CN103320535B - 一种鉴别猪瘟病毒野毒株与疫苗株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别猪瘟病毒野毒株与疫苗株的方法。本发明在两者共同的保守区域设计了用于鉴别猪瘟野毒株与疫苗弱毒株的专用引物，其特异性好，能够很好的扩增出野毒株与疫苗弱毒株，结合RT-PCR与HRM技术，能够明显的区分野毒株与疫苗毒株。本发明方法是一种简便、快捷、实用的鉴别猪瘟病毒野毒株与疫苗株的新型技术。

Description

一种鉴别猪瘟病毒野毒株与疫苗株的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别猪瘟病毒野毒株与疫苗株的方法。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV) 引起的一种以患猪高热稽留、出血和高死亡率为主要特征的接触性和高度致死性疾病,被世界动物卫生组织列为A类传染病。

CSFV基因组长约12.3kb，为单股线状正链RNA,由5’UTR、ORF和3’UTR构成。ORF编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白。从5’端到3’端,CSFV的ORF可翻译4种结构蛋白（C,Ems,El,E2)和8种非结构蛋白(Npro,P7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A,和NS5B)。其中囊膜糖蛋白E2基因是诱导产生保护性中和抗体的主要抗原结构蛋白；CSFV的3’UTR被认为与病毒基因组的复制、翻译以及复制和翻译的调控有关。

中国在1954年就成功研制出了猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV株),被世界公认是最优秀的猪瘟疫苗并应用至今。但由于HCLV株免疫猪群在血清学上无法区分是疫苗接种产生的抗体还是由于野毒株感染产生的抗体,因此西欧等国家一直奉行不接种政策,阻碍了HCLV株的推广应用。

在CSFV的诊断方面相继建立了病毒分离、动物试验（如兔体交叉免疫试验）和多种血清学诊断方法。用于检测抗体的主要有中和试验、琼脂扩散试验、补体结合反应试验、间接血凝试验、Dot-ELISA、E2-ELISA、E^rns-ELISA；PPA-ELISA和直接免疫荧光试验主要用于检测抗原；间接免疫荧光试验既可以用于检测抗体又可以检测抗原。但病毒分离和动物试验不同程度的存在诊断周期长、操作繁琐、检出率低等不足；常规的血清学试验又都存在一定的血清学交叉反应，难以将CSFV与同属的BVDV和BDV感染区分开，也很难鉴别CSFV野毒株感染和疫苗接种。几种具体的检测方法介绍如下：

（1）病毒分离鉴定：

采用细胞培养法分离病毒诊断猪瘟具有高灵敏度。采集病毒的血液、可疑脏器组织，经研磨、离心、过滤除菌，接种于对猪瘟病毒敏感的细胞系如PK-15、PK-2a、ST等；培养后用荧光抗体染色法检测细胞培养物中的病毒。该方法最大的缺点是费时、昂贵，不易对大量样品进行检测。

（2）动物接种方法，主要包括三种：

①接种可疑病料乳剂或新鲜血液于易感仔猪(10～20kg，母源抗体下降至不足以保护时，并且未经过猪瘟疫苗免疫)，如果猪接种后1周左右发病，可采血分离病毒，如果3周左右发病，可采血检测猪瘟中和抗体，并用强毒攻击。如果分离到CSFV或接种产生CSFV中和抗体，并对猪瘟强毒攻击呈现免疫性，即可判断猪瘟阳性。

②猪瘟高免血清皮下注射试验猪1头，然后接种待检病料，另一头猪不注射高免血清，只注射待检病料，前者不发病，后者发病，即可判断猪瘟阳性。

③家兔接种试验。原理是CSFV野毒不引起家兔体温反应，但能使家兔产生免疫力，而C株猪瘟兔化弱毒能使家兔产生定型发热反应，但对已产生免疫力的家兔不发生体温反应。方法是将待检病料乳剂上清，经耳静脉注射兔，每日测温2～3次，一周后耳静脉接种C株兔化弱毒，每天测体温，根据体温反应判定结果。用本方法能检出被查病料中可能存在的猪瘟病毒强毒和兔化弱毒株。缺点是试验周期较长，9d才能出结果。

动物接种法特异性高，可直接确诊，但检测周期长，成本高，且费时费力，还需保证生物安全，因此一般情况下不采用。

（3）酶联免疫吸附试验(ELISA)：

ELISA原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。该方法具有高度敏感性和特异性，且它的试剂比较稳定，操作简单且无放射性危害，特别是商品试剂盒和自动化仪器的应用使其成为一种广泛使用的免疫标记技术。大量用于猪瘟检查的ELISA方法运应而生。ELISA方法检查猪瘟抗体已经比较成熟，国内外均形成了成熟的商品化试剂盒，在实验室与基层都得到了很好的运用。但在检查猪瘟病原方面，市场上虽已有商品化试剂盒，目前仍然存在敏感性不够，非特异性明显的问题，仅适用于发病猪的检测，在温和性猪瘟与持续性带毒较为普遍的情况下，猪瘟抗原ELISA方法还有待提高。

