CN102010914A

CN102010914A - 检测猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的试剂盒

Info

Publication number: CN102010914A
Application number: CN 201010567649
Authority: CN
Inventors: 夏应菊; 訾占超; 顾小雪; 韩雪; 汪葆玥; 倪建强; 曲萍; 翟新验; 田克恭
Original assignee: CHINA ANIMAL BLIGHT PREVENTION AND CONTROL CENTER
Current assignee: CHINA ANIMAL BLIGHT PREVENTION AND CONTROL CENTER; China Animal Disease Control Center
Priority date: 2010-11-25
Filing date: 2010-11-25
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2030-11-25
Also published as: CN102010914B

Abstract

本发明公开了一种检测猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的试剂盒，本发明提供的检测猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的试剂盒，包括引物对1和引物对2，所述引物对1中的一条引物为序列表中的序列1所示的DNA分子，所述引物对1中的另一条引物为序列表中的序列2所示的DNA分子，所述引物对2中的一条引物为序列表中的序列3所示的DNA分子，所述引物对2中的另一条引物为序列表中的序列4所示的DNA分子。本发明的实验证明，利用该试剂能快速、特异、敏感地从病料中检出PRV、PPV，为PRV、PPV的临床快速诊断和流行病学研究奠定了基础。

Description

检测猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的试剂盒。

背景技术

猪伪狂犬病(PRV)和细小病毒病(PPV)是养猪业常见的引起猪繁殖障碍性的疾病，且也与断奶仔诸多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪增生性坏死性肺炎(PNP)等也有密切关系。PRV和PPV常呈混合感染。其中PRV对猪的危害很大，可导致妊娠母猪流产、死产、木乃伊胎，初生仔猪具有明显的神经症状，死亡率几乎100％，PPV主要导致猪繁殖障碍，在临床上以受感染母猪产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪为特征。很多猪场都同时存在着两种疾病，对养猪业造成较大经济损失。因此，建立一种高效、灵敏的鉴别诊断方法对这两种病的防治具有重要意义。双重PCR方法可在同一反应体系中同时对两种病毒的目的基因进行扩增，省时、快速、敏感、高效。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，包括引物对1和引物对2，所述引物对1中的一条引物为序列表中的序列1所示的DNA分子，所述引物对1中的另一条引物为序列表中的序列2所示的DNA分子，所述引物对2中的一条引物为序列表中的序列3所示的DNA分子，所述引物对2中的另一条引物为序列表中的序列4所示的DNA分子。

本发明的提供的PCR试剂，由引物对1、引物对2和PCR扩增缓冲液组成；

所述引物对1中的一条引物为序列表中的序列1所示的DNA分子，所述引物对1中的另一条引物为序列表中的序列2所示的DNA分子，所述引物对2中的一条引物为序列表中的序列3所示的DNA分子，所述引物对2中的另一条引物为序列表中的序列4所示的DNA分子；

所述引物对1中各引物和所述引物对2中各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0.75pmol/μL。

所述PCR扩增缓冲液由DNA聚合酶、dNTP、DNA聚合酶缓冲液和水组成；

所述dNTP在所述的PCR试剂中的浓度为312.5μmol/L，所述DNA聚合酶在所述的PCR试剂中的浓度为0.1U/μL。

所述引物对1和所述引物对2进行PCR扩增时的退火温度均为54℃，退火时间均为40s。

含有所述PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

所述的PCR试剂在制备检测猪伪狂犬病和猪细小病毒试剂盒中的应用；所述的试剂盒在制备检测猪伪狂犬病和猪细小病毒试剂盒中的应用；所述的PCR试剂在检测猪伪狂犬病和猪细小病毒中的应用；所述的试剂盒在检测猪伪狂犬病和猪细小病毒中的应用；以上应用均是本发明保护的范围。

本发明的实验证明，本发明提供的检测检测猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的PCR试剂，引物为两对引物对，摸索到了最佳引物浓度、dNTP浓度、聚合酶的浓度，应用于同时检测PRV和PPV的双重PCR方法中，临床试验证明利用该试剂能快速、特异、敏感地从病料中检出PRV、PPV，为PRV、PPV的临床快速诊断和流行病学研究奠定了基础。

