CN105112563A - 一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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CN105112563A CN201510542197.6A CN201510542197A CN105112563A CN 105112563 A CN105112563 A CN 105112563A CN 201510542197 A CN201510542197 A CN 201510542197A CN 105112563 A CN105112563 A CN 105112563A
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李达
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曾智勇
刘霞
唐宇
方英
王洪光
韦冠东
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Guizhou University
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GUIZHOU PROVINCIAL CENTER FOR ANIMAL DISEASE PREVENTION AND CONTROL
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Abstract

本发明公开了一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒，其特征在于：包含Part1和Part2，Part1：2×1StepBuffer12.5-25微升，RNaseFreeH2O7.5-15微升，PrimeScriptOneStepEnzymeMix1-2微升，2×GCBuffer12.5-25微升，10mmol/LdNTPs1-2微升，TaqDNA聚合酶1.0微升，阳性对照；Part2：SolutionA200-400微升，SolutionB75-150微升，RinseA500-1000微升，RinseB800-1600微升，ElutionBuffer50-10微升，SpinColumn1支，CollectionTube2支，薄壁PCR管1支，上样缓冲液1-2微升。

Description

一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
猪瘟(ClassicalSwineFever，CSF)是由猪瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus，CSFV）引起猪的一种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病，对养猪业危害十分严重，是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染病，也是国际兽疫局(OIE)列为l6种A类法定传染病之一。CSFV为正链RNA病毒，全基因组长12.5kb左右，在分类学地位上为黄病毒科，猪瘟弱毒疫苗在中国的大规模应用，使猪瘟野毒感染和疫苗接种的区分变得非常困难但又十分必要。伪狂犬病(pseudorabies,PR)又称Aujeszky氏病，是由伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus,PRV)引起的多种家畜(猪、牛、羊等)和野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病，该病属于典型且极难防疫的自然疫源性疾病之一，PRV属于疤疹病毒目疤疹病毒科基因组大小约150kb。目前，猪瘟和伪狂犬病已被列入《国家中长期动物疫病防治规划》(2012-2020年)重点优先防治的疫病，其控制目标是：到2015年原种猪场达到净化标准，到2020年全国所有种猪场达到净化标准。因此，亟待需要建立一种快速、高效、敏感、特异且同时能鉴别CSF和PR疫苗毒与野毒mPCR方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒及其使用方法，能快捷有效地一次性区分CSF与PR弱毒免疫猪和野毒感染猪。
本发明的技术方案是：一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒，包含Part1和Part2，Part1：2×1StepBuffer12.5-25微升，RNaseFreeH2O7.5-15微升，PrimeScriptOneStepEnzymeMix1-2微升，阳性对照；Part2：SolutionA200-400微升，SolutionB75-150微升，RinseA500-1000微升，RinseB800-1600微升，ElutionBuffer50-10微升，SpinColumn1支，CollectionTube2支，薄壁PCR管1支，上样缓冲液1-2微升。
