CN104673939A - 一种猪瘟mPCR检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种猪瘟mPCR检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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马萍
曾智勇
李达
刘霞
唐宇
方英
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Abstract

本发明公开了一种猪瘟mPCR检测试剂盒，其特征在于：包含Part1和Part2，Part1：2×1 Step Buffer 12.5-25微升，RNase Free H2O 7.5-15微升，PrimeScript One Step Enzyme Mix 1-2微升，阳性对照；Part2：Solution A 200-400微升，Solution B 75-150微升，Rinse A 500-1000微升，Rinse B 800-1600微升，Elution Buffer 50-10微升，Spin Column 1支以上，Collection Tube 2支以上，薄壁PCR管1支，上样缓冲液1-2微升。现有的利用PCR检测和诊断的方法较多，且只能检测出存在猪瘟病毒感染，但不能区别是否为接种猪瘟病毒弱毒免疫和自然野毒所引起的感染；该二重PCR方法可一步同时区分猪瘟病毒弱毒免疫猪和野毒感染猪的鉴别，为首创。

Description

一种猪瘟mPCR检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及一种猪瘟mPCR检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）引起猪的一种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病，对养猪业危害十分严重，被国际兽疫局(OIE)列为l6种A类法定传染病之一，也是我国法定的一类动物疫病。CSFV RNA基因组全长12.3kb，含有单一的开放阅读框(ORF），可顺次翻译衣壳蛋白C和囊膜糖蛋白E1、E2、E3等4种结构蛋白以及3~5种非结构蛋白。其中，E2 (gp55)是最具免疫活性的囊膜糖蛋白，可诱导动物产生有效的免疫保护。猪瘟弱毒疫苗在中国的大规模应用，使猪瘟野毒感染和疫苗接种的区分变得非常困难但又十分必要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种猪瘟mPCR检测试剂盒及其使用方法，能快捷有效地区分弱毒免疫猪和野毒感染猪。
本发明的技术方案是：一种猪瘟mPCR检测试剂盒，包含Part1和Part2，Part1：2×1 Step Buffer 12.5-25微升，RNase Free H2O  7.5-15微升，PrimeScript One Step Enzyme Mix 1-2微升，阳性对照；Part2：Solution A 200-400微升，Solution B 75-150微升，Rinse A 500-1000微升，Rinse B 800-1600微升，Elution Buffer 50-10微升，Spin Column 1支以上，Collection Tube 2支以上，薄壁PCR管 1支，上样缓冲液1-2微升。
Part1零下20℃保存，Part2室温保存。
一种猪瘟mPCR检测试剂盒的使用方法，包含以下步骤：
（1）取病料样本，加入离心管中；后加入Solution A，振荡混匀后，室温放置；
（2）加入Solution B，混合均匀后，室温放置，后离心；将上清液转移到1#Collection Tube 中，加异丙醇和冰乙酸混匀；
（3）将Spin Column 安置于2#Collection Tube上；将步骤（2）的上清液转移至Spin Column中，离心，弃滤液；
（4）将Rinse A加入至上述Spin Column中，室温静置，离心，弃滤液；
（5）将Rinse B加入至Spin Column中，离心，弃滤液；再次离心；
（6）将Spin Column安置于离心管上，在Spin Column膜的中央处加入灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置；离心，洗脱病毒RNA/DNA，得到病料模板；
（7）mPCR扩增：2×1 Step Buffer 、PrimeScript One Step Enzyme Mix 、CSFV野毒上下游引物、CSFV疫苗毒上下游引物、上述病料模板和RNase Free H2O进行PCR扩增反应；
（8）取PCR产物及阳性对照分别与上样缓冲液混合均匀后，于1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，紫外灯下观察结果，即可。
首次使用前，在Rinse A中添加12.5mL的100%乙醇；在Rinse B中添加31.5mL的100%乙醇。
CSFV野毒上下游引物：
F2：5'- AGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTA -3'，
R2：5'- GCCGGCGCTAAATAAATAAAAAAT -3'，片段641bp。
CSFV疫苗毒上下游引物：
F1：5'-AGTAAGTAGCAAGACCGGGAAT-3'，
