CN208869582U - 一种提取人类全血中细菌总核酸的微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种提取人类全血中细菌总核酸的微流控芯片,包括定位孔和主体,主体包括位于加样腔体上的加样孔、加样腔体、单向阀、核酸提取材料、核酸提取腔体、PCR反应腔体、缓冲液I腔体、缓冲液II腔体、RNA酶抑制剂腔体、MIX1腔体、DNaseI腔体、MIX2腔体、70%乙醇腔体、缓冲液III腔体、MIX3腔体、PCR Master Mix腔体、PCR引物腔体、PCR反应探针腔体和缓冲液V腔体;本实用新型能够快速裂解该细菌,释放RNA,操作简单快捷,大大提高了提取效率;将检测限降到最低,避免漏检的可能性;简化病原菌检测的操作过程,降低人为操作引入的检测误差。
Description
技术领域
本实用新型涉及分子生物医学技术领域,具体是一种提取人类全血中细菌总核酸的微流控芯片。
背景技术
细菌感染是世界范围内最常见的疾病之一,易导致多种疾病的产生,主要的临床表现为:骤发寒战,高热,心动过速,呼吸急促,皮疹,肝脾肿大和精神,神志改变等一系列严重临床症状,其危害性大、易导致死亡。因此快速测定人类全血中的细菌类型对了解全血中细菌的多样性,指导抗生素的选择和使用,杀死具毒害性的细菌等,具有极大的学术研究和临床应用价值。为获取高质量的不同细菌总核酸,前期样品的处理、提取方法及试剂盒的选择尤为重要。此外,必须要指出的是,对于不同的细菌,同一种方法所呈现出的结果往往差异很大。目前发表的提取细菌总核酸的方法有很多,但多数方法不仅要使用一些有毒的试剂,而且方法费时、复杂、花费较高,且提取效果不佳。另外许多细菌是很难被破坏裂解的,因为它们有细胞壁保护,例如,革兰氏阴性菌,细胞壁成分相对较单一,结构较脆弱,易破碎;而对于革兰氏阳性菌,细胞壁较厚,化学结构保守固定,三维细胞壁结构交联紧密,细胞难破碎,提取难度大。而且现有方法无法检测到含量极低的细菌数,致使病原菌的检测有漏检的可能性。因此为解决以上问题,亟待研发一种高效且广泛适用的细菌总核酸提取的方法。
实用新型内容
本实用新型目的在于克服现有技术的不足,适应现实发展,在可操作性、耗时短、敏感性高、安全无污染、节省时间等方面解决上述问题,提供一种用于提取人类全血中细菌总核酸的微流控芯片,同时集PCR反应和检测为一体。
本实用新型所述的一种提取人类全血中细菌总核酸的微流控芯片,包括定位孔和主体,所述主体包括位于加样腔体上的加样孔、加样腔体、第一单向阀、第二单向阀、第三单向阀、第四单向阀、第五单向阀、第六单向阀、第七单向阀、第八单向阀、第九单向阀、第十单向阀、第十一单向阀、核酸提取材料、核酸提取腔体、PCR反应腔体、缓冲液I腔体、缓冲液II腔体、RNA酶抑制剂腔体、MIX1腔体、DNaseI腔体、MIX2腔体、70%乙醇腔体、缓冲液III腔体、MIX3 腔体、PCR Master Mix腔体、PCR引物腔体、PCR反应探针腔体和缓冲液V腔体;
所述核酸提取材料位于所述核酸提取腔体内;
所述核酸提取腔体的上下带有两种不同的滤芯,滤芯将其内部分隔为上核酸提取腔体、中带滤芯的核酸提取腔体和下带滤芯的核酸提取腔体;
所述加样腔体通过进样流道与所述核酸提取腔体连通;
所述缓冲液I腔体、缓冲液II腔体、RNA酶抑制剂腔体分别通过第一分流道、第二分流道、第三分流道与第一流道连通,所述第一流道一端与所述第一分流道连通,另一端与所述核酸提取腔体连通;
所述MIX1腔体、DNaseI腔体、MIX2腔体分别通过第四分流道、第五分流道、第六分流道与第二流道连通,所述第二流道一端与所述第四分流道连通,另一端与所述核酸提取腔体连通;
所述70%乙醇腔体、缓冲液III腔体、MIX3腔体、缓冲液V腔体分别通过第七分流道、第八分流道、第九分流道、第十分流道与第三流道连通,所述第三流道一端与所述第七分流道连通,另一端与所述核酸提取腔体连通;
