CN101550458B

CN101550458B - 食品中甲型肝炎病毒的检测方法

Info

Publication number: CN101550458B
Application number: CN 200910039389
Authority: CN
Inventors: 高东微; 莫雪梅
Original assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2009-05-12
Filing date: 2009-05-12
Publication date: 2011-11-09
Anticipated expiration: 2029-05-12
Also published as: CN101550458A

Abstract

本发明公开了一种食品中甲型肝炎病毒的检测方法，该检测方法包括以下步骤：1)待测样品的处理；2)待测样品RNA的提取；3)RNA反转录；4)SYBR Green I荧光定量PCR反应；5)检测结果的判定：当待测样品的循环阈值小于33时，判定为甲型肝炎病毒阳性；当待测样品的循环阈值大于35时，判定为甲型肝炎病毒阴性；当待测样品的循环阈值≥33且≤35时，视为可疑样品，重新检测一次的检测结果仍然在此范围内，则判断为甲型肝炎病毒阴性。本发明所述的检测方法具有快速、灵敏性及特异性高以及可定量的优点。

Description

食品中甲型肝炎病毒的检测方法

技术领域

本发明涉及生物工程，更具体地说，本发明涉及一种食品中甲型肝炎病毒的检测方法。

背景技术

甲型病毒性肝炎是一种严重危害广大人民群众身体健康的常见病，其是由甲型肝炎病毒感染引起的。甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)为小核糖核酸病毒科嗜肝病毒属，是一种无包膜单股正链RNA病毒。甲型肝炎病毒呈全世界分布，我国为高发区之一，其发病率十分高。甲型肝炎病毒主要通过粪-口消化道途径引起人类感染，水产品、蔬菜、水等食品可因受污染充当传播媒介，引起甲型肝炎的发生和流行。在世界范围内，大约有7％的有关传染性甲肝病例归因于进食生的或未经适当烹制的贝类、蔬菜、水果等食物。我国出口美国的贝类等食品曾多次因检测出HAV而被禁止出口，极大影响了我国产品的国际形象。因此，建立有效的检测食品中甲型肝炎病毒的方法对于保障广大人民群众的健康具有重要的意义。

目前，甲肝病毒的检测方法主要有以下几种，但均存在不足之处：(1)细胞培养法：此方法是利用甲肝病毒在寄主细胞内繁殖复制的特点，通过体外培养甲肝病毒感染的细胞30～60天后，观察细胞病变情况，此方法时间周期长，操作过于复杂，不适合食品中甲肝病毒的检测；(2)ELISA方法：主要是通过检测血清中抗HAV-IgG抗体，但是目前ELISA方法检测的灵敏度以及特异性都较低，漏检率较高；(3)RT-PCR方法：该方法主要是通过对甲肝病毒的目的基因片段的扩增进行检测，但是目前RT-PCR方法灵敏度比较低，甲肝病毒的检测下限一般仅约为10^3.0个TCID₅₀。

荧光定量PCR技术是将荧光能量传递技术，应用于常规多聚酶链式反应(PCR)中，通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用，能量从供体发色团转移到受体发色团，受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与产量成正比，从而达到定量目的。荧光定量PCR技术具有特异性以及灵敏度更强、有效解决污染问题、自动化程度高、实时、准确等特点，目前已在微生物、动植物基因工程和医学领域中得到广泛应用。

在对病毒的检测方面，应用荧光定量PCR技术检测病毒不仅可以定性，还可以检测出病毒量的多少，为临床诊断和食品检测等提供了强有力的依据。目前荧光定量PCR技术已经应用于许多病原体的检测，比如：乙型肝炎病毒、尖锐湿疣皮损中的HPV-DNA、与鼻咽癌关系密切的EB病毒、猪内生逆转录酶病毒、艾滋病病毒等商品化的试剂盒已经上市。但是，目前已公开的应用荧光定量PCR技术检测食品中甲肝病毒的方法仍未完善。因此，研究专门针对食品中甲型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，对提高食品中甲肝病毒的检测水平以及保障我国食品安全均具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种食品中甲型肝炎病毒的检测方法，用以有效地对食品中的甲型肝炎病毒进行提取以及定量检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种食品中甲型肝炎病毒的检测方法，包括以下步骤：

1)待测样品的处理；

2)待测样品RNA的提取：使用Trizol提取法，对经过步骤1)处理的待测样品进行RNA提取；

3)RNA反转录：使用二步法反转录PCR(RT-PCR)试剂盒，以步骤2)所提取得到的RNA为模板进行反转录；

4)SYBR Green I荧光定量PCR反应：以步骤3)所得到的RNA反转录产物为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR反应；

