CN219194951U - 一种一体式荧光反应的装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种一体式荧光反应的装置，涉及DNA检测技术领域，包括移液器、外部反应管、内管。本实用新型中网状底部上面嵌有一层滤膜，在无剧烈震荡或离心力情况下，可有效防止RPA恒温扩增反应体系和Cas12a反应体系的接触；可在一管内连续进行RPA恒温扩增反应和Cas12a荧光反应，降低了实验的繁琐程度；在RPA扩增反应之前就已经将Cas12a反应体系加入到内管中，盖盖后形成一个密闭但一体的装置，RPA扩增反应之后没有开盖过程，减少了后续实验气溶胶污染的可能，降低了实验过程中开盖造成的气溶胶污染以及交叉污染，避免了实验中途开盖造成的不必要污染，提高了实验的准确性。

Description

一种一体式荧光反应的装置

技术领域

本实用新型涉及DNA检测技术领域，具体为一种一体式荧光反应的装置。

背景技术

RPA(Recombinase Polymerase Amplification)全称重组酶聚合酶扩增技术，无需传统的热循环过程，37℃左右达到最高效率且反应非常迅速，15min左右即可合成出大量的双链DNA。CRISPR/Cas12a(Cpf1)是一种RNA指导的核酸切割酶。Cas12a蛋白可以特异性识别双链DNA中的PAM序列(富含T碱基的序列)，使PAM序列的下游靶双链DNA序列出现局部熔化解链，从而与特异性的crRNA互补结合形成R环结构，Cas12a蛋白的RuvC核酸酶结构域即可对双链DNA进行特异性切割；完成双链DNA的切割后，Cas12a PAM远端仍具有切割活性可对单链DNA进行非特异性反式切割。

现有RPA-Cas12a反应利用RPA反应产生大量靶双链DNA作为Cas12a反应的底物，在互补的crRNA指导下顺式切割双链DNA，并反式切割带有荧光的单链DNA探针，通过监测荧光信号的变化来检测目的样本。现在基本反应过程是两步的，先RPA恒温扩增反应，进行模板的大量扩增，此过程结束后，再开盖吸取扩增反应液加入Cas12a反应体系中进行荧光反应；但该实验的弊端在于RPA反应后需要开盖加入Cas12a反应的原料(反应液或冻干小球)，此时RPA扩增体系已经将模板进行大量扩增，此过程繁琐且易造成交叉污染和实验室残留污染，易造成假阳性结果影响最终结果的准确性。

实用新型内容

本实用新型的目的在于提供一种一体式荧光反应的装置，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本实用新型提供如下技术方案：一种一体式荧光反应的装置，包括移液器、外部反应管、内管，所述移液器设于外部反应管上方，所述内管设于外部反应管内部，所述内管底部设有网孔，所述内管内壁底部于网孔顶部设有滤膜。

进一步的，所述外部反应管顶部设有连接环，所述外部反应管顶部活动设有与连接环相匹配的密封盖。

进一步的，所述密封盖外壁套设有密封圈，所述连接环内壁设有与密封圈相匹配的密封槽。

进一步的，所述外部反应管顶部为圆筒型结构，所述外部反应管底部为倒置圆锥形结构。

进一步的，所述内管外径小于外部反应管圆筒型结构的内径。

进一步的，所述外部反应管的圆筒型结构内壁底部设有密封环。

与现有技术相比，本实用新型所达到的有益效果是：

1、本实用新型通过设置移液器、外部反应管、内管，本装置由外部反应管和内管两部分组成；外部反应管可以是单独的0.2mL PCR反应管，也可以是0.2mL8连管，或者0.2mL96孔PCR反应板；内管由低蛋白吸附的聚丙烯材料制成，底部为网状结构，网状底部上面嵌有一层滤膜，在无剧烈震荡或离心力情况下，可有效防止RPA恒温扩增反应体系和Cas12a反应体系的接触；可在一管内连续进行RPA恒温扩增反应和Cas12a荧光反应，降低了实验的繁琐程度；Cas12a体系可以为工作液，也可为冻干小球；降低了实验过程中开盖造成的气溶胶污染以及交叉污染，避免了实验中途开盖造成的不必要污染，提高了实验的准确性；本实用新型在RPA扩增反应之前就已经将Cas12a反应体系加入到内管中，盖盖后形成一个密闭但一体的装置，只是两个反应体系进行了物理隔离，RPA反应结束后通过离心将两个体系混合到一起，再进行荧光反应；RPA扩增反应之后没有开盖过程，减少了后续实验气溶胶污染的可能。