所述PCR反应腔体通过出样流道与所述核酸提取腔体连通;
所述PCR Master Mix腔体、引物腔体、探针腔体分别通过第十一分流道、第十二分流道、第十三分流道与所述PCR反应腔体连通;
所述第一分流道、第二分流道、第三分流道、第四分流道、第五分流道、第六分流道、第七分流道、第八分流道、第九分流道、第十分流道上分别对应的设有第一单向阀、第二单向阀、第三单向阀、第四单向阀、第五单向阀、第六单向阀、第七单向阀、第八单向阀、第十一单向阀;
所述出样流道上设有一个外接2ml废液管的单向阀;
所述缓冲液I腔体内含有缓冲液I,所述缓冲液II腔体内含有缓冲液II,所述RNA酶抑制剂腔体内含有RNA酶抑制剂,所述MIX1腔体内含有MIX1溶液,所述DNaseI腔体内含有DNaseI溶液,所述MIX2腔体内含有混合均匀的 MIX2溶液,所述70%乙醇腔体内含有混合均匀的70%乙醇溶液,所述缓冲液III 腔体内含有缓冲液III,所述MIX3腔体内含有混合均匀的MIX3溶液,所述缓冲液V腔体内含有缓冲液V,所述PCR Master Mix腔体内含有混合均匀的PCR Master Mix溶液,所述引物腔体内含有PCR扩增引物,所述探针腔体内含有TaqMan探针。
进一步,所述主体呈扇形,由PC材料制作而成,半径为40mm,厚度为2mm。
与现有技术相比,本实用新型的优点和积极效果:
①可快速裂解该细菌,释放RNA,操作简单快捷,大大提高了提取效率;且低至10copies的细菌数也可被检测到,将检测限降到最低,避免漏检的可能性;简化病原菌检测的操作过程,降低人为操作引入的检测误差;
②耗时短,通量高,可快速、高效地完成临床上常见病原菌的检测,及时获知结果辅助进一步诊断与治疗;
③敏感性高,低至10copies的细菌也可以被检测到,将检测限降到最低,避免漏检的可能性;
④检测过程为闭管反应,逆转录与PCR扩增反应相结合,减少实验步骤,也大大降低了污染及结果偏差的可能性;
⑤安全无污染,整个体系中不含有毒有害物质,对环境与操作人员都好。
附图说明
图1本实用新型所述微流控芯片的总体结构示意图。
图1附图标记的含义:1-定位孔,2-主体,3-加样腔体,4-加样孔,5-第一单向阀,6-第二单向阀,7-第三单向阀,8-第四单向阀,9-第五单向阀,10-第六单向阀,11-第七单向阀,12-第八单向阀,13-第九单向阀,14-核酸提取材料, 15-核酸提取腔体,16-第十单向阀,17-PCR反应腔体,18-缓冲液I腔体,19-缓冲液II腔体,20-RNA酶抑制剂腔体,21-MIX1腔体,22-DNaseI腔体,23-MIX2 腔体,24-70%乙醇腔体,25-缓冲液III腔体,26-MIX3腔体,27-PCR Master Mix 腔体,28-PCR引物腔体,29-PCR反应探针腔体,30-缓冲液V腔体,31-第十一单向阀,32-进样流道,33-第一分流道,34-第二分流道,35-第三分流道,36-第一流道,37-第四分流道,38-第五分流道,39-第六分流道,40-第二流道,41-第七分流道,42-第八分流道,43-第九分流道,44-第十分流道,45-第三流道,46- 出样流道。
具体实施方式
下面结合附图对本实用新型的具体实施例做详细说明。
一种提取人类全血中细菌总核酸的微流控芯片,如图1所示,包括定位孔1 和主体2,所述主体2包括位于加样腔体3上的加样孔4、加样腔体3、第一单向阀5、第二单向阀6、第三单向阀7、第四单向阀8、第五单向阀9、第六单向阀10、第七单向阀11、第八单向阀12、第九单向阀13、第十单向阀16、第十一单向阀31、核酸提取材料14、核酸提取腔体15、PCR反应腔体17、缓冲液I 腔体18、缓冲液II腔体19、RNA酶抑制剂腔体20、MIX1腔体21、DNaseI腔体22、MIX2腔体23、70%乙醇腔体24、缓冲液III腔体25、MIX3腔体26、PCR Master Mix腔体27、PCR引物腔体28、PCR反应探针腔体29和缓冲液V腔体 30;