5)检测结果的判定：当待测样品的循环阈值(Ct值)小于33时，判定为甲型肝炎病毒阳性；当待测样品的循环阈值(Ct值)大于35时，判定为甲型肝炎病毒阴性；当待测样品的循环阈值(Ct值)≥33且≤35时，视为可疑样品，重新检测一次的检测结果仍然在此范围内，则判断为甲型肝炎病毒阴性。

循环阈值(Ct值)的含义是在PCR循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数。Ct值可以从全自动荧光实时PCR检测仪(Light Cycler检测仪)中直接读取。

在本发明中，针对不同食品种类的待测样品提供相应的处理方法。其中，水产品、肉类、蔬菜、水果、包点类样品主要采用PEG-8000和氯仿进行处理；饮料类样品主要采用AlCl₃和PEG-6000进行处理。

在本发明中，所述RNA反转录的反应体系包括以下组分：10×RNA反转录缓冲液1μl、25mmol/L Mg²⁺2μl、10μmol/L dNTPs各1μl、AMV反转录酶0.5μl、RNA抑制酶0.25μl、随机引物0.5μl、模板1μl以及超纯水3.25μl。反应循环参数如下：30℃ 10分钟；42℃ 30分钟；95℃ 5分钟；5℃ 5分钟。

在本发明中，所述SYBR Green I荧光定量PCR反应的反应体系包括以下组分：2×SYBRGreen I荧光定量PCR反应试剂混合物10μl、1μmol/L正向引物2μl、1μmol/L反向引物2μl、模板5μl以及超纯水1μl。反应循环参数如下：第一步：94℃ 2分钟；第二步：95℃ 15秒，55℃ 15秒，72℃ 20秒，40个循环。

在上述PCR反应体系中，所采用的正向引物为：5’-CTCCAGAATCATCTCCAAC-3’；所采用的反向引物为：5’-CAGCACATCAGAAAGGTGAG-3’。

本发明是针对食品中的甲肝病毒，采用荧光定量PCR技术来定量检测甲肝病毒，对不同的食品类型(包括水产品、肉类、蔬菜、水果、包点类、饮料类等)样品的甲肝病毒富集及提取提供了相应的方法，并且建立了稳定的SYBR Green I荧光定量PCR检测甲肝病毒的技术。本发明采用此荧光定量PCR技术来检测食品中的甲肝病毒，解决了以往食品甲肝病毒检测中耗时长、灵敏度及特异性低、漏检率高等缺点，具有快速(运用全自动荧光实时PCR检测仪建立实时扩增曲线)、灵敏性及特异性高(病毒最低检出限达10^1.0TCID₅₀)以及可定量的优点，对保障我国日常以及进出口食品的安全具有重要的意义和应用价值。

附图说明

图1是甲肝病毒标准样品经荧光定量PCR法检测所得的动力学曲线；

图2是甲肝病毒荧光定量PCR法的标准曲线；

图3是部分待测样品经荧光定量PCR法检测甲型肝炎病毒含量的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的试剂均为分析纯；甲型肝炎减毒活疫苗由长春生物制品研究所生产；RNA提取用的Trizol试剂购自美国invitrogen公司；二步法反转录PCR试剂盒购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司；2×SYBR Green I荧光定量PCR反应试剂混合物购自北京百泰克公司(Biotake Corporation)；实施例中所使用的主要仪器为全自动荧光实时PCR检测仪(LightCycler检测仪，购自德国Roche公司)、高速冷冻离心机(购自美国Sigma公司)。

实施例一：引物的设计与合成

根据Genbank数据库的甲肝序列，运用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，引物序列见表1。

表1甲型肝炎病毒引物序列

引物	序列(5’-3’)
		正向引物	CTCCAGAATCATCTCCAAC
反向引物	CAGCACATCAGAAAGGTGAG

引物的合成采用固相亚磷酰胺三酯法，委托上海英骏生物技术有限公司完成。

实施例二：标准样品的处理

将甲型肝炎减毒活疫苗粉末用1.0ml注射用水溶解，其所含活病毒量为10^7.0TCID₅₀，置4℃保存备用。

将上述甲型肝炎减毒活疫苗溶液分别稀释成10^5.0TCID₅₀、10^4.0TCID₅₀、10^3.0TCID₅₀、10^2.0TCID₅₀、10^1.0TCID₅₀、10⁰TCID₅₀共6个浓度梯度，置4℃保存备用。