R1：5'-GGCGATAAATAAAAAAGAAAAAAAAG-3'，片段278bp。
本发明的有益效果：现有的利用PCR检测和诊断的方法较多，且只能检测出存在猪瘟病毒感染，但不能区别是否为接种猪瘟病毒弱毒免疫和自然野毒所引起的感染；该二重PCR方法可一步同时区分猪瘟病毒弱毒免疫猪和野毒感染猪的鉴别，为首创。
附图说明
图1为CSFV野毒、疫苗毒和野毒与疫苗毒混合物多重PCR方法检测结果；M：DL1000marker；1：CSFV野毒株多重PCR产物；2：疫苗多重PCR产物；3：野毒株与疫苗毒混合多重PCR产物；
图2为多重PCR特异性试验结果；M. DL1000marker；1:PRV；2:PRRSV；3:SIV；4:PCV2和CSFV混合物；
图3为多重PCR敏感性试验结果；M. DL1000 marker；1:101；2:100；3:10-1；4:10-2；5:10-3；6:10-4；7:10-5；8:10-6；
图4为多重PCR样本检测结果；M. DL2000 marker；1号样；2号样；3号样；4号样；5号样；6号样；7号样；8号样；9号样。
具体实施方式
1使用时请置于冰盒上使用。
2含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若不小心接触到眼睛或皮肤，请立即到医院进行处理。
3首次使用前，请在Rinse A添加12.5mL的100%乙醇，混合均匀；请在Rinse B添加31.5mL的100%乙
   醇，混合均匀。
4准备异丙醇（1%冰乙酸）：在99mL的异丙醇中加入1mL冰乙酸，混合均匀，应于室温密闭保存。操作时应戴上双层手套
实施例1
1 病料模板核酸RNA的提取
操作前，提前把所需移液器、tip头(全用RNA酶处理后的tip头)、试剂盒、一次性手套、异丙醇（1%冰乙酸）等放于工作台，紫外灯照射30min。操作时全部在工作内完成，且带双层手套。 Solution A和Solution B为DNA＆RNA一步法核酸提取试剂盒中的，一步法核酸提取试剂盒--TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA＆RNA Extraction Kit Ver.4.0购自大连宝生物工程有限公司。
（1）取200uL上述病料样本，加入1.5mL离心管（可用一般EP管）中；
（2）加入200uL的Solution A，剧烈振荡混匀后（用力在手上拍打），室温放置5min；
（3）加入75uL的Solution B，混合均匀后，室温放置5min。12000rpm离心5min；
（4）将上清液转移到新的Collection Tube（2mL,试剂盒中提供）中，加250uL异丙醇（1%冰乙酸），上下颠倒混匀；
（5）将试剂盒中的Spin Column 安置于另一新的Collection Tube（试剂盒提供）上；
（6）将上述操作（4）的上清液转移至Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液；（如Spin Column中有液体残留，可适当提高离心速度，再离心1min）
（7）将500uL的Rinse A加入至Spin Column中，室温静置1min，12000rpm离心1min，弃滤液；
（8）将800uL的Rinse B加入至Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液；(备注：首次使用需确认Rinse B中已经加入了指定体积的100%乙醇)
（9）再次进行12000rpm离心1min；
（10）将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50uL的灭菌蒸馏水（RNase Free）或Elution Buffer，室温静置1min；
（11）12000rpm离心1min，洗脱病毒RNA/DNA。
2 mPCR扩增
最佳反应程序：
反应体系为25μL，其中
2×1 Step Buffer                             12.5μL；
PrimeScript One Step Enzyme Mix              1μL；
CSFV野毒上下游引物                       各0.5μL；
CSFV疫苗毒上下游引物                     各0.5μL；
模板                                       各2μL
 RNase Free H2O                              7.5μL。
反应体系为50 μL，其中
2×1 Step Buffer                             25μL；
PrimeScript One Step Enzyme Mix              2μL；
CSFV野毒上下游引物                       各1μL；
CSFV疫苗毒上下游引物                     各1μL；
模板                                       各4μL
RNase Free H2O                             15μL。
反应程序：50℃ 40min；94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，35cycles；72℃ 10min.
