CN112760193A - 核酸提取/检测装置和方法 - Google Patents

Abstract

针对目前快速便携式核酸快速检测这一重大需求，本发明提出了一种一次性便携式核酸提取富集和扩增检测密闭装置。本发明通过预埋裂解液、清洗液、洗脱液和核酸扩增液在装置的不同密闭和隔离的区域，再通过对装置进行简单的旋转和挤压操作，使得相关的液体依次通过核酸吸附区域，就可以逐步实现样本裂解、核酸纯化和核酸扩增检测，真正实现了核酸现场快速检测中的“样本进‑结果出”要求。同时由于本装置是一次性密闭装置，因此也可以有效的降低和避免扩增产物交叉污染的问题。

Description

核酸提取/检测装置和方法

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种一次性使用、便携式核酸提取富集和扩增检测一体化密闭装置。该装置集成了核酸裂解、富集提取和扩增检测功能，可在现场对包括咽拭子在内的多种样本进行核酸裂、富集提取和扩增检测，实现“样本进-结果出”，有效解决了目前核酸检测过程中，依赖生物安全二级以上实验室对样本进行处理，而不能进行即时快速检测的问题。

背景技术

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)在全球内快速爆发。

随着国内经济和世界经济的复苏，我国与国外的人员沟通、商务往来等会更加频繁，进一步加剧了外来输入的防控难度。除此之外，在一些条件落后的偏远地区，由于缺乏有效的核酸现场快速检测方法和仪器，不能对包括新冠病毒在内的多种传染性细菌、病毒进行即时检测，存在爆发和大规模传染风险。然而，传统的核酸检测方法，在进行咽拭子样本采集后，针对采集到的样本，需要在生物安全二级以上的实验室中，由专门的操作人员进行样本灭活，裂解，磁珠富集提取和最终的PCR扩增检测。该方法对环境要求高、操作复杂、设备昂贵且耗时长，不能进行现场快速检测，极大的限制了其应用及推广，尤其是在海关、机场、火车站等人流密集区域以及上述条件落后偏远地区。

现阶段，已有报道的研发或上市的分子诊断即时检测设备，例如集成了微流控芯片和恒温扩增检测技术的核酸检测仪(CN 107043697)，其采用微流控芯片作为检测耗材，成本高；或是移动“PCR检测实验室”的便携式核酸检测箱(CN 207276621)，仪器成本高昂，这些特点导致其不能有效适用于上述应用场景(海关、偏远地区)的现场快速检测。

因此，集成核酸富集提取、扩增检测的一次性低成本、便携式核酸检测装置，能够通过简单的按动按钮，便可实现在现场对核酸样本进行富集提取处理，从而摆脱对生物安全实验室的依赖，不管是在海关等防控外来输入压力较大的场景，还是在一些条件落后的偏远地区，都具有重要的意义。上述装置，目前在国内市场上非常少，对于下一阶段的疫情防控工作，将会带来巨大的帮助。

发明内容

针对上述现状，本发明提出一种核酸富集提取和扩增检测一体化装置，目的在于提供一种便携式的一次性装置，无需其他实验室设备辅助，用户可自行操作，通过简单的按动按钮，便可实现从咽拭子样本到最终检测结果读取，非常适合海关检疫、偏远地区的现场快速检测。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种核酸提取/检测装置，包括上层结构、中层结构和下层结构；

其中，所述上层结构包括多个密封的腔室，各腔室相互隔离，分别容纳核酸裂解液、清洗液和核酸洗脱液，各腔室的顶部设置有刺针，底部利用下侧封口膜密封，通过分别按压各腔室的顶部，所述刺针能够刺穿所述下侧封口膜；