Part1零下20℃保存，Part2室温保存。
一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒的使用方法，包含以下步骤：
（1）取病料样本，加入离心管中；后加入SolutionA，振荡混匀后，室温放置；
（2）加入SolutionB，混合均匀后，室温放置，后离心；将上清液转移到1#CollectionTube中，加异丙醇和冰乙酸混匀；
（3）将SpinColumn安置于2#CollectionTube上；将步骤（2）的上清液转移至SpinColumn中，离心，弃滤液；
（4）将RinseA加入至上述SpinColumn中，室温静置，离心，弃滤液；
（5）将RinseB加入至SpinColumn中，离心，弃滤液；再次离心；
（6）将SpinColumn安置于离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置；离心，洗脱病毒RNA/DNA，得到病料模板；
（7）mPCR扩增：2×1StepBuffer、PrimeScriptOneStepEnzymeMix、CSFV野毒上下游引物、CSFV疫苗毒上下游引物、上述病料模板和RNaseFreeH2O进行PCR扩增反应；
（8）取PCR产物及阳性对照分别与上样缓冲液混合均匀后，于1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，紫外灯下观察结果，即可。
首次使用前，在RinseA中添加12.5mL的100%乙醇；在RinseB中添加31.5mL的100%乙醇。
CSFV野毒上下游引物：
F1：5'-AGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTA-3'，
R1：5'-GCCGGCGCTAAATAAATAAAAAAT-3'，片段649bp。
CSFV疫苗毒上下游引物：
F2：5'-ACTCGGGGCCTGGACTAGACA-3'，
R2：5'-CGCCGAAAAAAGAAAAAAAAGAA-3'，片段378bp。
PRVTK基因上下游引物：
F3：5'-TGGCGTACTGGCGCACTCTGTT-3'，
R3：5'-TGATGTCCCCGACGATGAAGCG-3'，片段282bp。
PRVgB基因上下游引物：
F4：5'-AGGCCATCGACGCCATCTACCA-3'，
R4：5'-TGGAGTTCTGCACGTACACGCC-3'，片段549bp。
PRVgE基因上下游引物：
F5：5'-GCGAGAACTTTACCGCCACGCT-3'，
R5：5'-TCGTCCTCGTCGCTGCTGAACT-3'，片段829bp。
本发明的有益效果：现有的利用PCR检测和诊断的方法较多，且只能单一检测出存在猪瘟或猪伪狂犬病毒感染，但不能区别是否为接种猪瘟或猪伪狂犬病免疫和自然野毒所引起的感染；该多重PCR方法可一步同时区分猪瘟或猪伪狂犬病疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别，为首创。
附图说明
图1为鉴别猪瘟野毒与疫苗毒二重PCR方法特异性检测结果；M：DL1000marker；1：CSF野毒与疫苗毒PCR产物；2：CSF野毒PCR产物；3：CSF疫苗毒PCR产物；4：PCV2PCR产物；5：PRRSVPCR产物；6：PRVPCR产物；7：E.coliPCR产物；
图2为鉴别猪伪狂犬野毒与疫苗毒三重PCR方法特异性检测结果；M.DL1000marker；1：阴性对照；2：PRVGuizhou-DYPCR产物；3：Bartha-K61株PCR产物；4：SA215株PCR产物；5：PCV2PCR产物；6：PRRSVPCR产物；7：CSFVPCR产物；8：E.coliPCR产物；
图3、表1分别为鉴别猪瘟和猪伪狂犬野毒与疫苗毒五重PCR方法退火温度优化检测结果与其引物浓度配比量对应结果；M：DL1000DNAmarker；l-5：不同引物浓度mPCR检测结果；
图4为鉴别猪瘟和猪伪狂犬野毒与疫苗毒五重PCR方法总体系优化检测结果；M.DL1000marker；1：100μL反应体系；2：50μL反应体系；3：30μL反应体系；4：25μL反应体系；
图5为鉴别猪瘟和猪伪狂犬野毒与疫苗毒五重PCR方法退火温度优化检测结果；(M1，M2)DL(2000，1000)DNAmarker；1：61℃；2：60.5℃；3：59.6℃；4：58.3℃；5：56.7℃；6：55.3℃；7：54.5℃；8：54℃；
