、真空干燥，得到SiO2纳米颗粒；
3）将1.2 g的SiO2纳米颗粒和2.4 g的盐酸多巴胺均匀分散于200 ml pH值为8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，随后加入2 ml的0.25 mol/L K2PdCl4在30℃下搅拌36 h，得到的产物离心水洗，冷冻干燥，得到Pd/PDA@SiO2复合材料；
4）将所制得的Pd/PDA@SiO2复合材料放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在700℃下保持1 h，冷却至室温，取出得到负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒；
5）将负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒加入80 ml 5%HF溶液中搅拌反应20 h，产物离心、水洗、冷冻干燥，得到负载型Pd/C类过氧化物酶。
实施例6
1）配制50 mL质量浓度为2%的三乙醇胺水溶液，在80℃温度下搅拌30 min；
2）将2.2 g十六烷基三甲基溴化铵和2.88 g水杨酸钠加入上述溶液中继续搅拌1 h，最后加入7.93 g正硅酸四乙酯，反应1小时，得到的产物用盐酸和甲醇回流，随后离心、洗涤、真空干燥，得到SiO2纳米颗粒；
3）将1.2 g的SiO2纳米颗粒和4.8 g的盐酸多巴胺均匀分散于200 ml pH值为8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，随后加入2 ml的0.25 mol/L K2PdCl4在30℃下搅拌36 h，得到的产物离心水洗，冷冻干燥，得到Pd/PDA@SiO2复合材料；
4）将所制得的Pd/PDA@SiO2复合材料放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在800℃下保持2 h，冷却至室温，取出得到负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒；
5）将负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒加入120 ml 5%HF溶液中搅拌反应20 h，产物离心、水洗、冷冻干燥，得到负载型Pd/C类过氧化物酶。
实施例7
1）配制50 mL质量浓度为5%的三乙醇胺水溶液，在80℃温度下搅拌30 min；
2）将0.76 g十六烷基三甲基溴化铵和2.88 g水杨酸钠加入上述溶液中继续搅拌1 h，最后加入7.93 g正硅酸四乙酯，反应1小时，得到的产物用盐酸和甲醇回流，随后离心、洗涤、真空干燥，得到SiO2纳米颗粒；
3）将1.2 g的SiO2纳米颗粒和4.8 g的盐酸多巴胺均匀分散于200 ml pH值为8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，随后加入2 ml的0.25 mol/L K2PdCl4在30℃下搅拌36 h，得到的产物离心水洗，冷冻干燥，得到Pd/PDA@SiO2复合材料；
4）将所制得的Pd/PDA@SiO2复合材料放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在800℃下保持2 h，冷却至室温，取出得到负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒；
5）将负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒加入120 ml 5%HF溶液中搅拌反应20 h，产物离心、水洗、冷冻干燥，得到负载型Pd/C类过氧化物酶。
实施例8
Pd/C催化过氧化氢氧化其底物反应的实验
1）体系一：取2.75 mL 0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为3），依次向其中加入0.1 mL 5 mM的TMB、0.1 mL 9.8 M的过氧化氢溶液和0.05 mL 0.33 mg/mL分散于醋酸盐缓冲液的Pd/C，然后将上述溶液混合均匀；体系二：取2.8 mL 0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为3），依次向其中加入0.1 mL 9.8 M的过氧化氢溶液和0.05 mL 0.33 mg/mL分散于醋酸盐缓冲液的Pd/C，然后将上述溶液混合均匀；体系三：取2.85 mL 0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为3），依次向其中加入0.1 mL 5 mM 的TMB和0.05 mL 0.33 mg/mL分散于醋酸盐缓冲液的Pd/C，然后将上述溶液混合均匀；体系四：取2.9 mL 0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为3），依次向其中加入0.1 mL 5mM 的TMB和0.1 mL 9.8 M的过氧化氢溶液，然后将上述溶液混合均匀；
2）将步骤1）中各体系所得混合液分别在30℃水浴中反应35 min；
3）用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外-可见吸收光谱。
实验结果如图2所示，图1的四条光谱是四个反应体系对应的紫外可见吸收光谱图，由图可见H2O2+Pd/C、TMB+ Pd/C和H2O2+TMB三个体系几乎没有吸收峰，只有H2O2+TMB+Pd/C体系有明显吸收峰且在TMB的特征峰652 nm处峰形很好。
实施例9
Pd/C催化过氧化氢氧化其底物反应对过氧化氢浓度的响应
1)取2.75 mL醋酸盐缓冲液（pH=3）于5 mL离心管中，依次加入0.05 mL Pd/C的醋酸盐分散液（浓度为0.33 mg/mL）、0.1 mL 5 mM的TMB、0.1 mL过氧化氢水溶液。调控使反应液中过氧化氢的最终浓度为5、10、30、50、100、200、300、600、1000、2000 μmol/L。然后将上述溶液混合均匀，将反应液置于35℃水浴中15min；
2）然后对上述反应液进行紫外-可见吸收光谱检测分析，用在652 nm处的吸收峰的吸光度值对过氧化氢浓度作图，实验结果如图5所示。由图可见，Pd/C催化过氧化氢氧化TMB显色反应在652 nm处的吸光度随着过氧化氢的浓度增加而增加，当过氧化氢的浓度在5～300μmol/L范围内时，在652 nm处的吸光度与过氧化氢浓度成线性关系。因此，所述的负载型Pd/C类过氧化物酶对于过氧化氢的可检测范围是0～300 μmol/L。