3结果判定
取5 μL PCR产物及5 μL阳性对照分别与1 μL上样缓冲液混合均匀后，于1%的1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测（80V 45 min），紫外灯下观察结果。
若同时出现2条（278 bp和641 bp）特异性条带表明为CSFV野毒与疫苗毒感染；若出现278 bp大小的1条特异性条带表明为CSFV疫苗毒感染；若出现641 bp大小的1条特异性条带表明为CSFV野毒感染。
实施例2
   病毒核酸提取：参照实施例1。
引物设计
参照NCBI中上传的22个猪瘟基因序列进行对比分析，序列号如下：Alfort/187(X8739)，ALD(D49532)，Shimen(A F092448)，Alfort/Tubingen (J04358)，Bresci (M31769)，GXW202(AY367767)，85-12A (EU107748)，84- KS1  (EU107449)，92-TC1  (EU107752), LPC/PRK疫苗株(EU107754) ,LPC/TS疫苗(EU107753 ) , LPC/AHRI疫苗株(EU107752)，HCLV疫苗株(AF531433), C株疫苗株(Z46258)，俄国LK疫苗株(AF026718)，俄国CS疫苗株(AF099102),Porcivac疫苗株(AF026714), Povac疫苗株(AF026717),Riems疫苗株(U45477 ) , Riem疫苗株(AY259122 )，和Riems疫苗株(U45456)等基因序列，猪瘟病毒3' NTR富含T的插入序列片段的核普酸比对排列(从Alfort/187基因组位置12106 by-12185 bp )。
根据分析结果应用DNAStar、Oligo、MPprimer and MFE primer设计多重PCR引物，用于扩增目的基因片段。引物序列详见（表1）。
表1　扩增目的片段的引物
RT-PCR反应
单一RNA病毒RT-PCR反应。反应体系为25μL，2×1 step Buffer 12.5 μL、上下游引物各1μL，模板各1 μL，PrimeScript One Step Enzyme Mix1μL，RNase free H2O8.5 μL。反应程序：50℃ 40min；95 ℃ 5 min；95 ℃30 s；57℃30 s；72 ℃ 45s，共进行35个循环；72℃ 10 min。取5.0μL RT-PCR产物于1％琼脂糖凝胶上进行电泳测定。
RT-PCR产物的鉴定
将上述2种病毒的RT-PCR扩增片段的胶回收产物与pMD19-T载体16 ℃连接过夜，将连接产物转化至TOP10 感受态细胞，经Amp、IPTG、X-gal 筛选，挑取单个白色菌落扩大培养，送阳性菌液至上海英骏生物技术有限公司测序。
二重RT-PCR方法反应条件的优化
对二重RT-PCR 反应条件，包括退火温度( 55～63 ℃ )，引物量进行优化，以确定最佳反应条件。50 μL 二重RT-PCR 反应体系: 2×1 step Buffer 12.5 μL、模板各2 μL，上下游引物量（0.5μL -1.5μL ），PrimeScript One Step Enzyme Mix 2μL，add RNase free H2O to 50 μL。RT-PCR 反应条件：50℃ 40min；95 ℃ 5 min；94 ℃30 s；( 55～63 ℃ ) 30 s；72 ℃ 45s，共进行 35 个循环；72 ℃延伸10 min。扩增后取5.0 μL RT-PCR 产物于1％琼脂糖进行凝胶电泳测定。
二重 RT-PCR特异性检测
通过建立的二重RT-PCR方法分别对猪常见疫病猪瘟病毒( CSFV)、猪伪狂犬病毒( PRV)、猪圆环病毒（PCV2）、猪细小病毒病毒（PPV）、猪流行性腹泻病毒（PRRSV）和流感病毒（SIV）的核酸进行扩增，检测该方法是否具有特异性。
二重RT-PCR 敏感性检测
将提取的 PRRSV、SIV病毒核酸于蛋白质核酸仪测定浓度，并用RNase free H2O进行101、102、103、104、105倍稀释，分别取1 μL 相应倍比稀释的病毒核酸模板进行单一及二重RT-PCR反应，检测其敏感性。
重复性试验
用建立的多重PCR方法，对CSFV 野毒、疫苗毒株进行多次重复检测，并对换引物多重PCR检测以验证检测结果的可靠性。
临床样本检测
对收集来自于贵州省内的共32份临床病料进行二重RT-PCR检测，同时进行单一PCR 检测，以验证二者之间的符合率。
多重PCR方法的建立
通过固定引物及模板量，逐步优化退火温度、循环次数，最终确定多重PCR最佳循环次数和退火温度。试验结果显示：当反应循环次数为35，退火温度为58 ℃时多重PCR扩增效果最佳（图1）。最佳反应体系为50μL，50 μL二重RT-PCR 反应体系: 2×1 step Buffer 12.5 μL、模板各2 μL，上下游引物量（各1μL ），PrimeScript One Step Enzyme Mix 2μL，RNase free H2O 15 μL。RT-PCR 反应条件：50℃ 40min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 45s，共进行 35 个循环；72 ℃延伸10 min。
特异性检测