图6为鉴别猪瘟和猪伪狂犬野毒与疫苗毒五重PCR方法敏感性试验检测结果；(M1，M2).DL(1000，2000)DNAmarker；1：50稀释；2：5-1稀释；3：5-2稀释；4：5-3稀释；5：5-4稀释；6：5-5稀释；7：5-6稀释；8：6-7稀释；9：5-8稀释；10：5-9稀释；11:5-10稀释；
图7为鉴别猪瘟和猪伪狂犬野毒与疫苗毒五重PCR方法特异性试验检测结果；(M1，M2).DL1000DNAmarker；1：CSF与PR多重PCR产物；2：PRVGuizhou-DYPCR产物；3：Bartha-K61株PCR产物；4：SA215株PCR产物；5：CSF强弱毒混合PCR产物；6：CSF野毒PCR产物；7：CSF疫苗毒PCR产物；8：PCV2PCR产物；9：PRRSVPCR产物；10：JEVPCR产物；11：E.coliPCR产物。
具体实施方式
注明：
＊1酶使用时请置于冰盒上使用。
＊2试剂含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若不小心接触到眼睛或皮肤，请立即到医院进行处理。
＊3首次使用前，请在RinseA添加12.5mL的100%乙醇，混合均匀；请在RinseB添加31.5mL的100%乙
醇，混合均匀。
＊4准备异丙醇（1%冰乙酸）：在99mL的异丙醇中加入1mL冰乙酸，混合均匀，应于室温密闭保存，操作时应戴上双层手套。
实施例1
1病料模板核酸RNA的提取
操作前，提前把所需移液器、tip头(全用RNA酶处理后的tip头)、试剂盒、一次性手套、异丙醇（1%冰乙酸）等放于工作台，紫外灯照射30min。操作时全部在工作内完成，且带双层手套。SolutionA和SolutionB为DNA＆RNA一步法核酸提取试剂盒中的，一步法核酸提取试剂盒--TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNA＆RNAExtractionKitVer.4.0购自大连宝生物工程有限公司。
（1）取200uL上述病料样本，加入1.5mL离心管（可用一般EP管）中；
（2）加入200uL的SolutionA，剧烈振荡混匀后（用力在手上拍打），室温放置5min；
（3）加入75uL的SolutionB，混合均匀后，室温放置5min。12000rpm离心5min；
（4）将上清液转移到新的CollectionTube（2mL,试剂盒中提供）中，加250uL异丙醇（1%冰乙酸），上下颠倒混匀；
（5）将试剂盒中的SpinColumn安置于另一新的CollectionTube（试剂盒提供）上；
（6）将上述操作（4）的上清液转移至SpinColumn中，12000rpm离心1min，弃滤液；（如SpinColumn中有液体残留，可适当提高离心速度，再离心1min）
（7）将500uL的RinseA加入至SpinColumn中，室温静置1min，12000rpm离心1min，弃滤液；
（8）将800uL的RinseB加入至SpinColumn中，12000rpm离心1min，弃滤液；(备注：首次使用需确认RinseB中已经加入了指定体积的100%乙醇)
（9）再次进行12000rpm离心1min；
（10）将SpinColumn安置于新的1.5mL的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入50uL的灭菌蒸馏水（RNaseFree）或ElutionBuffer，室温静置1min；
（11）12000rpm离心1min，洗脱病毒RNA/DNA。
2mPCR扩增
猪瘟二重鉴别PCR最佳反应程序：
反应体系为25μL，其中
2×1StepBuffer12.5μL；
PrimeScriptOneStepEnzymeMix1μL；
CSFV野毒上下游引物各1μL；
CSFV疫苗毒上下游引物各1μL；
模板各2μL；
RNaseFreeH2O5.5μL。
反应程序：50℃40min；94℃5min；94℃30s；57℃30s；72℃30s；35个循环；72℃10min
猪伪狂犬三重鉴别PCR反应体系为50μL，其中
2×GCBuffer25μL；
10mmol/LdNTPs1.0μL，
TK、gB上下游引物各1.0μL，
gE上下游引物各1.5μL，
核酸模板4.0μL，
TaqDNA聚合酶1.0μL，
RNaseFreeH2O12μL。
反应程序为94℃5min；94℃1min，58℃1min，72℃45s，35个循环；72℃10min。
一步法猪瘟与猪伪狂犬五重鉴别PCR反应体系为50μL，其中
2×1stepBuffer25μL；
CSF强弱毒上下游引物各1.5μL；
PRVTK、gB、gE上下游引物各1.0μL；
核酸模板量6.0μL；
PrimeScriptOneStepEnzymeMix1.0μL；
RNasefreeH2O6.0μL。
反应程序：50℃40min；94℃5min；94℃30s；58.3℃30s；72℃30s；35个循环；7210min。