（4）RT-PCR：

RT-PCR是指从血液、病料组织中提取病毒RNA,进行反转录和PCR扩增，最后电泳紫外灯下观察有无目的条带的方法。用此方法检测CSFV特异性强、灵敏度高、重复性好，整个过程1d内即可完成，能达到快速检测的目的。且RT-PCR还可区别与CSFV相关的病毒，如BVDV，BDV等。

此外分子诊断技术还有核酸探针、基因芯片技术等。大量研究证明利用分子生物学方法检测猪瘟抗原，其敏感性是传统方法无法比拟的，尤其是real-time RT-PCR和RT-PCR方法极为灵敏。PCR检测技术虽然特异性高，但该方法是根据PCR扩增产物的电泳条带大小来分析不同亚群，所以该方法目前还做不到高通量的检测，而亚群特异性探针价格昂贵也限制了荧光定量PCR检测方法的推广应用。还可通过分子测序分析区分疫苗毒株与野毒株，但该方法操作费时，工作量大，价格昂贵，不适于快速鉴别。因此，寻求一种快速、简便的鉴别方法是非常有科研及应用价值的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种鉴别猪瘟病毒野毒株与疫苗株的方法。

本发明所采取的技术方案是：

用于鉴别猪瘟病毒野毒株与疫苗株的引物，包括P1、P2，序列如下：

P1: GATGACGCTGATAGGGAG （SEQ ID NO:1）；

P2: GCCCGTTAGAAATTACCT （SEQ ID NO:2）。

一种鉴别猪瘟病毒野毒株与疫苗株的方法，包括以下步骤：从样品中提取RNA，以P1、P2为扩增引物，加入荧光饱和染料，进行RT-PCR扩增；扩增结束后，进行HRM分析，鉴别猪瘟病毒野毒株和疫苗株；其中，所用引物P1、P2如权利要求1所述。

优选的，包括以下步骤： 

1)        从样品中提取RNA；

2)        以样品RNA为模板，加入引物P1、P2和荧光饱和染料，进行一步法RT-PCR扩增； 

3)        扩增结束后，进行HRM分析，鉴别猪瘟病毒野毒株和疫苗株。

一步法RT-PCR扩增反应体系如下：

样品RNA                       1～5μl，

PrimeScript 1 step Enzyme Mix  0.5μl，

引物P1                        0.5μl，

引物P2                        0.5μl，

2×1 Step Buffer               6.25μl，

LC green染料                  0.5μl，

加RNA free ddH₂O补足至12.5μl。

一步法RT-PCR扩增反应程序如下：50℃ 30 min ；94℃预变性2min；94℃变性35s、54℃退火35s、72℃延伸30s，循环35次；72℃终延伸10min。

优选的，包括以下步骤：

1)        从样品中提取RNA；

2)        将样品RNA反转录获得cDNA后，以cDNA为模板，加入引物P1、P2和荧光饱和染料，进行二次扩增；

3)        扩增结束后，进行HRM分析，鉴别猪瘟病毒野毒株和疫苗株。

二次扩增反应体系如下：

cDNA                4μl，

Premix Ex Taq      10μl，

引物P1             0.8μl，

引物P2             0.8μl，

LC green染料       0.4μl，

加RNA free ddH₂O补足至20μl。

二次扩增反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸30s，循环35次；72℃终延伸8min。

本发明的有益效果是：

本发明所设计的引物特异性好，能很好的扩增出猪瘟病毒野毒株和疫苗株，保证了高质量的PCR反应；本发明还提供了一步RT-PCR法和两步PCR法，利用本发明所述引物扩增得到PCR产物，结合HRM分析，能够明显的区分野毒与疫苗毒。

本发明PCR结合HRM分析鉴别猪瘟病毒野毒株与疫苗株的方法灵敏度高；HRM检测速度快且能进行高通量分析，5～10分钟即可完成96/384孔板的PCR产物检测，极大缩短了检测时间；费用低，每个样品的饱和染料成本仅为1.6元；准确性高、特异性好，重复性达到100%。