利用二重RT-PCR 检测方法分别对 PRV、PRRSV、SIV、PCV2和CSF野毒与疫苗毒混合物进行扩增，结果只有猪瘟野毒与疫苗毒混合物为阳性，其余均为阴性(图2) ，表明建立的二重RT-PCR方法特异性较好。
敏感性检测
对病毒的RNA 进行 10倍梯度稀释，在建立的二重RT-PCR检测方法反应条件下进行扩增，观察其敏感性。研究发现：二重RT-PCR中CSFV野毒和疫苗毒的核酸最低检测量分别为8.2×10－3ng和6.7×10－2ng (图3)。
 RT-PCR 产物的鉴定
将疫苗毒与野毒RT-PCR 产物连接pMD19-T载体后，转化 TOP10 感受态细胞，送上海英骏生物技术有限公司测序。结果表明，扩增片段分别为各自病毒的特异性基因片段。
临床样本检测
利用建立的二重RT-PCR 方法对送检9份临床样品进行检测，同时进行单重RT-PCR检测，研究发现建立的方法与单一PCR 检测结果符合率为96%。该方法共检出 CSFV 野毒阳性样本3份、疫苗毒阳性样本1份、野毒与疫苗毒混合检测阳性样本1份。  
多重PCR反应中，引物设计至关重要，它是决定多重PCR成败的关键。本发明中CSFV疫苗毒存在的插入序列设计2对特异性引物，应用Primer Premier 6.0、Oligo 7.4、MFEprimer和MPprimer软件进行综合分析，充分考虑PRV G+C含量较高而PPV G+C含量较低的问题，Tm值应该控制在55℃～63℃，确保在某一温度都能进行很好的PCR反应，尽量避免引物间非特异性扩增。实验通过大量前期试验先确定单项PCR反应的最佳条件范围，为多重PCR反应选取了各自最佳反应条件的交集，最后获得最佳反应条件。前期工作保证了多重PCR常见的因引物之间交叉干扰而导致敏感性降低的缺点。敏感性试验结果表明，该多重PCR具有很强的敏感性，检测含量达到了pg级。

Claims (6)

1.一种猪瘟mPCR检测试剂盒，其特征在于：包含Part1和Part2，Part1：2×1 Step Buffer 12.5-25微升，RNase Free H2O  7.5-15微升，PrimeScript One Step Enzyme Mix 1-2微升，阳性对照；Part2：Solution A 200-400微升，Solution B 75-150微升，Rinse A 500-1000微升，Rinse B 800-1600微升，Elution Buffer 50-10微升，Spin Column 1支以上，Collection Tube 2支以上，薄壁PCR管 1支，上样缓冲液1-2微升。
2.根据权利要求1所述的一种猪瘟mPCR检测试剂盒，其特征在于：Part1零下20℃保存，Part2室温保存。
3.如权利要求1或2所述的一种猪瘟mPCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包含以下步骤：
（1）取病料样本，加入离心管中；后加入Solution A，振荡混匀后，室温放置；
（2）加入Solution B，混合均匀后，室温放置，后离心；将上清液转移到1#Collection Tube 中，加异丙醇和冰乙酸混匀；
（3）将Spin Column 安置于2#Collection Tube上；将步骤（2）的上清液转移至Spin Column中，离心，弃滤液；
（4）将Rinse A加入至上述Spin Column中，室温静置，离心，弃滤液；
（5）将Rinse B加入至Spin Column中，离心，弃滤液；再次离心；
（6）将Spin Column安置于离心管上，在Spin Column膜的中央处加入灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置；离心，洗脱病毒RNA/DNA，得到病料模板；
（7）mPCR扩增：2×1 Step Buffer 、PrimeScript One Step Enzyme Mix 、CSFV野毒上下游引物、CSFV疫苗毒上下游引物、上述病料模板和RNase Free H2O进行PCR扩增反应；
（8）取PCR产物及阳性对照分别与上样缓冲液混合均匀后，于1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，紫外灯下观察结果，即可。
4.根据权利要求3所述的一种猪瘟mPCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于：首次使用前，在Rinse A中添加12.5mL的100%乙醇；在Rinse B中添加31.5mL的100%乙醇。
5.根据权利要求3所述的一种猪瘟mPCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于：CSFV野毒上下游引物：
F2：5'- AGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTA -3'，
R2：5'- GCCGGCGCTAAATAAATAAAAAAT -3'，片段641bp。
6.根据权利要求3所述的一种猪瘟mPCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于：CSFV疫苗毒上下游引物：
F1：5'-AGTAAGTAGCAAGACCGGGAAT-3'，
R1：5'-GGCGATAAATAAAAAAGAAAAAAAAG-3'，片段278bp。
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