3结果判定
取5μLPCR产物及5μL阳性对照分别与1μL上样缓冲液混合均匀后，于1%的1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测（90V40min），紫外灯下观察结果。
若同时出现5条（278bp、378bp、549bp、641bp和829bp）特异性条带表明为CSF与PR野毒与疫苗毒同时感染；若同时出现3条（378bp、549bp和829bp）特异性条带表明为PR野毒与疫苗毒同时感染；若同时出现2条（278bp和641bp）特异性条带表明为CSF野毒与疫苗毒同时感染；若仅出现2条（378bp和549bp）特异性条带表明为PRBartha-K61株疫苗毒；若仅出现1条549bp特异性条带表明仅为PRSA215株疫苗毒；若仅出现378bp大小的1条特异性条带表明仅为CSFV疫苗毒感染；若仅出现641bp大小的1条特异性条带表明仅为CSFV野毒感染。
实施例2
病毒核酸提取：参照实施例1。
引物设计
参参照NCBI中CSFV18株相关基因序列85-12A(EU107748)、92-TC1(EU107752)、ALD(D49532)、Alfort-Tubingen(J04358)、BreScia9(AF091661)、Csfc-C(Z46258)、HCLV(AF531433)、India(EU857642)、LPC-PRK（EU107754）、LPC-TS(EU107753)、Porcivac(AF026714)、Riem(AY259122)、Riems(U45456)、Riems(U45477)、Russia-CS(AF099102)、Russia-CS(AF099102)、ShimenF114(AF333000)、Shimen(AF092448)，发现猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株3'-NCR独立存在富含T的插入序列；同时根据CSFVShimenF114(AF333000)、CSFV-C(Z46258)、PRVTK(AF080571)、gB(GQ325658)、gE(JX417716)等基因序列，应用DNAStar、O1igo、多重PCR引物设计系统Mpprimer和多因素引物特异性评估系统MFEprimer设计多组CSF与PR的多重PCR引物，并筛选出最佳一组多重引物序列，并由上海Invitrogen公司合成。
引物序列详见（表1）。
CSF二重RT-PCR反应方法的建立
通过对CSF二重RT-PCR反应各引物浓度配比及模板量摸索，逐步优化退火温度、循环次数，最终确定最佳循环次数和退火温度。试验结果表明：当反应循环次数为35，退火温度为57℃时，多重RT-PCR扩增效果最佳，最佳反应体系为25μL，其中2×1stepBuffer12.5μL、模板各2.0μL，各上下游引物量1.0μL，PrimeScriptOneStepEnzymeMix1μL，RNasefreeH2O5.5μL。RT-PCR反应程序：50℃40min；94℃5min；94℃30s；57℃30s；72℃30s；35个循环；72℃10min。取5μLPCR产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳测定。并用建立的该方法分别对CSF野毒株和弱毒疫苗(C-株)进行RT-PCR扩增，均扩增出与目的片段大小符合的特异性条带，而对PCV2、PRRSV、PRV、E.coli均未扩增出条带，特异性较好(图2)。
PR三重PCR反应方法的建立
通过各引物浓度配比及模板量摸索，逐步优化退火温度、循环次数，最终确定三重PCR最佳循环次数和退火温度。试验结果表明：当反应循环次数为35，退火温度为58℃时，多重PCR扩增效果最佳，最佳反应体系为50μL，其中2×GCBuffer25μL，10mmol/LdNTPs1.0μL，TK、gB上下游引物各1.0μL，gE上下游引物各1.5μL，核酸模板4.0μL，TaqDNA聚合酶1.0μL，RNaseFreeH2O12μL。反应程序为94℃5min；94℃1min，58℃1min，72℃45s，35个循环；72℃10min。并用建立的该方法，分别对PRGuizhou-DY、Bartha-K61与SA215均扩增出与目的片段大小符合的特异性条带，而对PCV2、PRRSV、CSFV、E.coli均未扩增出条带，特异性较好(图2)。
五重PCR/RT-PCR反应体系的建立
取各单一病毒液或按一定比例的混合液200μL，按照RNA/DNA提取试剂盒说明书进行核酸的提取，分别进行CSF与PR单一或者多重PCR反应；通过对CSF与PR野毒与疫苗毒各引物浓度配比及模板量摸索，最终确定最佳引物浓度配比。试验结果表明（表1、图3）：在5对引物中，当CSF强弱毒上下游引物均在1.5μL（15μmol·L-1），PRVTK、gB、gE上下游引物均在1.0μL（10μmol·L-1）时；CSF强弱毒模板量各在1.5μL，PRV核酸模板量在4.0μL；反应体系在50μL最佳（图4）。