所述核酸提取材料14位于所述核酸提取腔体15内;
所述核酸提取腔体15的上下带有两种不同的滤芯,滤芯将其内部分隔为上核酸提取腔体、中带滤芯的核酸提取腔体和下带滤芯的核酸提取腔体;
所述加样腔体3通过进样流道32与所述核酸提取腔体15连通;
所述缓冲液I腔体18、缓冲液II腔体19、RNA酶抑制剂腔体20分别通过第一分流道33、第二分流道34、第三分流道35与第一流道36连通,所述第一流道36一端与所述第一分流道33连通,另一端与所述核酸提取腔体15连通;
所述MIX1腔体21、DNaseI腔体22、MIX2腔体23分别通过第四分流道 37、第五分流道38、第六分流道39与第二流道40连通,所述第二流道40一端与所述第四分流道37连通,另一端与所述核酸提取腔体15连通;
所述70%乙醇腔体24、缓冲液III腔体25、MIX3腔体26、缓冲液V腔体 30分别通过第七分流道41、第八分流道42、第九分流道43、第十分流道44与第三流道45连通,所述第三流道45一端与所述第七分流道41连通,另一端与所述核酸提取腔体15连通;
所述PCR反应腔体17通过出样流道46与所述核酸提取腔体15连通;
所述PCR Master Mix腔体27、引物腔体28、探针腔体29分别通过第十一分流道47、第十二分流道48、第十三分流道49与所述PCR反应腔体17连通;
所述第一分流道33、第二分流道34、第三分流道35、第四分流道37、第五分流道38、第六分流道39、第七分流道41、第八分流道42、第九分流道43、第十分流道44上分别对应的设有第一单向阀5、第二单向阀6、第三单向阀7、第四单向阀8、第五单向阀9、第六单向阀10、第七单向阀11、第八单向阀12、第十一单向阀31;
所述出样流道46上设有一个外接2ml废液管的单向阀16;
所述缓冲液I腔体18内含有缓冲液I,所述缓冲液II腔体19内含有缓冲液II,所述RNA酶抑制剂腔体20内含有RNA酶抑制剂,所述MIX1腔体21内含有MIX1溶液,所述DNaseI腔体22内含有DNaseI溶液,所述MIX2腔体23 内含有混合均匀的MIX2溶液,所述70%乙醇腔体24内含有混合均匀的70%乙醇溶液,所述缓冲液III腔体25内含有缓冲液III,所述MIX3腔体26内含有混合均匀的MIX3溶液,所述缓冲液V腔体30内含有缓冲液V,所述PCR MasterMix腔体27内含有混合均匀的PCR Master Mix溶液,所述引物腔体28内含有 PCR扩增引物,所述探针腔体29内含有TaqMan探针。
所述主体2呈扇形,由PC材料制作而成,半径为40mm,厚度为2mm。
一种提取人类全血中细菌总核酸的试剂盒,包括上述的微流控芯片。
上述微流控芯片应用于提取人类全血中细菌总核酸的方法,包括如下步骤:
步骤S1,从所述加样孔4向所述加样腔体3中加入人类全血样本和细菌的混合物;
步骤S2,开启所述第一单向阀5,以2000rpm的速率顺时针旋转离心3min,样品与缓冲液I在所述上核酸提取腔体15内混匀,低温冰上浴12min,充分裂解红细胞;
步骤S3,以12000rpm的速率在4℃时顺时针旋转离心5min,经所述第十单向阀16上外接的2ml废液管弃上清,开启所述第二单向阀6、第三单向阀7,样品与缓冲液II、缓冲液III在所述上核酸提取腔体15内混匀,室温孵育5min,以12000rpm的速率顺时针旋转离心5min,经所述第十单向阀16上外接的2ml 废液管弃上清;
步骤S4,开启所述第四单向阀8,样品与MIX1溶液在所述上核酸提取腔体 15内混匀,37℃室温孵育30min;
步骤S5,开启所述第五单向阀9,样品与DNaseI溶液在所述上核酸提取腔体15内混匀,涡旋10s,室温孵育5min;