所述中层结构包括核酸提取膜，所述核酸提取膜设置在漏斗结构上，所述漏斗结构的出液口偏离所述漏斗结构的中心；

所述下层结构与所述中层结构旋转连接，所述下层结构包括废液腔和洗脱腔，通过旋转所述下层结构，所述废液腔和所述洗脱腔能够分别与所述漏斗结构的出液口连通。

在一些实施例中，容纳核酸裂解液的腔室的顶部设置有进样孔，所述进样孔利用封口膜密封。

在一些实施例中，容纳清洗液的腔室的数量为一个或多个。

在一些实施例中，所述洗脱腔中含有扩增检测溶液。

在一些实施例中，所述扩增检测溶液为PCR扩增反应溶液或核酸等温扩增检测溶液。

在一些实施例中，所述核酸提取/检测装置还包括加热部件，用于加热所述洗脱腔。

在一些实施例中，所述加热部件为带有开口的腔室，通过注入加热介质来加热所述洗脱腔。

在一些实施例中，所述核酸提取膜为硅胶膜或纤维素膜。

在一个实施例中，所述核酸提取膜上固定有磁性微球。

一种利用所述核酸提取/检测装置提取/检测核酸的方法，包括：

将待测样品加入容纳核酸裂解液的腔室进行核酸裂解；

使废液腔与漏斗结构的出液口连通，先后按压容纳核酸裂解液的腔室和容纳清洗液的腔室以在核酸提取膜上进行核酸的富集和清洗；

使洗脱腔与漏斗结构的出液口连通，按压容纳洗脱液的腔室以洗脱并收集核酸洗脱液。

在一些实施例中，所述方法进一步包括通过PCR或等温扩增检测法检测核酸。

与现有技术相比，本发明的核酸提取/检测装置的有益效果是：

(1)所述的核酸提取/检测装置集成了核酸提取功能和检测功能，无需其他辅助设备，便可实现现场快速核酸提取及扩增检测，有效摆脱了对生物安全实验室的依赖，可广泛应用于海关、机场、车站及条件落后的偏远地区的检测需求；

(2)所述的核酸提取/检测装置结构简单，成本低廉，减少了操作步骤，实现了核酸提取、扩增、检测一体化，具有体积小、重量轻、携带方便的特点，是一种高效率的检测器件；

(3)该核酸提取/检测装置制备成本低，一次性便携式使用，装置密封无污染。

附图说明

以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。其中：

图1为本发明实施例中核酸提取/检测装置的示意图；

图2为本发明实施例中核酸提取/检测装置的俯视图；

图3为本发明另一实施例中核酸提取/检测装置的示意图。

附图说明：

1-第一腔室；2-第二腔室；3-第三腔室；4-第四腔室；5-进样孔；6-下侧封口膜；7-刺针；8-核酸提取膜；9-废液腔；10-洗脱腔。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

在本发明的说明书中，提及“一个实施例”时均意指在该实施例中描述的具体特征、结构或者参数、步骤等至少包含在根据本发明的一个实施例中。因而，在本发明的说明书中，若采用了诸如“根据本发明的一个实施例”、“在一个实施例中”等用语并不用于特指在同一个实施例中，若采用了诸如“在另外的实施例中”、“根据本发明的不同实施例”、“根据本发明另外的实施例”等用语，也并不用于特指提及的特征只能包含在特定的不同的实施例中。本领域的技术人员应该理解，在本发明说明书的一个或者多个实施例中公开的各具体特征、结构或者参数、步骤等可以以任何合适的方式组合。

根据本发明的一个实施例，本发明的核酸提取/检测装置的具体结构如图1所示，该装置呈柱形，分为上、中、下三层结构。该装置的材质可以为常用的塑料材料，包括但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯等。

从装置的俯视图(图2)中可以看出，上层结构分为四个隔离的腔室，按顺时针方向，分别为第一腔室1(装有核酸裂解液)、第二腔室2(装有清洗液)、第三腔室3(装有清洗液)和第四腔室4(装有核酸洗脱液)。第一腔室1的顶部设置有进样孔5，进样孔5可利用表面封口膜密封。上述各腔室中所有的液体，通过下侧封口膜6将其封装到装置上层各腔室内，每个腔室的顶端设置有刺针7，按下各腔室的顶部时，刺针7能够刺破下侧封口膜6从而使腔室中的液体向下流动。

装置的中层结构含有一个核酸提取膜8，能够特异性的捕获所有流经的核酸片段，核酸提取膜8可设置在一漏斗结构上，以便于液体的收集。漏斗结构的出液口偏离漏斗结构的中心。核酸提取膜8可以为硅胶膜或纤维素膜。在一个实施例中，核酸提取膜8上可以固定有磁性微球。

装置的下层结构与上层结构旋转连接，包括废液腔9以及洗脱腔10，其中废液腔9用于装载包括核酸裂解液、清洗液等废液，而经过核酸提取膜富集后的核酸样本，则会洗脱后流入洗脱腔10内部，洗脱腔10内可容纳扩增反应溶液，能够进行下一步的扩增检测。