五重PCR/RT-PCR反应条件优化
通过固定引物及模板量，逐步优化退火温度、循环次数，最终确定多重PCR最佳循环次数和退火温度。试验结果显示：当反应循环次数为35；退火温度为58.3℃(图5)，多重PCR扩增效果最佳。最佳反应程序：反应体系为50μL：2×1stepBuffer25μL、CSF强弱毒上下游引物各在1.5μL，PRVTK、gB、gE上下游引物各在1.0μL时；CSF强弱毒模板量各在1.5μL，PRGuizhou-DY核酸模板量在4.0μL；PrimeScriptOneStepEnzymeMix1.0μL，RNasefreeH2O5.0μL。反应程序：50℃40min；94℃5min；94℃30s；58.3℃30s；72℃30s；35个循环；7210min。
五重PCR/RT-PCR敏感性试验
在多重PCR反应中，CSFV野毒株和弱毒疫苗(C-株)最低检测量分别为6.2pg和21.3pg；PRV各毒株的最低检测量分别为Guizhou-DY株5.8pg、弱毒疫苗Bartha-K61株20.8pg株及三基因缺失疫苗SA215株8.6pg(图6)。
五重PCR/RT-PCR特异性试验
用已确定的五重PCR反应体系进行特异性试验，结果表明，用最佳配比的混合引物对PRGuizhou-DY、Bartha-K61、SA215、CSF野毒株和弱毒疫苗(C-株)均扩增出与各自病毒目的片段大小符合的特异性条带，而对PCV2、JEV、PRRSV、E.coli均未扩增出条带，说明特异性较好(图7)。
PCR产物的鉴定
分别对CSF野毒株和弱毒疫苗(C-株)、PRGuizhou-DY株、弱毒疫苗Bartha-K61株及三基因缺失疫苗SA215株阳性样品的PCR扩增片段经胶回收连接至pMD19-T载体后，送上海Invitrogen生物工程有限公司测序。对比各序列结果表明，扩增片段分别为各自病毒的特异性基因片段。
重复性试验
用建立的多重PCR方法，对CSF野毒株和弱毒疫苗(C-株)、PRVGuizhou株、弱毒疫苗Bartha-K61株及三基因缺失疫苗毒SA215株进行三次重复检测，检测结果均一致。
多重PCR对临床病料的检测
对来自贵州省内的临床可疑病料样品134份检测结果表明：能繁母猪样品CSF野毒与疫苗毒混合阳性检测率、CSF疫苗毒单独阳性检测率、PR野毒与疫苗毒混合阳性检测率、PR疫苗毒单独阳性检测率和CSF与PR野毒疫苗毒同时存在的五重阳性检测率分别为28.9%（11/38）、73.7%(28/38)、31.6%(12/38)、94.7%(36/38)和7.9%(3/38)；育肥猪样品CSF野毒与疫苗毒混合阳性检测率、CSF疫苗毒单独阳性检测率、PR野毒与疫苗毒混合阳性检测率、PR疫苗毒单独阳性检测率和CSF与PR野毒疫苗毒同时存在的五重阳性检测率分别为46.2%(12/26)、69.2%(18/26)、34.6%(9/26)、76.9%(20/26)和19.2%(3/38)；保育猪样品CSF野毒与疫苗毒混合阳性检测率、CSF疫苗毒单独阳性检测率、PR野毒与疫苗毒混合阳性检测率、PR疫苗毒单独阳性检测率和CSF与PR野毒疫苗毒同时存在的五重阳性检测率分别为44.4%(16/36)、75.0%(27/36)、63.9%(23/36)、88.9%(32/36)和25.0%(9/36)；哺乳仔猪样品CSF野毒与疫苗毒混合阳性检测率、CSF疫苗毒单独阳性检测率、PR野毒与疫苗毒混合阳性检测率、PR疫苗毒单独阳性检测率和CSF与PR野毒疫苗毒同时存在的五重阳性检测率分别为23.5%(8/34)、76.5%(26/34)、26.5%(9/34)、88.2%(30/34)和17.6%(6/34)(表3)。经5重PCR检测阳性的病料，再经单一病毒PCR方法进行验证，两者结果符合率为98.6%。
在多重PCR反应中，引物设计至关重要，它是决定多重PCR成败的关键。本研究针对等部分基因片段，应用PrimerPremier5.0、Oligo7.4、MFEprimer和MPprimer软件进行综合分析，挑选最佳一组，并充分考虑PRVG+C含量较高和CSFVG+C含量较低的问题，确保Tm值应该控制在54℃-61℃，确保在同一温度都能进行良好的PCR反应，尽量避免引物间非特异性扩增，通过大量的预试验，先确定单一PCR反应的最佳条件范围，探索多重PCR各自最佳反应条件的交集，最后确定最佳反应条件。预实验保证了多重PCR常见的因引物之间交叉干扰而导致敏感性降低的缺点。敏感性试验结果表明，该多重PCR敏感性较强，检测含量达到了pg级。

Claims (9)