2、本实用新型中，先将RPA恒温扩增反应体系先加入到外部反应管混匀离心后，将内管置于外部反应管内，再将Cas12a反应体系通过移液器加到内管的滤膜上，Cas12a反应体系可以是反应液，也可以是冻干小球；先运行第一步RPA恒温扩增反应程序，反应结束后，若内管加入的是反应液，则直接通过离心的方式使滤膜上的液体进入外部反应管内侧底部；若内管加入的是冻干小球，则将外部反应管颠倒混匀，使用外部反应管的RPA恒温扩增反应体系将Cas12a反应体系冻干小球完全溶解后，再通过离心的方式将所有液体离心到外部反应管底部；将整个反应管置于雅睿荧光定量PCR仪上，运行Cas12a反应程序，并进行荧光采集。

附图说明

附图用来提供对本实用新型的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本实用新型的实施例一起用于解释本实用新型，并不构成对本实用新型的限制。在附图中：

图1是本实用新型中整体的结构示意图；

图2是本实用新型中整体的主视剖面图；

图3是本实用新型中整体的俯视图；

图4是本实用新型中内管的俯视图；

图5是本实用新型进行猪瘟病毒p17基因检测结果；

图中：1、移液器；2、外部反应管；3、内管。

具体实施方式

下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。

请参阅图1-图5，本实用新型提供技术方案：一种一体式荧光反应的装置，包括移液器1、外部反应管2、内管3，所述移液器1设于外部反应管2上方，所述内管3设于外部反应管2内部，所述内管3底部设有网孔，所述内管3内壁底部于网孔顶部设有滤膜。

所述外部反应管2顶部设有连接环，所述外部反应管2顶部活动设有与连接环相匹配的密封盖，连接环与密封盖相互配合实现对外部反应管2的密封处理，操作方便快捷。

所述密封盖外壁套设有密封圈，所述连接环内壁设有与密封圈相匹配的密封槽，密封圈和密封槽相互配合，进一步加强外部反应管2的密封处理效果，避免外部反应管2内壁反应液发生泄漏。

所述外部反应管2顶部为圆筒型结构，所述外部反应管2底部为倒置圆锥形结构，保证外部反应管2底部的反应液更加集中，使得反应更加充分，同时为了避免内管3进入外部反应管2底部。

所述内管3外径小于外部反应管2圆筒型结构的内径，可有效保证内管3能够放入到外部反应管2中。

所述外部反应管2的圆筒型结构内壁底部设有密封环，密封环在外部反应管2和内管3之间进行密封限位处理，可有效保证内管3的稳定性。

本实用新型的工作原理：

参照说明书附图1-图5，本实用新型通过设置移液器1、外部反应管2、内管3，本装置由外部反应管2和内管3两部分组成；外部反应管2可以是单独的0.2mL PCR反应管，也可以是0.2mL 8连管，或者0.2mL 96孔PCR反应板；内管3由低蛋白吸附的聚丙烯材料制成，底部为网状结构，网状底部上面嵌有一层滤膜，在无剧烈震荡或离心力情况下，可有效防止RPA恒温扩增反应体系和Cas12a反应体系的接触；实验过程中，先将RPA恒温扩增反应体系先加入到外部反应管2混匀离心后，将内管3置于外部反应管2内，再将Cas12a反应体系通过移液器1加到内管3的滤膜上，Cas12a反应体系可以是反应液，也可以是冻干小球；先运行第一步RPA恒温扩增反应程序，反应结束后，若内管3加入的是反应液，则直接通过离心的方式使滤膜上的液体进入外部反应管2内侧底部；若内管3加入的是冻干小球，则将外部反应管2颠倒混匀，使用外部反应管2的RPA恒温扩增反应体系将Cas12a反应体系冻干小球完全溶解后，再通过离心的方式将所有液体离心到外部反应管2底部；将整个反应管置于雅睿荧光定量PCR仪上，运行Cas12a反应程序，并进行荧光采集；本实用新型在RPA扩增反应之前就已经将Cas12a反应体系加入到内管3中，盖盖后形成一个密闭但一体的装置，只是两个反应体系进行了物理隔离，RPA反应结束后通过离心将两个体系混合到一起，再进行荧光反应；RPA扩增反应之后没有开盖过程，减少了后续实验气溶胶污染的可能；可在一管内连续进行RPA恒温扩增反应和Cas12a荧光反应，降低了实验的繁琐程度；Cas12a体系可以为工作液，也可为冻干小球；降低了实验过程中开盖造成的气溶胶污染以及交叉污染，避免了实验中途开盖造成的不必要污染，提高了实验的准确性；