在一个实施例中，下层结构与上层结构通过中心轴连接，在另外的实施例中，下层结构的顶部边缘可以设置有凸缘或凹槽，相应地，上层结构的底部设置有凹槽或凸缘，从而下层结构与上层结构能够可旋转地结合在一起。

在该实施例中，本发明所述装置的具体工作原理为：第一腔室1中含有核酸裂解液，采集有咽拭子样本的棉签，通过第一腔室1的进样孔6，插入到第一腔室1中，进行核酸样本裂解。裂解后，手动将第一腔室1按下，第一腔室1下端的刺针7会戳破下侧封口膜6，使得裂解后的核酸样本向下流动，通过核酸提取膜8，流经的所有核酸样本均被核酸提取膜8 特异性捕获；随后，顺时针依次按下第二腔室2和第三腔室3，刺针先后戳破第二腔室2和第三腔室3的下侧封口膜6，利用其中的不同清洗液分别对核酸提取膜8上的杂质进行清洗，清洗后的所有废液流入废液腔9；最后，按下第四腔室4，刺针戳破第四腔室4的下侧封口膜6，旋转废液腔，利用核酸洗脱液，将固定在核酸提取膜表面的核酸样本全部洗脱进入洗脱腔10内，完成对咽拭子样本的裂解、提取和富集。

在一个实施例中，在清洗和洗脱步骤，还可以将所述装置放入离心装置中，以提高清洗和洗脱效果。

在另外的实施例中，根据需要，装有清洗液的腔室可以为一个或者两个以上，例如3个。

本发明的装置在进行核酸样本裂解、富集、提取进入洗脱腔后，可结合不同的核酸扩增检测方式进行检测，包括PCR检测和恒温扩增检测方式，将有两种检测模式：

1)该洗脱腔采用商用化的小离心管，预装有PCR扩增引物、缓冲液以及酶等，能够适配于目前广泛使用的荧光定量PCR检测仪(qPCR)。在多人次分别进行样本处理后，可一次性高通量的(96通量或384通量等) 通过qPCR检测仪进行扩增检测。该种检测模式更加适用于海关等人流密集，需要高通量即时检测的应用场所，如飞机上的每位乘客可在飞机上自行进行核酸提取，并将带有二维码标记的小离心管统一交给海关或检验检疫处，并由海关在现场快速统一进行高通量qPCR检测，极大的节省了检测的时间和成本，有效降低了外防输入的工作压力。在这种情况下，本发明的装置是作为核酸提取装置；

2)该装置可集成核酸等温扩增检测方法(如环介导等温扩增检测)，在核酸富集提取后，直接实现现场扩增检测和结果读取，在这种情况下，可在洗脱腔10的外侧设置一个加热部件11，将洗脱腔加热至所需温度。例如，如图3所示，加热部件11可以带有开口的腔室，洗脱腔容纳在该腔室中，通过注入热水加热部件11即可作为水浴加热洗脱腔：该洗脱腔内预装有核酸等温扩增所需的引物、缓冲液和扩增酶等。所述的核酸等温检测技术相较于普通PCR需要变温进行扩增的技术，能在等温条件下，实现核酸快速扩增检测。结合该技术，上述装置可在现场实现快速检测，如在一些条件落后的偏远地区，在进行取样完成后，可直接进行扩增检测和结果读取，能够快速对当地传染人群进行筛查。在这种情况下，本发明的装置可直接作为核酸检测装置。

本发明的核酸提取/检测装置中的各种试剂可以为各种商购的试剂盒中的试剂，例如在检测新型冠状病毒时，可采用上海之江生物科技股份有限公司、华大生物科技有限公司的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)、成都博奥晶芯生物科技有限公司的六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒(恒温扩增芯片法)等。

实施例1

海关应用场景下，在飞机上对每位乘客发放一个上述装置。每位乘客自行进行咽拭子样本采集，利用棉签后端戳破第一腔室1的表面封口膜，将棉签插入到第一腔室1中进行核酸裂解，裂解液含量为2mL，裂解时间为10min；随后按下第一腔室1，第一腔室1下端的刺针7会戳破下侧封口膜6，使得第一腔室1中的裂解液向下流经核酸提取膜8，流入废液腔9内；随后，顺时针按下第二腔室2和第三腔室3，刺针先后戳破第二腔室2和第三腔室3的下侧封口膜6，对核酸提取膜8上的核酸样本进行清洗，第二腔室2和第三腔室3的清洗液含量分别为2mL；最后，旋转废液腔9，按下第四腔室4，刺针戳破第四腔室4的下侧封口膜6，采用核酸洗脱液将核酸提取膜8上的核酸样本洗脱到洗脱腔10内。该洗脱腔内预装有荧光定量PCR扩增反应溶液，包括12.5μL反应缓冲液，0.5μL染料，3.4μL引物以及3.4μL双蒸水。可将洗脱腔取下，扣盖密封，每位乘客在洗脱腔上具有自己的二维码。将洗脱腔交给海关，现场利用qPCR检测仪进行高通量检测。

