CN115728363A - 一种基于介孔材料释放的crispr-电化学检测核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于介孔材料释放的CRISPR‑电化学检测核酸的方法，属于核酸检测技术领域。本发明首次将介孔材料与CRISPR‑电化学检测联合使用进行核酸的检测，在CRISPRCas13a体系中加入与crRNA相匹配的检测目标后，若识别成功，则Cas蛋白发挥“附属切割”作用，对封闭孔洞的RNA进行剪切致其脱落，从而打开介孔纳米二氧化硅的孔洞，电化学指示信号分子得以释放。本发明将CRISPR与电化学分析方法相结合，通过介孔材料的可控释放，进行电化学信号的检测，既发挥了CRISPR精准检测的优点，亦能使电化学分析更为稳定且大量增加电化学检测信号分子，增加了检测的特异性。

Description

一种基于介孔材料释放的CRISPR-电化学检测核酸的方法

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及一种基于介孔材料释放的CRISPR-电化学检测核酸的方法。

背景技术

2019年新冠病毒疫情的出现给全球公共卫生带来了巨大的威胁。为有效控制疫情传播，全球涌现出多种用于病毒快速检测的方法。其中，逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)被广泛用作检测“金标准”，然而，由于PCR检测需要特定的检测实验室、专业的仪器设备以及经验丰富的实验操作人员，所以PCR检测不利于现场快速检测的应用。同时，对于病毒频现的突变体，传统的PCR方法在突变的精准检测方面存在不足。近年来新出现的基于CRISPR/Cas系统的核酸检测方法具有较高的精度。但传统的CRISPR检测手段依赖于荧光，成本较高且不利于现场检测。相比之下，电化学分析具有分析速度块、携带简便等优势，可以弥补CRISPR检测的不足。但电化学检测仍有不足之处，首先修饰于电极表面的检测信号受到环境影响易使检测不稳定，其次，丝网印刷电极检测表面积较小，固定在其表面的检测信号数量受限，对检测的灵敏度影响较大。所以本领域亟需一种既能克服CRISPR检测的不足，又能克服电化学检测所存在的不足的核酸检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种将介孔材料与CRISPR-电化学检测联合使用进行核酸检测的方法，具有即时检测、特异性强、便携的优势。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种基于介孔材料释放的CRISPR-电化学检测核酸的方法，包括如下步骤：将氨基修饰的介孔纳米二氧化硅与电化学指示信号分子混合孵育，用带有负电的单链RNA封闭介孔纳米二氧化硅表面的孔洞，得封闭介孔硅；将待测核酸与CRISPR Cas13a体系混合孵育后，与封闭介孔硅混合孵育，孵育结束后，取上清进行电化学检测；所述CRISPR Cas13a体系含有能够与待测物特异性结合的crRNA。

优选的，所述电化学指示信号分子包括亚甲基蓝。

优选的，所述带有负电的单链RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述待测核酸为经RT-RAA扩增后的待测产物。

优选的，所述进行电化学检测时，用丝网印刷电极进行检测。

优选的，所述待测核酸包括新冠病毒突变株N501Y。

本发明的有益效果：

本发明首次将介孔材料与CRISPR-电化学检测联合使用进行核酸的检测，在CRISPR Cas13a体系中加入与crRNA相匹配的检测目标后，若识别成功，则Cas蛋白发挥“附属切割(collateral cleavage)”作用，对封闭孔洞的RNA进行剪切致其脱落，从而打开介孔纳米二氧化硅的孔洞，电化学指示信号分子得以释放。本发明将CRISPR与电化学分析方法相结合，通过介孔材料的可控释放，进行电化学信号的检测，既发挥了CRISPR精准检测的优点，亦能使电化学分析更为稳定且大量增加电化学检测信号分子，增加了检测的特异性，进而本发明构建了通用的核酸检测平台。本发明方法具有即时检测、特异性强和便携的优势。

附图说明

图1本发明方法检测的原理示意图；

图2包封RNA不同碱基数的比较，其中左图为电化学DPV方法检测结果图，右图是数据处理归一后的结果图。

图3本发明检测方法检测的特异性。

具体实施方式

本发明提供了一种基于介孔材料释放的CRISPR-电化学检测核酸的方法，包括如下步骤：将氨基修饰的介孔纳米二氧化硅与电化学指示信号分子混合孵育，用带有负电的单链RNA封闭介孔纳米二氧化硅表面的孔洞，得封闭介孔硅；将待测核酸与CRISPR Cas13a体系混合孵育后，与封闭介孔硅混合孵育，孵育结束后，取上清进行电化学检测；所述CRISPR Cas13a体系含有能够与待测物特异性结合的crRNA。

本发明为进一步弥补电化学检测的不足，将一种基于介孔材料释放检测信号的方法引入CRISPR-电化学检测中。本发明将核酸、蛋白及其他纳米材料等固定到介孔材料表面，通过控制表面附着材料的状态将包封在介孔材料中的大量信号分子释放出来，通过信号强度的改变实现检测目的。同时，本发明方法一步调控即可释放大量信号分子，增强了检测结果的准确性。目前，现有的介孔材料释放方法较少应用于核酸检测，而本发明将介孔材料信号可控释放与电化学检测相结合，连通CRISPR信号识别的精准性，将更好的完成病毒核酸即时检测的目的。本发明方法检测核酸的原理图如图1所示。