步骤S6,开启所述第六单向阀10,样品与MIX2溶液在所述上核酸提取腔体15内混匀,涡旋直至沉淀溶解,室温静置2min;
步骤S7,瞬离转移样品至所述中带滤芯的核酸提取腔体15,全速离心2min,保存滤液;
步骤S8,开启所述第七单向阀11,样品与70%乙醇溶液在所述下带滤芯的核酸提取腔体15内混匀,10000rpm,离心20s,直至样品全部通过;
步骤S9,开启所述第八单向阀12,样品与缓冲液III在所述下带滤芯的核酸提取腔体15内混匀,10000rpm,离心20s,经所述单向阀16上外接的2ml废液管弃滤液;
步骤S10,开启所述第九单向阀13,样品与MIX3溶液在所述下带滤芯的核酸提取腔体15中心,室温孵育15min;
步骤S11,开启所述第十一单向阀31,样品与缓冲液V在所述下带滤芯的核酸提取腔体15内轻轻涡旋混匀,10000rpm,离心20s;
步骤S12,经多次洗脱离心后得最终样品以2500rpm高速逆时针旋转离心1 分钟,以强大的离心力使洗脱的核酸溶液进入PCR反应腔体17,并与PCR Master Mix、引物、探针结合。
步骤S13,将所述微流控芯片放入平板加热装置中进行PCR扩增;
步骤S14,PCR扩增完成后,将所述微流控芯片放在CCD光源下进行荧光检测;
所述PCR反应腔体17内的PCR扩增反应条件如下:50℃逆转录15~30min; 92~97℃预变性1~10min;93~96℃变性10~15s;55~63℃退火35~55s;38~45个循环。
上述实施例仅是本实用新型的较优实施方式,凡是依据本实用新型的技术实质对以上实施例所做的任何简单修饰、修改及替代变化,均属于本实用新型技术方案的范围内。
Claims (2)
1.一种提取人类全血中细菌总核酸的微流控芯片,其特征在于,包括定位孔(1)和主体(2),所述主体(2)包括位于加样腔体(3)上的加样孔(4)、加样腔体(3)、第一单向阀(5)、第二单向阀(6)、第三单向阀(7)、第四单向阀(8)、第五单向阀(9)、第六单向阀(10)、第七单向阀(11)、第八单向阀(12)、第九单向阀(13)、第十单向阀(16)、第十一单向阀(31)、核酸提取材料(14)、核酸提取腔体(15)、PCR反应腔体(17)、缓冲液I腔体(18)、缓冲液II腔体(19)、RNA酶抑制剂腔体(20)、MIX1腔体(21)、DNaseI腔体(22)、MIX2腔体(23)、70%乙醇腔体(24)、缓冲液III腔体(25)、MIX3腔体(26)、PCRMaster Mix腔体(27)、PCR引物腔体(28)、PCR反应探针腔体(29)和缓冲液V腔体(30);
所述核酸提取材料(14)位于所述核酸提取腔体(15)内;
所述核酸提取腔体(15)的上下带有两种不同的滤芯,滤芯将其内部分隔为上核酸提取腔体、中带滤芯的核酸提取腔体和下带滤芯的核酸提取腔体;
所述加样腔体(3)通过进样流道(32)与所述核酸提取腔体(15)连通;
所述缓冲液I腔体(18)、缓冲液II腔体(19)、RNA酶抑制剂腔体(20)分别通过第一分流道(33)、第二分流道(34)、第三分流道(35)与第一流道(36)连通,所述第一流道(36)一端与所述第一分流道(33)连通,另一端与所述核酸提取腔体(15)连通;
所述MIX1腔体(21)、DNaseI腔体(22)、MIX2腔体(23)分别通过第四分流道(37)、第五分流道(38)、第六分流道(39)与第二流道(40)连通,所述第二流道(40)一端与所述第四分流道(37)连通,另一端与所述核酸提取腔体(15)连通;
所述70%乙醇腔体(24)、缓冲液III腔体(25)、MIX3腔体(26)、缓冲液V腔体(30)分别通过第七分流道(41)、第八分流道(42)、第九分流道(43)、第十分流道(44)与第三流道(45)连通,所述第三流道(45)一端与所述第七分流道(41)连通,另一端与所述核酸提取腔体(15)连通;