附图说明

图1是质粒PCR产物的电泳图；

图2是CSFV的模拟峰型化熔解曲线图； 

图3是CSFV质粒样品标准化熔解曲线图；

图4是CSFV质粒样品峰型化熔解曲线图；

图5是CSFV质粒样品差异化熔解曲线图；

图6是一步法RT-PCR产物的电泳图；

图7是CSFV临床样品标准化熔解曲线图；

图8是CSFV临床样品峰型化熔解曲线图；

图9是CSFV临床样品差异化熔解曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步阐述本发明内容。

实施例1

为了验证本发明方法的可行性与可靠性，构建标准质粒，保存各质粒序列（经序列测序正确），之后扩增保存的质粒序列进行HRM分析作为标准对照。

（1）标准质粒样品的构建：

①取通过测序确定为CSFV的四株野毒株(2株来源于山西某猪场命名为D7、T144，另两株来源于广东湛江某猪场命名为Z1、Z2)和一株疫苗株（广东省永顺生物制药生产的细胞苗，即HCLV株）的RNA，分别反转录为cDNA；

②分别将反转录得到的cDNA进行PCR扩增，纯化；

③用TAKARA公司的试剂盒将纯化后的cDNA扩增产物分别连接至pMD-18T载体中，

载体连接反应体系（10μl）如下：

Ligation Solution I	5μl
		纯化的cDNA	4.5μl
pMD-18T vector	0.5μl
			10μl

 反应条件：16℃，4h以上。

④取-70℃冻存的感受态细胞TOP10于冰上融化后，加入步骤③连接产物5μl，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90sec，再迅速放回冰上2min。加入400μl LB液体培养基，37℃ 200r/min～220r/min振荡培养45min，以恢复质粒的抗性。4℃ 4000r/min离心5min，弃去上清400μl，将剩余的100μl菌液混匀后涂氨苄平板，37℃培养30min（平皿正放），待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养12h～16h至单菌落出现。用灭菌牙签挑取单菌落于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养12h～16h，分别获得四株野毒株D7、T144、Z1、Z2和一株疫苗株的标准质粒样品，加甘油于-80℃保存。

（2）质粒的抽提：用TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒提取标准质粒。

（3）质粒PCR扩增：

PCR反应体系（20μl）：

ddH2O	6μl
		Premix Taq	10μl
上游引物（P1）	1μl
		下游引物（P2）	1μl
质粒模板	1μl
		LC green染料	1μl
	20μl

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；72℃终延伸8min。

图1为质粒PCR产物的电泳图。

（4）质粒扩增产物的模拟HRM分析：

质粒经测序后，利用在线软件进行模拟HRM分析，由图2可见，疫苗弱毒与野毒强毒株的HRM曲线差异明显，疫苗株与野毒株能有效区分开来。

（4）质粒扩增产物的HRM分析：

用Light Scanner96 HRM分析仪对PCR扩增产物进行分析。猪瘟病毒四株野毒株、一株疫苗株的HRM分析结果如图3～5所示。图3、图4、图5分别为标准化熔解曲线图、峰型化熔解曲线图和差异化熔解曲线图。从三种不同形式的熔解曲线图上可看出野毒株与疫苗株HRM曲线差异明显，可达到野毒株与疫苗株基因分型的鉴别目的。

标准化熔解曲线图是由原始熔解曲线图经过标准化处理后得到，最大限度的消除了由于起始模板浓度不同而造成荧光信号值的差异。峰型化熔解曲线图是对标准化熔解曲线图进行导数化处理后得到，峰型化熔解曲线图更加明显地反映了野毒株与疫苗毒株的差异。为了更好的区分野毒株和疫苗毒株，对熔解曲线图进行差异化处理，即把疫苗株的信号变化设为零，并与其他野毒株进行比较。

以质粒为模板的扩增产物的HRM图与模拟图一致，能够区分疫苗弱毒与野毒。

实施例2

临床样品PCR产物的HRM检测

（1）病料样品中猪瘟病毒RNA的提取：

用试剂盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0提取病料样品中的猪瘟病毒RNA，样品为血液、淋巴结、肝、脾、肾等组织（野毒样品来自于山西和广东的某猪场，疫苗株为广东省永顺生物制药生产）。

（2）猪瘟病毒一步法RT-PCR扩增：

利用PrimeScript one step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒（内含PrimeScript 1 step Enzyme Mix，2×1 Step Buffer等）对提取的猪瘟病毒RNA进行一步法RT-PCR扩增。

反应体系如下：以（1）中提取的RNA作为模板，根据实际浓度加入1～5μl的模板，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 加0.5μl，上下游引物P1、P2各加0.5μl，2×1 Step Buffer加6.25μl，LC green染料加0.5μl，用RNase Free dH₂O补足至12.5μl。

