CN110632137A - 基于亚甲基蓝可控释放的免固定免标记光致电化学microRNA传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物传感技术领域,涉及基于亚甲基蓝可控释放的免固定免标记光致电化学microRNA传感器及其应用。本发明传感器包括光活性材料封装复合体、核酸水解酶和光致电化学检测装置,所述光活性材料封装复合体包括表面氨基化介孔二氧化硅纳米粒子NMSNs、亚甲基蓝MB和封孔核酸探针。封孔核酸探针通过静电作用吸附在NMSNs表面,并将MB封装在NMSNs内部,封孔核酸探针具有与待检测microRNA发生互补配对的碱基序列。该传感器用核酸杂交互补配对进行分子识别,具有极高选择性,而且免去了光活性材料及识别探针在电极上的固定,无需对核酸探针进行标记,具有成本低、操作简单、方便快捷等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物传感技术领域,涉及基于亚甲基蓝可控释放的免固定免标记光致电化学microRNA传感器及其应用。
背景技术
光电化学过程是指分子、离子或半导体材料等因吸收光子而使电子受激发产生电荷传递,从而实现光能向电能的转化过程。光致电化学传感器就是将能够产生光电化学过程、并产生检测信号的光电活性材料,与生物识别原件相结合而发展起来的。这种传感器的检测信号,即光电流,与被检测目标物的浓度之间成比例关系。与传统的生物传感器相比,光致电化学传感器的优势主要表现在:(1)背景信号低,该传感器采用光作为激发源、电作为检测信号,因此激发光源与检测信号的完全分离,使得该传感器具有低背景信号;(2)抗干扰能力强,由于测试体系无需施加外电压,能有效避免易发生氧化还原的电活性物质在电极表面发生反应,从而提高了传感器的抗干扰能力;(3)能实现简单快速、实时检测,由于检测过程无需外加电压,仅需要简单的电流表和合适的光源便可以实现检测,故检测设备易携带,易实现实时检测。
在传统的光致电化学生物传感检测中,无论是识别分子或信号探针在电极表面的修饰过程,都会延长目标分析物检测时间,因此相较于固定修饰过程,免固定技术能够简化检测程序,缩短检测时间,从而能够实现简单、快速、灵敏、高效的目标物检测。
MicroRNA是含有19-25个核苷酸的非编码小分子RNA,其主要功能是调节生物体生长、发育和疾病发生过程中有关基因的表达。microRNA可以作为诱癌基因参与肿瘤的发生和发展,又可以作为抑癌基因控制肿瘤的形成。因此,microRNA的研究对癌症的预防和治疗具有重要意义。传统检测microRNA的方法有RNA印迹法、逆转录聚合酶链式反应和基因芯片法。RNA印迹法耗时复杂,需要放射性标记并且检测限较高;RT-PCR和基因芯片虽然灵敏度高,但是检测仪器设备昂贵。发展高效低耗费的microRNA检测技术从而成为关键。
因此,设计制备免固定免标记光致电化学生物传感器,实现microRNA的简单、方便、高灵敏、高特异性检测,具有重要的科学研究意义及实用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷,构建了基于亚甲基蓝可控释放的免固定免标记光致电化学microRNA传感器,还提供了利用该传感器检测microRNA的应用方法,能够实现简单、快速、灵敏、高效的microRNA检测。
本发明是采用以下技术方案实现的:
本发明提供了一种基于亚甲基蓝可控释放的免固定免标记光致电化学microRNA传感器,所述传感器包括光活性材料封装复合体、核酸水解酶和光致电化学检测装置,所述光活性材料封装复合体包括表面氨基化介孔二氧化硅纳米粒子NMSNs、亚甲基蓝MB和封孔核酸探针。封孔核酸探针通过静电作用吸附在NMSNs表面,并将MB封装在NMSNs内部,封孔核酸探针具有与待检测microRNA发生互补配对的碱基序列,所述光致电化学检测装置采用三电极检测体系,所用光源为单一波长光源。
其中,所述待检测microRNA的序列如SEQ ID NO.1所示;封孔核酸探针的序列如SEQ ID NO.2所示,核酸水解酶为核酸外切酶Exo III。
本发明还提供了一种利用上述免固定免标记光致电化学microRNA传感器检测microRNA的方法:封孔核酸探针与溶液中游离的待检测microRNA特异性结合,形成双螺旋结构,使封孔核酸探针从NMSNs表面脱离,导致MB释放到溶液中,随后核酸水解酶切割双螺旋结构中的封孔核酸探针,释放microRNA继续结合NMSNs表面的封孔核酸探针,释放更多MB,从而导致溶液中MB的浓度进一步升高,然后通过光致电化学检测获得光电流信号值变化,经数据处理后获得microRNA的存在情况和存在浓度。
上述方法具体包括以下步骤:
A:制备光活性材料封装复合体;