本发明对于氨基修饰的介孔纳米二氧化硅的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规氨基修饰二氧化硅的方法均可。在本发明中，所述电化学指示信号分子优选的包括亚甲基蓝，所述亚甲基蓝优选的为亚甲基蓝溶液，所述亚甲基蓝溶液优选的包括Tris-HCl，NaCl和MgCl₂，所述Tris-HCl，NaCl和MgCl₂的浓度比例关系优选为1:5:1。在本发明中，所述带有负电的单链RNA的碱基数优选为54，所述带有负电的单链RNA的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO.1所示，具体为：

AAUUUUUAAUUUUUAAUUUUUAAUUUUUAAUUUUUAAUUUUUAAUUUUUAAAAA。本发明所述封闭介孔纳米二氧化硅表面孔洞的单链RNA包封序列并不具有识别功能，只是在外部crRNA识别之后被cas蛋白无差别剪切，从而释放介孔材料内部亚甲基蓝。

在本发明中，所述待测核酸优选的为经RT-RAA扩增后的待测产物，将待测物质经RT-RAA扩增后，再进行检测，能够进一步提高检测的效果。本发明对于孵育的时间以及具体取上清的方法没有特殊限定。在本发明中，进行电化学检测时，优选的用丝网印刷电极进行检测，采用丝网印刷电极进行检测方便操作，利于便携检测，而且只需少量的检测液体积，只需50μL即可检测。在本发明中，所述待测核酸优选的包括新冠病毒突变株N501Y。本发明对于CRISPR Cas13a体系中游离的crRNA的具体序列没有特殊限定，需依据待测核酸的具体序列而定。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

以检测新冠病毒N501Y突变株为例，具体检测方法如下：

(1)介孔材料包封：

配置20mM亚甲基蓝缓冲液，缓冲液中包含10mM Tris-HCl，50mM NaCl和10mMMgCl₂。将5mg氨基修饰的介孔纳米二氧化硅颗粒与500μL亚甲基蓝缓冲液混合，孵育过夜。

将20μL(200μM)包封RNA-54(序列如SEQ ID NO.1所示)通过静电吸附作用封闭介孔纳米二氧化硅表面的孔洞，4℃温和震荡12h。反应结束后，应用缓冲液反复离心(4000g，5min)清洗包封后的介孔材料，得到纯化的颗粒，降低背景值。加入200μL缓冲液(10mMTris-HCl，50mM NaCl和10mM MgCl₂)重悬。

取50μL重悬后的封闭介孔硅颗粒，应用丝网印刷电极测量背景值。

(2)样品检测：

RT-RAA扩增：使用RT-RAA扩增试剂盒(奇天，货号B00000)，将待检测核酸样品进行等温扩增。体系如表1所示：

表1 RT-RAA扩增体系

具体步骤为：向装有干粉酶制剂的EP管中加入42.5μL缓冲液IV、2.0μL引物F(10μM)、2.0μL引物R(10μM)；向检测单元管盖上加入2.5μL的乙酸镁；向检测单元管中加入5.0μL待测样本，盖上管盖，上下颠倒充分混匀；将检测单元管放入39℃恒温金属浴中，孵育30min。

CRISPR Cas13a系统孵育：

将RT-RAA扩增后产物加入含有与新冠病毒N501Y突变株相匹配的crRNA(GGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAAC(SEQ ID NO.5)，TGGTAACCAACACCATAAGTGGGTTGGA(SEQID NO.6))的CRISPR孵育体系中，37℃孵育30min，而后将体系转移至核酸包封后的介孔二氧化硅中，孵育30min。

表2 CRISPR孵育体系

电化学检测：

孵育结束后取上清进行电化学检测，电化学工作站参数设置如下：

Differential Pulse Voltammetry

T equilibration：2s

E begin：-0.8V

E end：-0.1V

E step：0.004V

Scan rate：0.04V/s。

对比例1

与实施例1的区别在于介孔材料包封所用的RNA为21碱基，具体序列为AAUUUUUAAUUUUUAAUUUAA(SEQ ID NO.4)，其余均同实施例1。以仅采用RNA进行包封并未与CRISPR Cas13a体系混合孵育的封闭介孔硅作为对照组，分别记为RNA-21组合RNA-54组。将实施例1、2的检测结果与对照组的检测结果进行比较，结果如图2所示，对于不同碱基数的包封RNA，54碱基的序列包封效果更好，利于后续检测实验。

对比例2

分别采用实施例1的方法对新冠病毒P681R及黄热病毒进行检测，与实施例1的区别在于待测核酸样品不一致，其余均同实施例1。将实施例1和此对比例的检测结果进行比较，结果如图3所示。表明本发明检测方法能够对不同病毒进行区分，具有一定特异性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种基于介孔材料释放的CRISPR-电化学检测核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：将氨基修饰的介孔纳米二氧化硅与电化学指示信号分子混合孵育，用带有负电的单链RNA封闭介孔纳米二氧化硅表面的孔洞，得封闭介孔硅；将待测核酸与CRISPR Cas13a体系混合孵育后，与封闭介孔硅混合孵育，孵育结束后，取上清进行电化学检测；所述CRISPRCas13a体系含有能够与待测物特异性结合的crRNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电化学指示信号分子包括亚甲基蓝。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述带有负电的单链RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测核酸为经RT-RAA扩增后的待测产物。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述进行电化学检测时，用丝网印刷电极进行检测。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测核酸包括新冠病毒突变株N501Y。

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