附图说明

图1为最佳退火温度

图2为最佳引物浓度

图3为最佳dNTP浓度

图4为最佳Go Taq DNA聚合酶浓度

图5为双重PCR方法的敏感性试验

图6为双重PCR方法的特异性试验

图7为临床样品检测结果1

图8为临床样品检测结果2

图9商品化疫苗中PPV和PRV的检测

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV，货号VR-1362)、猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV，货号VR-742)、日本流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV，货号VR-1259)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV，货号VR2332)、牛疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1，BHV-1，货号VR-2181)，犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV，货号VR-953)，以上均购自美国标准菌种收藏所(American Type Culture Collection，ATCC)。

猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性变异株(PRRSV高致病性变异株)：由中国动物疫病预防控制中心分离鉴定的NVDC-JXA1毒株，保藏编号为CGMCC No.1964，涉及的专利号为ZL200710086549.7。

猪瘟病毒(classic swine fever virus，CSFV)为猪瘟活疫苗(兔源)，其中含有猪瘟兔化弱毒购自青岛易邦生物工程有限公司，批准文号为兽药生字(2005)150131001。

Go Taq DNA聚合酶(5U/μL)购自Promega公司、dNTP购自Amersham Biosciences公司，Marker I购自全式金公司、QIAmp DNA Mini and Blood Mini Kit提取总DNA试剂盒：购自Qiagen公司，引物合成自上海英骏生物技术有限公司。

所有的溶液用水除特殊说明外，均为去离子水。所有配制溶液除经特殊说明外，均经15磅/in2高压蒸汽灭菌30min后于4℃保存。

50×TAE：242g Tris碱溶于700ml去离子水中，加57.1ml冰乙酸、100ml 0.5mol/LEDTA(pH 8.0)，定容至1000ml。

溴化乙锭(EB)储液：100mgEB溶于10ml去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解，终浓度10mg/ml，室温下避光保存。

1.5％琼脂糖凝胶：称取1.5g琼脂糖溶于100ml 1×TAE电泳缓冲液中，融化后加入5M 10mg/ml EB贮存液，使凝胶中EB终浓度达到0.5μg/ml。

实施例1、双重PCR体系的建立及条件的优化

1、引物设计与合成

根据GenBank上已发表的序列，应用DNAMan软件对PPV VP2基因(Genbank登录号DQ464345)、PRV gE基因(Genbank登录号AF403049)进行同源性分析，根据分析结果，应用Primer Primier 5.0软件对各自保守区设计多对特异性引物，并通过NCBI BLAST对引物特异性进行鉴定，均具有良好的特异性。引物由Introvigen上海生物技术公司合成。引物序列见表1。

表1PPV和PRV双重PCR引物

2、病毒核酸提取

按QIAGEN公司试剂盒说明书操作进行

1)取20μL蛋白酶K(proteinase K)加入1.5mL灭菌离心管中；

2)分别加入猪伪狂犬病病毒PRV和猪细小病毒PPV各200μL，混匀，若体积小于200μL，用PBS补足；若需无RNA的DNA，再加入4μL Rnase A(100mg/mL)；

注意：不能直接将蛋白酶K直接加到AL中

3)分别加入200μL BufferAL，充分振荡混匀15s；

4)分别放入56℃水浴10min，使样品充分消化，然后瞬时离心；

5)分别加入200μL无水乙醇(96％-100％)，充分振荡混匀15s，瞬时离心；

6)将混合物(包括沉淀)分别小心转移至带有2mL回收管的粉色QIAamp Mini Spin columns(以下简称column)，8000rmp离心1min，弃液；

7)分别向column中加入500μL Buffer AW1，8000rmp或最大速度离心1min，尽量去除液体，然后将column转移至新的Collection tubes(2mL)中(试剂盒提供)。

8)分别加入500μL Buffer AW2，14000rmp离心3min，弃液。

9)为了保证除净Buffer AW2，将column分别转移至新的2mL Collection tubes中，14000rpm离心1min；

10)分别将column转移到新的1.5mL灭菌离心管(自备)中，加入200μL BufferAE或灭菌双蒸水，室温孵育5min，然后8000rpm离心1min，洗脱DNA