B:将步骤A制备的光活性材料封装复合体分别与待检测microRNA的标准溶液、待测熔液混合,37℃恒温孵育,之后加入核酸水解酶Exo III,混匀后进行37℃恒温孵育;
C:向步骤B的体系中加入抗坏血酸溶液,将所得混合溶液作为电解质液,利用三电极体系测试光电流值;根据标准溶液的光电流变化作标准曲线,建立光电流变化值与microRNA浓度的回归方程,利用待测溶液的光电流值,计算待测溶液中的microRNA浓度。
其中,所述步骤A中光活性材料封装复合体的制备方法包括以下步骤:
(1)取0.1~0.3g十六烷基三甲基溴化铵溶于60~150mL超纯水中,向其中加入500~1000μL NaOH溶液,在80℃下搅拌10~30分钟;取1~2mL四乙基原硅酸盐加入到上述溶液中,搅拌1~2小时,有大量白色沉淀产生;将反应产物过滤,用超纯水、甲醇分别将下层沉淀洗涤三次,干燥后即得到粗制的介孔二氧化硅纳米粒子;
(2)取0.1~0.2g步骤(1)的产品,加入1~2mL质量浓度为37%的盐酸溶液,50~100mL甲醇,回流10~20小时,然后过滤,用超纯水、甲醇分别洗涤若干次,最后在60℃条件下干燥4~8小时,获得的白色粉末即为精制的介孔二氧化硅纳米粒子;
(3)取10~30mg步骤(2)的产品,超声分散在0.5~2mL乙醇中,加入500~1000μL3-氨基丙基三乙氧基矽烷,搅拌10~20小时,将得到的白色产物用5000~10000rpm转速离心,分别用无水乙醇、超纯水洗涤若干次,离心,取下层沉淀,干燥后得到NMSNs;
(4)取10~30mg步骤(3)的产品,加入500~1500μL浓度为1~3mM亚甲基蓝溶液中,室温下震荡6~18小时;之后加入100~200μL浓度为10~30μM的封孔核酸探针,震荡4~8小时;最后采用1000~3000rpm的转速离心,获得的下层沉淀即为光活性材料封装复合体,将其分散在0.5~2mL PBS缓冲体系中备用。
所述步骤B中,将microRNA与光活性材料封装复合体混合,在37℃孵育1~6小时,之后加入5~10U核酸外切酶,37℃孵育15~90分钟。
所述步骤C中,抗坏血酸溶液浓度为0.2M,采用三电极法进行光致电化学测量,三电极包括氧化铟锡导电玻璃ITO电极、Ag/AgCl电极和铂丝电极,依次作为工作电极、参比电极和对电极;所述光致电化学测量是在交替开关灯的情况下测量体系的光电流值,所用激发光源波长为627nm,电压设定为0V。
本发明还保护上述方法在制备和/或检测待测样本中含有microRNA的试剂盒中的应用。
本发明提供了一种基于亚甲基蓝可控释放的免固定免标记光致电化学microRNA传感器,能够实现简单、快速、灵敏、高效的microRNA检测。取得了如下有益效果:
(1)本发明所述的免固定免标记光致电化学microRNA传感器,免去光活性材料在电极表面的固定修饰过程,简化组装过程;
(2)本发明所述的免固定免标记光致电化学microRNA传感器采用核酸杂交互补配对进行分子识别,不仅具有极高选择性,而且无需对核酸探针进行标记,还具有成本低、操作简单等优点;
(3)本发明所述的免固定免标记光致电化学microRNA传感器,无需昂贵仪器设备,有助于实现microRNA检测的微型化、便携化和集成化。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。
在附图中:
图1为实施例1的光致电化学三电极检测装置结构示意图。
图2为实施例1的光活性材料封装复合体MB@NMSNs@csDNA组装过程示意图。
图3为实施例1中光致电化学生物传感器检测microRNA的原理图。
图4为实施例1中精制MSN的透射电镜TEM结果图。
图5为实施例1中不同浓度microRNA的光电流检测值,曲线a-k分别对应0fM、0.1fM、0.5fM、1fM、5fM、10fM、50fM、100fM、200fM、600fM和1000fM浓度的microRNA标准溶液。
图6为以图5中microRNA浓度的对数值作为横坐标,以不同microRNA浓度下测得的光电流变化值作为纵坐标的线性关系图。
图7为实施例2中分别检测待检测microRNA和3种干扰microRNA所得的光电流变化值。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白,下面结合附图,对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内相关文献所描述的技术或条件、或者按照产品说明书进行;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
主要设备:利用三电极法进行光致电化学测量(如图1所示),三电极包括氧化铟锡导电玻璃ITO电极、Ag/AgCl电极和铂丝电极,分别作为工作电极、参比电极和对电极;所用激发光源的波长为627nm。