实施例2

在一些落后的偏远地区，在进行咽拭子样本采集后，利用棉签后端戳破第一腔室1的表面封口膜，将棉签插入到第一腔室1中进行核酸裂解，裂解液含量为2mL，裂解时间为10min；随后按下第一腔室1，第一腔室 1下端的刺针7会戳破下侧封口膜6，使得第一腔室1中的裂解液向下流经核酸提取膜8，流入废液腔9内；随后，顺时针按下第二腔室2和第三腔室3，刺针先后戳破第二腔室2和第三腔室3的下侧封口膜6，对核酸提取膜8上的核酸样本进行清洗，第二腔室2和第三腔室3的清洗液含量分别为2mL；最后，旋转废液腔9，按下第四腔室4，刺针戳破第四腔室 4的下侧封口膜6，采用核酸洗脱液将核酸提取膜8上的核酸样本洗脱到洗脱腔10内。该洗脱腔内预装有环介导等温扩增的反应体系，包括12.5μL 反应缓冲液，0.5μL染料，染料包括但不限于显色指示和荧光指示剂，3.4 μL引物以及3.4μL双蒸水。将上述的洗脱腔10放置在60℃的热水中，使样品发生扩增反应。核酸扩增反应后，阳性样本的颜色将由粉红色变为黄色，而阴性样本的颜色依旧保持粉红色，检测结果可直接肉眼定性读取。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种核酸提取/检测装置，包括上层结构、中层结构和下层结构；

其中，所述上层结构包括多个密封的腔室，各腔室相互隔离，分别容纳核酸裂解液、清洗液和核酸洗脱液，各腔室的顶部设置有刺针，底部利用下侧封口膜密封，通过分别按压各腔室的顶部，所述刺针能够刺穿所述下侧封口膜；

所述中层结构包括核酸提取膜，所述核酸提取膜设置在漏斗结构上，所述漏斗结构的出液口偏离所述漏斗结构的中心；

所述下层结构与所述中层结构旋转连接，所述下层结构包括废液腔和洗脱腔，通过旋转所述下层结构，所述废液腔和所述洗脱腔能够分别与所述漏斗结构的出液口连通。

2.根据权利要求1所述的核酸提取/检测装置，其中，容纳核酸裂解液的腔室的顶部设置有进样孔，所述进样孔利用封口膜密封。

3.根据权利要求1所述的核酸提取/检测装置，其中，容纳清洗液的腔室的数量为一个或多个。

4.根据权利要求1所述的核酸提取/检测装置，其中，所述洗脱腔中含有扩增检测溶液。

5.根据权利要求4所述的核酸提取/检测装置，其中，所述扩增检测溶液为PCR扩增反应溶液或核酸等温扩增检测溶液。

6.根据权利要求1所述的核酸提取/检测装置，其中，所述核酸提取/检测装置还包括加热部件，用于加热所述洗脱腔。

7.根据权利要求6所述的核酸提取/检测装置，其中，所述加热部件为带有开口的腔室，通过注入加热介质来加热所述洗脱腔。

8.根据权利要求1所述的核酸提取/检测装置，其中，所述核酸提取膜为硅胶膜或纤维素膜；可选地，所述核酸提取膜上固定有磁性微球。

9.一种利用权利要求1-8任一项所述核酸提取/检测装置提取/检测核酸的方法，包括：

将待测样品加入容纳核酸裂解液的腔室进行核酸裂解；

使废液腔与漏斗结构的出液口连通，先后按压容纳核酸裂解液的腔室和容纳清洗液的腔室以在核酸提取膜上进行核酸的富集和清洗；

使洗脱腔与漏斗结构的出液口连通，按压容纳洗脱液的腔室以洗脱并收集核酸洗脱液。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述方法进一步包括通过PCR或等温扩增检测法检测核酸。

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