所述PCR反应腔体(17)通过出样流道(46)与所述核酸提取腔体(15)连通;
所述PCR Master Mix腔体(27)、引物腔体(28)、探针腔体(29)分别通过第十一分流道(47)、第十二分流道(48)、第十三分流道(49)与所述PCR反应腔体(17)连通;
所述第一分流道(33)、第二分流道(34)、第三分流道(35)、第四分流道(37)、第五分流道(38)、第六分流道(39)、第七分流道(41)、第八分流道(42)、第九分流道(43)、第十分流道(44)上分别对应的设有第一单向阀(5)、第二单向阀(6)、第三单向阀(7)、第四单向阀(8)、第五单向阀(9)、第六单向阀(10)、第七单向阀(11)、第八单向阀(12)、第十一单向阀(31);
所述出样流道(46)上设有一个外接2ml废液管的单向阀(16);
所述缓冲液I腔体(18)内含有缓冲液I,所述缓冲液II腔体(19)内含有缓冲液II,所述RNA酶抑制剂腔体(20)内含有RNA酶抑制剂,所述MIX1腔体(21)内含有MIX1溶液,所述DNaseI腔体(22)内含有DNaseI溶液,所述MIX2腔体(23)内含有混合均匀的MIX2溶液,所述70%乙醇腔体(24)内含有混合均匀的70%乙醇溶液,所述缓冲液III腔体(25)内含有缓冲液III,所述MIX3腔体(26)内含有混合均匀的MIX3溶液,所述缓冲液V腔体(30)内含有缓冲液V,所述PCR Master Mix腔体(27)内含有混合均匀的PCRMaster Mix溶液,所述引物腔体(28)内含有PCR扩增引物,所述探针腔体(29)内含有TaqMan探针。
2.根据权利要求1所述的一种提取人类全血中细菌总核酸的微流控芯片,其特征在于,所述主体(2)呈扇形,由PC材料制作而成,半径为40mm,厚度为2mm。
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CN201821351705.8U CN208869582U (zh) | 2018-08-21 | 2018-08-21 | 一种提取人类全血中细菌总核酸的微流控芯片 |
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Cited By (2)
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---|---|---|---|---|
CN110157702A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-08-23 | 中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地 | 一种用于提取珊瑚rna样品的采集操作台 |
CN110938523A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-03-31 | 深圳市华迈生物医疗科技有限公司 | 用于sat的离心式微流控芯片、系统及检测方法 |
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2018
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CN110938523A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-03-31 | 深圳市华迈生物医疗科技有限公司 | 用于sat的离心式微流控芯片、系统及检测方法 |
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