实施例三：待测样品的处理

1、贝类样品的处理

解剖取下贝类中的肠道组织，取1.5g样品加入15ml Tris_HCL缓冲液(pH＝7.4，0.05mol/L)，冰上匀浆；将匀浆液装入50ml离心管，37℃温育30min；4℃下，5,000g离心20min，收上清液至一新管；按上清液量的10％浓度加PEG-8000，按终浓度为0.4mol/L加入NaCl，4℃下放置过夜；次日，4℃下，10,000g离心5min，取沉淀物；向沉淀物中加入Tris_HCL缓冲液10ml，充分溶解后加入等量氯仿，室温振荡30min；4℃下，2,000g离心30min，取上层水相，置-20℃保存备检。

2、肉类样品的处理

直接称取1.5g肉类产品(例如：猪肉、牛肉、羊肉等)，其余处理步骤同上述贝类样品的处理步骤。

3、蔬菜类样品的处理

直接称取蔬菜的茎部1.5g，其余处理步骤同上述贝类样品的处理步骤。

4、水果类样品的处理

直接称取1.5g水果果实(含果皮以及果肉)，其余处理步骤同上述贝类样品的处理步骤。

5、包点类样品的处理

直接称取1.5g包点类样品(例如：饼干、面包、蛋糕等)，其余处理步骤同上述贝类样品的处理步骤。

6、饮料类样品的处理

饮料(例如：水、果汁等)中的甲型肝炎病毒采用吸附-洗脱法进行浓缩，即用1mol/L HCl溶液将1L饮料样品的pH值调至3.5，加入终浓度为0.0005mol/L的AlCl₃，混匀，静置30min后用净水滤器进行抽滤，饮料样品全部滤过后用pH值为10.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液进行洗脱，洗脱液置透析袋中用PEG-6000进行透析，在4℃条件下，将洗脱液浓缩至0.2mL左右，置-20℃冻存备检。

实施例四：样品RNA的提取

使用Trizol提取法，分别提取上述经处理的标准样品和待测样品的RNA，具体提取步骤如下：

A、取140μl样品，加入0.5ml Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；

B、12,000g离心5min，弃沉淀；

C、按200μl氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min；

D、4℃下，12,000g离心15min；

E、吸取上层水相，至另一离心管中；

F、按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇，混匀后室温放置5min-10min；

G、4℃下，12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；

H、按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

I、4℃下，8,000g离心5min，尽量弃上清；

J、室温晾干或真空干燥5min-10min。

提取得到的RNA样品置-80℃保存备用。使用时，可用50μl无Rnase超纯水溶解该RNA样品，55℃-60℃下放置5min-10min。

实施例五：RNA反转录

使用二步法反转录PCR试剂盒，以提取得到的RNA为模板进行反转录。反转录反应体系为10μl，反应体系的各种组分及其用量见表2。

表2 RNA反转录反应体系

组分	浓度	加样量
			10×RNA反转录缓冲液	--------	1μl
Mg²⁺	25mmol/L	2μl
			dNTPs	各10μmol/L	各1μl
AMV反转录酶	--------	0.5μl
			RNA酶抑制剂	--------	0.25μl
随机引物	--------	0.5μl
			模板	--------	1μl
无Rnase超纯水	--------	3.25μl
			总体积	--------	10μl

反转录反应循环参数如下：30℃ 10分钟；42℃ 30分钟；95℃ 5分钟；5℃ 5分钟。

实施例六：SYBR Green I荧光定量PCR反应

以RNA的反转录产物为模板，在全自动荧光实时PCR检测仪中进行SYBR Green I荧光定量PCR反应，反应体系的各种组分及其用量见表3。

表3 SYBR Green I荧光定量PCR反应体系

组分	终浓度	加样量
			2×SYBR Green I荧光定量PCR反应试剂混合物	--------	10μl
正向引物	1μmol/L	2μl
			反向引物	1μmol/L	2μl
模板	--------	5μl
			超纯水	--------	1μl
总体积	--------	20μl

SYBR Green I荧光定量PCR反应循环参数如下：第一步：94℃ 2分钟；第二步：95℃ 15秒，55℃ 15秒，72℃ 20秒，40个循环。

实施例七：标准曲线的建立

取实施例二所制得的10^5.0TCID₅₀、10^4.0TCID₅₀、10^3.0TCID₅₀、10^2.0TCID₅₀、10^1.0TCID₅₀、10⁰TCID₅₀共6个浓度梯度的甲型肝炎减毒活疫苗溶液标准样品，以超纯水作为阴性对照样品，分别进行RNA提取、RNA反转录以及SYBR Green I荧光定量PCR反应。

(1)经实施例一、四、五和六所建立的荧光定量PCR法进行测定，得到各浓度的标准样品的动力学曲线(见图1)，其中纵坐标为荧光强度，横坐标为循环数。图1中的甲肝病毒荧光定量PCR法动力学曲线显示，甲肝病毒滴度(TCID₅₀)在10^1.0TCID₅₀～10^5.0TCID₅₀范围内的反应体系有明显的荧光增长，而10⁰TCID₅₀和阴性对照均无明显荧光增长，因此该甲肝病毒荧光实时PCR检测体系的最低检出限10_1.0TCID₅₀。