PCR反应程序：50℃ 30 min ；94℃预变性2min；94℃变性35s、54℃退火35s、72℃延伸30s ，循环35次；72℃终延伸10min。

扩增产物于-20℃保存。

图6为以RNA为模板一步法RT-PCR扩增产物的电泳图，M为DL1000Marker，S1～S3为野毒。

（3）猪瘟病毒两步法扩增：

以（1）中提取的RNA作为模板反转录获得cDNA。反转录体系和程序是：13μl体系包括RNA 5μl，P2 2μl, RNase Free dH₂O 6μl, 70℃保温10 min；再加入7μl 体系的试剂包括M-MLV 5×Reaction Buffer 4μl、dNTP（10mM）2μl、RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5μl、M-MLV RT 0.5μl，混匀，42℃ 孵育60min，95℃ 变性 5min。产物-20℃保存。

然后以cDNA作为模板，进行二次扩增。反应体系如下：cDNA 4μl，Premix Ex Taq 10μl，引物P1、P2各0.8μl，LC green染料 0.4μl，加无RNA酶的水补足至20μl。二次扩增反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸30s，循环35次；72℃终延伸8min。

扩增产物于-20℃保存。

（4）HRM分析：

将按照（1）中猪瘟病毒一步法RT-PCR扩增获得的产物在Light Scanner96 HRM分析仪上进行HRM分析，结果如图7～9所示。由图可见，临床样品的HRM曲线、质粒PCR HRM曲线和模拟HRM曲线的峰形基本相同，具有很好的符合性，野毒株、疫苗株具有特异性的HRM曲线，且该HRM曲线具有很好的稳定性，通过简单对比，即可快速鉴别猪瘟病毒野毒株和疫苗株。

对按照（2）中猪瘟病毒两步扩增法获得的产物进行HRM分析，结果与上述一致。

本发明所设计的引物特异性好，能很好的扩增出猪瘟病毒野毒株和疫苗株，为高质量的PCR反应提供了可靠的保证；本发明采用一步法RT-PCR扩增猪瘟病毒，可简化操作程序，提高反应效率，当然，也可根据需要采用两步法扩增猪瘟病毒，利于保存病毒cDNA；利用本发明所述引物扩增得到PCR产物，然后结合HRM分析，能有效的区分野毒株和疫苗株。

本发明PCR结合HRM的分析方法灵敏度高；HRM检测速度快且能进行高通量分析，5～10分钟即可完成96/384孔板的PCR产物检测，极大缩短了检测时间；费用低，每个样品的饱和染料成本为1.6元；准确性高、特异性好，重复性可高达100%。

<110>  广东省农业科学院动物卫生研究所

 

<120>  一种鉴别猪瘟病毒野毒株与疫苗株的方法

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gatgacgctg atagggag                                                     18

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gcccgttaga aattacct                                                     18

Claims (8)

1.用于鉴别猪瘟病毒野毒株与疫苗株的引物，包括P1、P2，序列如下：

P1: GATGACGCTGATAGGGAG （SEQ ID NO:1）；

P2: GCCCGTTAGAAATTACCT （SEQ ID NO:2）。

2.一种非用于疾病诊断的鉴别猪瘟病毒野毒株与疫苗株的方法，包括以下步骤：从样品中提取RNA，以P1、P2为扩增引物，加入荧光饱和染料，进行RT-PCR扩增；扩增结束后，进行HRM分析，鉴别猪瘟病毒野毒株和疫苗株；其中，所用引物P1、P2如权利要求1所述。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：包括以下步骤： 

1）从样品中提取RNA；

2）以样品RNA为模板，加入引物P1、P2和荧光饱和染料，进行一步法RT-PCR扩增； 

3）扩增结束后，进行HRM分析，鉴别猪瘟病毒野毒株和疫苗株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：扩增反应体系如下：

样品RNA   1μl，

PrimeScript 1 step Enzyme Mix   0.5μl，

引物P1 0.5μl，

引物P2 0.5μl，

2×1 Step Buffer  6.25μl，

LC green染料  0.5μl，

加RNA free ddH₂O补足至12.5μl。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：扩增反应程序如下：

50℃ 30 min ；94℃预变性2min；94℃变性35s、54℃退火35s、72℃延伸30s，循环35次；72℃终延伸10min。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）从样品中提取RNA；

2）将样品RNA反转录获得cDNA后，以cDNA为模板，加入引物P1、P2和荧光饱和染料，进行二次扩增；

3）扩增结束后，进行HRM分析，鉴别猪瘟病毒野毒株和疫苗株。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：二次扩增反应体系如下：

cDNA                4μl，

Premix Ex Taq      10μl，

引物P1             0.8μl，

引物P2             0.8μl，

LC green染料       0.4μl，

加RNA free ddH₂O补足至20μl。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：二次扩增反应程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸30s，循环35次；72℃终延伸8min。