实施例10
一种用于检测过氧化氢的比色试纸的制备及检测方法，包括如下步骤：
1)取10 ml醋酸盐缓冲溶液，向溶液中通入氮气30min以除去大部分氧气，随后依次加入200 μL分散于醋酸盐缓冲液的0.33 mg/ml的Pd/C和400 μL 5 mmol/L的TMB，然后将体系混合均匀；
2）将中速定性滤纸剪成1 cm×1 cm的小片，浸泡在上述步骤（1）溶液中，
0.5 min后取出，在35℃下真空干燥8 h，保存，得到用于检测过氧化氢的比色试纸。
采用上述比色试纸进行过氧化氢检测的方法，包括如下步骤：
1）取1～2 ml的醋酸盐缓冲液，依次加入0.98 mM的过氧化氢溶液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、90 μL、125 μL、160 μL、200 μL、260 μL、320 μL、400 μL、500 μL或600 μL，然后将溶液混合均匀。使上述步骤得到的溶液中过氧化氢浓度依次为0 μM、10 μM、20 μM、30 μM、45μM、60 μM、80 μM、100 μM、130 μM、160 μM、200 μM、250 μM或300 μM；
2）将试纸(1 cm×1 cm)依次插入不同浓度的过氧化氢溶液中，待15秒后取出试纸，试纸显色后，利用颜色识别软件读取出试纸颜色的RGB值，组合这三个颜色值构建参数，建立颜色参数值与过氧化氢浓度的关系。实验结果如图6所示，颜色参数值与过氧化氢的浓度成线性关系，可检测范围是0～300 μM。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）配制50 mL质量浓度为2～5%的三乙醇胺水溶液，在80℃下搅拌30 min；
（2）将0.76～2.2 g十六烷基三甲基溴化铵和0.336～2.88 g水杨酸钠加入上述溶液中继续搅拌1 h，其中十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸钠的摩尔比为1:1～3，再加入6.53～7.93 g正硅酸四乙酯，反应1～4 h，得到的产物用盐酸和甲醇回流，随后离心、洗涤、真空干燥，得到SiO2纳米颗粒；
（3）将0.5～1.2 gSiO2纳米颗粒和0.5～4.8 g盐酸多巴胺均匀分散于200 ml pH值为8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，SiO2和盐酸多巴胺的质量比为1:1～4，加入2 ml的0.25 mol/LK2PdCl4在30℃下搅拌10～36 h，得到的产物离心水洗，冷冻干燥，得到Pd/PDA@SiO2复合材料；
（4）将所制得的Pd/PDA@SiO2复合材料放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在600～800℃下保持1～2 h，冷却至室温，取出得到负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒；
（5）将负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒加入5%HF溶液中搅拌反应8～20 h，其中所述Pd/C@SiO2纳米颗粒与5%HF溶液的质量体积比为1g:200～400ml，产物离心、水洗、冷冻干燥，得到负载型Pd/C类过氧化物酶。
2.根据权利要求1所述负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述配制50 mL质量浓度为2.72%的三乙醇胺水溶液。
3.根据权利要求1所述负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸钠的摩尔比为为1:1，再加入7.46 g正硅酸四乙酯，反应2 h。
4.根据权利要求1所述负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述使SiO2和盐酸多巴胺的质量比为1: 2，加入2 ml的0.25 mol/L K2PdCl4在30℃下搅拌124 h。
5.根据权利要求1所述负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述将所制得的Pd/PDA@SiO2复合材料放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在800℃下保持2h。
6.根据权利要求1所述负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述将负载型Pd/C@SiO2纳米颗粒加入5%HF溶液中搅拌反应12 h。
7.一种根据权利要求1-6任一所述方法制得的负载型Pd/C类过氧化物酶的应用，其特征在于：将所制过氧化物酶制作成基于Pd/C类过氧化物酶的比色试纸，并用于检测过氧化氢。
8.根据权利要求7所述负载型Pd/C类过氧化物酶的应用，其特征在于，所述基于Pd/C类过氧化物酶的比色试纸的制作方法包括：
（1）量取醋酸盐缓冲溶液，通入氮气以除氧，依次加入分散于醋酸盐缓冲液的0.33 mg/ml负载型Pd/C类过氧化物酶和5 mmol/L的TMB，混合均匀，其中醋酸盐缓冲溶液和负载型Pd/C类过氧化物酶溶液及TMB的体积比为10mL：200 μL：400 μL；
（2）将中速定性滤纸浸泡在溶液中0.2～2 min后取出，在35℃下真空干燥3～10 h，即得。
9.根据权利要求7所述负载型Pd/C类过氧化物酶的应用，其特征在于，所述用于检测过氧化氢，包括：
（1）分别量取1～2 ml的醋酸盐缓冲液，各加入0.98 mM的过氧化氢溶液20 μL、40 μL、60 μL、90 μL、125 μL、160 μL、200 μL、260 μL、320 μL、400 μL、500 μL和600 μL，混合均匀，得到的溶液中过氧化氢浓度分别为10 μM、20 μM、30 μM、45 μM、60 μM、80 μM、100 μM、130 μM、160 μM、200 μM、250 μM和300 μM；
（2）在上述不同浓度的过氧化氢溶液中分别放入基于Pd/C类过氧化物酶的比色试纸，等待20秒后取出，待试纸显色，采用颜色识别软件选择试纸中间区域，从而将复杂的颜色转变为简单的RGB数值，通过组合数据构建与过氧化氢浓度梯度的线性关系，得到标准线性回归方程，实现对待测过氧化氢浓度的检测。
10.根据权利要求8或9所述负载型Pd/C类过氧化物酶的应用，其特征在于：所述醋酸盐缓冲液pH为3；所述待测过氧化氢的可检测浓度范围为0～300 μM。
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