上述ITO电极在1.0mM的NaOH溶液中浸泡5-8小时,然后用超纯水充分淋洗并用氮气吹干后即可使用。
下列实施例所采用的microRNA序列如SEQ ID NO.1所示,命名为microRNA-155,与microRNA碱基序列互补的封孔核酸探针的序列如SEQ ID NO.2所示,命名为csDNA。
SEQ ID NO.1:5'-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3′
SEQ ID NO.2:5'-TATCACGATTAGCATTAA-3'
下列实施例所采用的光活性材料封装复合体的制备过程,原理如图2所示。
以与目标microRNA互补的csDNA探针作为封孔单元,将光活性材料亚甲基蓝(MB)封装在表面氨基化的介孔二氧化硅纳米粒子(NMSNs)中,用于microRNA的检测。首先将介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)表面正电荷化,亚甲基蓝分子利用扩散作用分布到NMSNs的孔道中,之后由于静电吸附作用,csDNA探针作为封孔物吸附到NMSNs表面,将亚甲基蓝封装在NMSNs内。
下列实施例所采用的检测方法,原理如图3所示:
在没有目标物microRNA存在的情况下,探针csDNA作为封孔物依然吸附在NMSNs表面,形成的MB@NMSNs@csDNA结构使得MB无法从NMSNs中释放,此时会有较弱的光电流信号输出;当存在目标microRNA时,目标microRNA与探针csDNA杂交形成刚性双螺旋结构,使得csDNA探针从NMSNs表面脱离,MB@NMSNs@csDNA结构遭到破坏,进而导致亚甲基蓝释放。随后核酸外切酶Exo III切割双螺旋结构中的探针csDNA,释放目标microRNA继续引发杂交-酶切循环,从而释放更多的亚甲基蓝,此时,有较强的光电流信号输出。通过光电流的增加值与目标microRNA浓度的对应关系得出microRNA含量。
实施例1
A:光活性材料封装复合体MB@NMSNs@csDNA的制备:
A1)MSNs的粗制:称取0.25g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶于120mL超纯水中,向其中加入875μL浓度为2M的NaOH溶液,所得反应体系在80℃下搅拌20分钟。取1.25mL四乙基原硅酸盐(TEOS)加入到上述溶液中,剧烈搅拌2小时,有大量白色沉淀产生。过滤,用超纯水、甲醇分别洗涤三次,取下层沉淀,得到粗制MSNs,空气中干燥后收集备用。
A2)MSNs的精制:取0.164g粗制MSNs,加入1.5mL盐酸溶液(质量浓度为37%),75mL甲醇,回流10小时,以去除表面活性剂模板。反应结束后过滤,分别用超纯水、甲醇洗涤多次,取下层沉淀得到精制MSNs,60℃真空干燥4小时后收集备用。采用透射电镜TEM对精制MSNs进行了形貌扫描,如图4所示,所得精制MSNs颗粒大小均匀,粒径在70nm左右,而且在其内部均匀分布着孔道。
A3)NMSNs的制备:20mg MSNs超声分散在1mL无水乙醇中,加入800μL 3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTES)搅拌12小时,以8000rmp转速离心8分钟,分别用乙醇、超纯水洗涤多次,下层沉淀即为NMSNs,37℃干燥收集备用。
A4)取20mg NMSNs,加入1125μL浓度为2mM的亚甲基蓝溶液中,室温下震荡12小时。之后加入125μL浓度为15μM的csDNA溶液,震荡6小时。最后以2000rmp转速离心,获得的下层沉淀即为MB@NMSNs@csDNA复合体。将其分散在1mL PBS缓冲体系中,置于4℃避光保存备用。
B:光致电化学传感器的构建:
取5μL不同浓度的microRNA-155溶液和90μL步骤A4)所制备的MB@NMSNs@csDNA复合体分散液,37℃下孵育2小时,之后加入5μL含有8U的核酸外切酶Exo III溶液,37℃下孵育1小时。
C:采用本发明所述光致电化学传感器检测不同浓度microRNA-155的光电流值:
C1):向步骤A4)所得备用的光活性材料体系液体中加入等体积的0.2M抗坏血酸溶液,将该混合溶液作为电解质溶液,采用三电极体系测试得到光电流响应值,记为I0,并将其作为空白对照。
C2):向步骤B所得光致电化学传感体系液体中加入等体积的0.2M抗坏血酸溶液,采用三电极体系测试得到一系列不同microRNA-155浓度下的光电流响应值,分别记为Ii。
结果如图5所示,随着microRNA浓度从0fM增大到1000fM,所测得的光电流逐渐减小,表明本发明所述光致电化学传感器,能够检测到microRNA-155的浓度变化。