循环阈值(Ct值)的含义是在PCR循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数。Ct值可以从全自动荧光实时PCR检测仪直接读取。

由图1所示的甲肝病毒荧光定量PCR法动力学曲线可以得出检测结果的判断标准：当待测样品的Ct值小于33时，判定为甲型肝炎病毒阳性；当待测样品的Ct值大于35时，判定为甲型肝炎病毒阴性；当待测样品的Ct值≥33且≤35时，视为可疑样品，重新检测一次的检测结果仍然在此范围内，则判断为甲型肝炎病毒阴性。

(2)图2是上述荧光定量PCR法的标准曲线，此标准曲线是根据图1所示的甲肝病毒荧光定量PCR法动力学曲线，在全自动荧光实时PCR检测仪的系统上自动生成的，其中，x轴为病毒滴度的1g值(1gTCID₅₀)，y轴为Ct值。

图2所示的甲肝病毒荧光定量PCR法标准曲线的相关系数r＝0.9961，斜率为-3.052，截距为26.85，1gTCID₅₀值在1～5的范围内时，标准曲线呈良好的线性关系。

病毒滴度(TCID₅₀)与Ct值的线形关系表达式为：Ct＝-3.052*1gTCID₅₀+35.27，进行样品检测时，直接将样品所测得的Ct值代入上述表达式，即可计算出其病毒滴度。

实施例八：食品中甲型肝炎病毒的检测

运用实施例一、四、五和六所建立的荧光定量PCR法，分别对实施例三中经处理的待测样品进行RNA提取、RNA反转录以及SYBR Green I荧光定量PCR反应，测定其Ct值。

检测结果的判定标准：当待测样品的Ct值小于33时，判定为甲型肝炎病毒阳性；当待测样品的Ct值大于35时，判定为甲型肝炎病毒阴性；当待测样品的Ct值≥33且≤35时，视为可疑样品，重新检测一次的检测结果仍然在此范围内，则判断为甲型肝炎病毒阴性。

分别将待测样品所测得的Ct值代入实施例七所述的标准曲线的表达式中，计算出各待测样品的病毒滴度(TCID₅₀)。

在随机抽查的10份样品(生蚝、扇贝、菠菜、生菜、猪肉、羊肉、苹果、草莓、蛋糕和矿泉水各1份)中，有2份样品(生蚝、扇贝)呈阳性，甲肝病毒滴度分别为3.69×10^2.0TCID₅₀、1.56×10^2.0TCID₅₀，其他抽查样品均为阴性(见图3)。

Claims

1.一种食品中甲型肝炎病毒的检测方法，包括以下步骤：

1)待测样品的处理：水产品、肉类、蔬菜、水果、包点类样品采用PEG-8000和氯仿进行处理，饮料类样品采用AlCl₃和PEG-6000进行处理；所述包点类样品为饼干、面包或蛋糕；

3)RNA反转录：使用二步法反转录PCR试剂盒，以步骤2)所提取得到的RNA为模板进行反转录；

4)SYBR Green I荧光定量PCR反应：以步骤3)所得到的RNA反转录产物为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR反应；其中，所述SYBR Green I荧光定量PCR反应的反应体系包括以下组分：2×SYBR Green I荧光定量PCR反应试剂混合物10μl、1μmol/L正向引物2μl、1μmol/L反向引物2μl、模板5μl以及超纯水1μl；所述SYBR Green I荧光定量PCR反应的循环参数如下：第一步：94℃2分钟；第二步：95℃15秒，55℃15秒，72℃20秒，40个循环；所述的正向引物为5’-CTCCAGAATCATCTCCAAC-3’，所述的反向引物为5’-CAGCACATCAGAAAGGTGAG-3’；

5)检测结果的判定：当待测样品的循环阈值小于33时，判定为甲型肝炎病毒阳性；当待测样品的循环阈值大于35时，判定为甲型肝炎病毒阴性；当待测样品的循环阈值≥33且≤35时，视为可疑样品，重新检测一次的检测结果仍然在此范围内，则判断为甲型肝炎病毒阴性。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述RNA反转录的反应体系包括以下组分：10×RNA反转录缓冲液1μl、25mmol/L Mg²⁺2μl、10μmol/L dNTPs各1μl、AMV反转录酶0.5μl、RNA酶抑制剂0.25μl、随机引物0.5μl、模板1μl以及超纯水3.25μl。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述RNA反转录的循环参数如下：30℃10分钟；42℃30分钟；95℃5分钟；5℃5分钟。