1.一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒，其特征在于：包含Part1和Part2，Part1：2×1StepBuffer12.5-25微升，RNaseFreeH2O7.5-15微升，PrimeScriptOneStepEnzymeMix1-2微升，2×GCBuffer12.5-25微升，10mmol/LdNTPs1-2微升，TaqDNA聚合酶1.0微升，阳性对照；Part2：SolutionA200-400微升，SolutionB75-150微升，RinseA500-1000微升，RinseB800-1600微升，ElutionBuffer50-10微升，SpinColumn1支，CollectionTube2支，薄壁PCR管1支，上样缓冲液1-2微升。
2.根据权利要求1所述的一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒，其特征在于：Part1零下20℃保存，Part2室温保存。
3.如权利要求1或2所述的一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包含以下步骤：
（1）取病料样本，加入离心管中；后加入SolutionA，振荡混匀后，室温放置；
（2）加入SolutionB，混合均匀后，室温放置，后离心；将上清液转移到1#CollectionTube中，加异丙醇和冰乙酸混匀；
（3）将SpinColumn安置于2#CollectionTube上；将步骤（2）的上清液转移至SpinColumn中，离心，弃滤液；
（4）将RinseA加入至上述SpinColumn中，室温静置，离心，弃滤液；
（5）将RinseB加入至SpinColumn中，离心，弃滤液；再次离心；
（6）将SpinColumn安置于离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置；离心，洗脱病毒RNA/DNA，得到病料模板；
（7）mPCR扩增：2×1StepBuffer、PrimeScriptOneStepEnzymeMix、CSFV野毒上下游引物、CSFV疫苗毒上下游引物、PRVTK基因上下游引物、PRVgB基因上下游引物、PRVgE基因上下游引物、上述病料模板和RNaseFreeH2O进行PCR扩增反应；
（8）取PCR产物及阳性对照分别与上样缓冲液混合均匀后，于1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，紫外灯下观察结果，即可。
4.根据权利要求3所述的一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒的使用方法，其特征在于：首次使用前，在RinseA中添加12.5mL的100%乙醇；在RinseB中添加31.5mL的100%乙醇。
5.根据权利要求3所述的一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒的使用方法，其特征在于：CSFV野毒上下游引物：
F1：5'-AGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTA-3'，
R1：5'-GCCGGCGCTAAATAAATAAAAAAT-3'，片段649bp。
6.根据权利要求3所述的一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒的使用方法，其特征在于：CSFV疫苗毒上下游引物：
F2：5'-ACTCGGGGCCTGGACTAGACA-3'，
R2：5'-CGCCGAAAAAAGAAAAAAAAGAA-3'，片段378bp。
7.根据权利要求3所述的一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒的使用方法，其特征在于：PRVTK基因上下游引物：
F3：5'-TGGCGTACTGGCGCACTCTGTT-3'，
R3：5'-TGATGTCCCCGACGATGAAGCG-3'，片段282bp。
8.根据权利要求3所述的一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒的使用方法，其特征在于：PRVgB基因上下游引物：
F4：5'-AGGCCATCGACGCCATCTACCA-3'，
R4：5'-TGGAGTTCTGCACGTACACGCC-3'，片段549bp。
9.根据权利要求3所述的一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒的使用方法，其特征在于：PRVgE基因上下游引物：
F5：5'-GCGAGAACTTTACCGCCACGCT-3'，
R5：5'-TCGTCCTCGTCGCTGCTGAACT-3'，片段829bp。
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