将microRNA-155浓度的对数设为横坐标,将在一系列不同microRNA-155浓度下测得的Ii值与I0的差值,即△I=I0-Ii,设为纵坐标,建立microRNA-155浓度的对数log CmiRNA与光电流变化值△I之间的线性关系,得到线性回归方程:△I=51.98·log CmiRNA+53.35(R2=0.9936),结果如图6所示。利用该标准曲线,可以实现对microRNA-155的定量分析。
实施例2
采用本发明所述光致电化学传感器检测不同种类microRNA的光电流值。
采用实施例1中步骤C所述方法,分别检测10fM microRNA-155和50fM作为干扰的其他种类microRNA,即microRNA-141、microRNA-143和microRNA-199a的光电流值,并计算各光电流值与背景光电流I0的差值△I。其中,microRNA-141、microRNA-143和microRNA-199a的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示:
SEQ ID NO.3:5′-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3′
SEQ ID NO.4:5′-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUCA-3′
SEQ ID NO.5:5′-ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA-3′
结果如图7所示,microRNA-155所对应的光电流差值△I明显高于其他三种干扰micrroRNA对应的光电流差值△I,表明本专利所述光致电化学传感器具有优异的选择性,可以将目标microRNA与体系中可能存在的干扰microRNA区分开。
实施例3
血清样品中microRNA-155的标准加入回收率和相对标准偏差测定。
将血清样品稀释100倍后,加入不同浓度microRNA-155标准溶液,然后用本发明所述光致电化学传感器检测得到microRNA-155平均浓度,计算标准加入回收率和相对标准偏差。结果如表1所示,microRNA-155添加水平分别为1.00fM、10.00fM和100.00fM的血清样品,其回收率在97.8%~103.7%范围内,相对标准偏差不超过3.85%,显示了该方法的可靠性,可用于血清等实际样品中microRNA的检测。
表1.血清样品中microRNA-155的标准加入回收率和相对标准偏差测定
当然,以上仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 基于亚甲基蓝可控释放的免固定免标记光致电化学microRNA传感器及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatcacgatt agcattaa 18
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uaacacuguc ugguaaagau gg 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ugagaugaag cacuguagcu ca 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acaguagucu gcacauuggu ua 22
Claims (8)
1.一种基于亚甲基蓝可控释放的免固定免标记光致电化学microRNA传感器,其特征在于,所述传感器包括光活性材料封装复合体、核酸水解酶和光致电化学检测装置,所述光活性材料封装复合体包括表面氨基化介孔二氧化硅纳米粒子NMSNs、亚甲基蓝MB和封孔核酸探针,封孔核酸探针通过静电作用吸附在NMSNs表面,并将MB封装在NMSNs内部,封孔核酸探针具有与待检测microRNA发生互补配对的碱基序列,所述光致电化学检测装置采用三电极检测体系,所用光源为单一波长光源。
2.根据权利要求1所述的免固定免标记光致电化学microRNA传感器,其特征在于,所述待检测microRNA的序列如SEQ ID NO.1所示;封孔核酸探针的序列如SEQ ID NO.2所示,核酸水解酶为核酸外切酶Exo III。