以猪瘟病毒p17基因检测为例：

1、RPA反应体系配置：

1)反应组分：基础型DNA恒温扩增试剂盒购自安普未来(货号WLB8201KIT)、上下游引物；

2)引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，具体序列如下

引物名称	序列
		ASF-p17-f1	GATTTTGCTCATTATTATTCTTATCATCGTTGC
ASF-p17-f2	CGCTTGGAATGTGGGACTGCAGGGAGGTGGAG

3)样本制备：

阳性样本：用无RNase水将目的质粒DNA稀释至200copies/μL、20copies/μL、2copies/μL和0.2copies/μL四组；

阴性对照：无RNase水；

4)体系配置：

反应组分	加量
		干粉	/
Abuffer	29.4μL
		引物MIX	0.4μmoL
Bbuffer	2.5μL
		模板/水	5μL
无RNase水	补足50μL

5)将配制好的试剂分装到本实用新型的0.2mL PCR外管中，震荡混匀后离心。2、Cas12a反应体系配置：

1)反应试剂：EnGen Lba Cas12a(Cpf1)购自NEB(货号M0653T)、RNA酶抑制剂购自Takara(货号2313A)、crRNA、ssDNA；

2)CrRNA序列如下，由上海捷瑞生物工程有限公司合成；

名称	序列
		CrRNA-1	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUAUAACCGGACUAUUGACUGC

ssDNA序列如下，由上海捷瑞生物工程有限公司合成；

名称	序列
		ssDNA	FAM-TTCTT-BHQ1

3)反应体系配制

反应组分	加入量
		10×NEBuffer	2μL
ssDNA探针	0.5μM
		RNA酶抑制剂	10U
Cas12a	0.5μM
		crRNA	1μM
无RNase水补足	20μL

4)在各孔外管内分别放入内管，有滤芯的一端朝下，然后将上述表格中的试剂依次加入到内管中，轻轻盖上PCR管盖，上机之前不可剧烈震荡。

3、将所有反应管放入Bio-Rad普通PCR仪中，程序设置如下：

39℃	15min	1cycle
			4℃	∞	/

4、待反应结束后将反应管取出，12000rpm离心30s，使内管中的液体全部聚集到外管底部，然后涡旋震荡混匀，再次12000rpm离心30s。

5、将反应管放入雅睿MA-6000荧光定量PCR仪中，程序设置如下：

37℃

30s采集一次荧光

40cycles

6、实验结果见附图5

图5：本装置进行猪瘟病毒p17基因检测结果。

最后应说明的是：以上所述仅为本实用新型的优选实施例而已，并不用于限制本实用新型，尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种一体式荧光反应的装置，包括移液器(1)、外部反应管(2)、内管(3)，其特征在于：所述移液器(1)设于外部反应管(2)上方，所述内管(3)设于外部反应管(2)内部，所述内管(3)底部设有网孔，所述内管(3)内壁底部于网孔顶部设有滤膜。

2.根据权利要求1所述的一种一体式荧光反应的装置，其特征在于：所述外部反应管(2)顶部设有连接环，所述外部反应管(2)顶部活动设有与连接环相匹配的密封盖。

3.根据权利要求2所述的一种一体式荧光反应的装置，其特征在于：所述密封盖外壁套设有密封圈，所述连接环内壁设有与密封圈相匹配的密封槽。

4.根据权利要求1所述的一种一体式荧光反应的装置，其特征在于：所述外部反应管(2)顶部为圆筒型结构，所述外部反应管(2)底部为倒置圆锥形结构。

5.根据权利要求4所述的一种一体式荧光反应的装置，其特征在于：所述内管(3)外径小于外部反应管(2)圆筒型结构的内径。

6.根据权利要求5所述的一种一体式荧光反应的装置，其特征在于：所述外部反应管(2)的圆筒型结构内壁底部设有密封环。

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