3.一种利用如权利要求1或2所述的基于亚甲基蓝可控释放的免固定免标记光致电化学microRNA传感器检测microRNA的方法,其特征在于,封孔核酸探针与溶液中游离的待检测microRNA特异性结合,形成双螺旋结构,使封孔核酸探针从NMSNs表面脱离,导致MB释放到溶液中,随后核酸水解酶切割双螺旋结构中的封孔核酸探针,释放microRNA继续结合NMSNs表面的封孔核酸探针,释放更多MB,从而导致溶液中MB的浓度进一步升高,然后通过光致电化学检测获得光电流信号值变化,经数据处理后获得microRNA的存在情况和存在浓度。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
A:制备光活性材料封装复合体;
B:将步骤A制备的光活性材料封装复合体分别与待检测microRNA的标准溶液、待测溶液混合,37℃恒温孵育,之后加入核酸水解酶Exo III,混匀后进行37℃恒温孵育;
C:向步骤B的体系中加入抗坏血酸溶液,将所得混合溶液作为电解质液,利用三电极体系测试光电流值;根据标准溶液的光电流变化作标准曲线,建立光电流变化值与microRNA浓度的回归方程,利用待测溶液的光电流值,计算待测溶液中的microRNA浓度。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤A中光活性材料封装复合体的制备方法包括以下步骤:
(1)取0.1~0.3g十六烷基三甲基溴化铵溶于60~150mL超纯水中,向其中加入500~1000μL NaOH溶液,在80℃下搅拌10~30分钟;取1~2mL四乙基原硅酸盐加入到上述溶液中,搅拌1~2小时,有大量白色沉淀产生;将反应产物过滤,用超纯水、甲醇分别将下层沉淀洗涤三次,干燥后即得到粗制的介孔二氧化硅纳米粒子;
(2)取0.1~0.2g步骤(1)的产品,加入1~2mL质量浓度为37%的盐酸溶液,50~100mL甲醇,回流10~20小时,然后过滤,用超纯水、甲醇分别洗涤若干次,最后在60℃条件下干燥4~8小时,获得的白色粉末即为精制的介孔二氧化硅纳米粒子;
(3)取10~30mg步骤(2)的产品,超声分散在0.5~2mL乙醇中,加入500~1000μL 3-氨基丙基三乙氧基矽烷,搅拌10~20小时,将得到的白色产物用5000~10000rpm转速离心,分别用无水乙醇、超纯水洗涤若干次,离心,取下层沉淀,干燥后得到NMSNs;
(4)取10~30mg步骤(3)的产品,加入500~1500μL浓度为1~3mM亚甲基蓝溶液中,室温下震荡6~18小时;之后加入100~200μL浓度为10~30μM的封孔核酸探针,震荡4~8小时;最后采用1000~3000rpm的转速离心,获得的下层沉淀即为光活性材料封装复合体,将其分散在0.5~2mL PBS缓冲体系中备用。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤B中,将microRNA与光活性材料封装复合体混合,在37℃孵育1~6小时,之后加入5~10U核酸外切酶,37℃孵育15~90分钟。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤C中,抗坏血酸溶液浓度为0.2M,采用三电极法进行光致电化学测量,三电极包括氧化铟锡导电玻璃ITO电极、Ag/AgCl电极和铂丝电极,依次分别作为工作电极、参比电极和对电极;所述光致电化学测量是在交替开关灯的情况下测量体系的电流响应值,所用激发光源波长为627nm,电压设定为0V。
8.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述方法在制备和/或检测待测样本中含有microRNA的试剂盒中的应用。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114774531A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-07-22 | 青岛大学 | 一种用于在细胞内原位检测microRNA的生物传感器 |
CN115219579A (zh) * | 2022-07-29 | 2022-10-21 | 江苏大学 | 一种基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器的构建方法及其应用 |
CN115728363A (zh) * | 2022-09-20 | 2023-03-03 | 首都医科大学 | 一种基于介孔材料释放的crispr-电化学检测核酸的方法 |
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2019
- 2019-10-29 CN CN201911034585.8A patent/CN110632137A/zh not_active Withdrawn
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