11)重复步骤10，以获得足够量DNA，分别得到猪伪狂犬病病毒PRV的DNA和细小病毒PPV的DNA，然后进行下面操作或将提取的DNA-20℃保存备用。

3、PPV和PRV单重PCR反应体系的建立

分别以上述获得的猪伪狂犬病病毒PRV的DNA和细小病毒PPV的DNA为模板，对其PCR退火温度、时间和循环次数等进行了优化，总体系为20μL，其中灭菌去离子水9.8μL，2.5mM dNTP 2μL，5×Green Go Taq Reaction Buffer 4μL，上下游引物各1μL，5U Go Taq DNA聚合酶0.2μL，核酸模板2μL，混匀后置于PCR仪中进行扩增。反应条件：95℃预变性3min；94℃30s，退火温度为54℃，退火时间为60s，延伸72℃1min，共35个循环，再经延伸72℃10min后，4℃10h保存。结果为退火条件为退火温度52-58℃，退火时间40s时两种病毒扩增效果较为理想。

4、双重PCR反应条件优化

将上述获得的猪伪狂犬病病毒PRV的DNA和细小病毒PPV的DNA混合作为模板，以F7-458、R7-659、F3-168、R3-847为引物，进行如下PCR条件的优化：

1)最佳退火温度分别采用不同退火温度进行PCR反应，总体系20μL，反应条件：95℃预变性3min；94℃30s，50℃、52℃、54℃、56℃、58℃退火，时间均采用50s.72℃ 1min，35个循环；72℃延伸10min。模板为1.5μl猪伪狂犬病病毒PRV的DNA和1.5μl细小病毒PPV的DNA。

2)最佳引物浓度其它条件相同，在最佳退火温度下，分别采用不同的引物终浓度为250、500、625、750、875、1000、1250nmol/L进行20μL体系的PCR反应。

3)最佳dNTP浓度其它条件相同，在最佳退火温度和引物浓度条件下，采用20μL体系中dNTP(2.5mmol/L)终浓度分别为125、187.5、250、312.5、375μmol//L的PCR反应

4)最佳Go Taq DNA聚合酶浓度其它条件相同，在最佳退火温度和引物浓度和最佳dNTP浓度条件下，采用20μL反应体系中Go Taq DNA聚合酶终浓度分别为0.025、0.05、0.0625、0.075、0.1、0.125U/μL的进行PCR反应。

结果如图1-4。图1为最佳退火温度，其中M：Trans DNA Marker I，从上至下大小依次为：700，600，500，400，300，200，100；1-5：退火温度分别为50℃、52℃、54℃、56℃、58℃时的扩增结果；图2为最佳引物浓度，其中M：Trans DNA Marker I，从上至下大小依次为：700，600，500，400，300，200，100；1-7：20μL反应体系下的引物终浓度为250、500、625、750、875、1000、1250nmol/L时的扩增结果；图3为最佳dNTP浓度，其中M：Trans DNA Marker I，从上至下大小依次为：700，600，500，400，300，200，100；1-5：20μL反应体系下的dNTP(2.5mmol/L)终浓度分别为125、187.5、250、312.5、375μmol/L时的扩增结果；图4为最佳Go Taq DNA聚合酶浓度，其中M：Trans DNA Marker I，从上至下大小依次为：700，600，500，400，300，200，100；1-6：20μL反应体系下的Go Taq DNA聚合酶终浓度分别为0.025、0.05、0.0625、0.075、0.1、0.125U/μL的反应体系进行PCR反应时的扩增结果；

从上述各图可以看出，经对各反应条件进行筛选，得到双重PCR反应的最佳反应体系(具体见表2)：水7.25μL、2.5mMdNTP 2.5μL(终浓度为312.5μmol/L)，5×Green Go Taq Reaction Buffer 4μL，以F7-458、R7-659、F3-168、R3-847为引物(10μmol/L)各1.5μL(终浓度均为750nM/each)，5U Go Taq DNA聚合酶0.4μL(终浓度为0.1U/μL)，PRV和PPV核酸模板各1.5μL，反应总体积为20μL。最优PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃30s，54℃40s.72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

表2为最佳反应体系

反应成分	体积(μL)	终浓度
			ddH₂O	7.1	---
5×Green Buffer	4	0.8×
			2.5mMdNTPs	2.5	312.5μM
10μM PRV引物*	1.5	750nM/each
			10μM PPV引物*	1.5	750nM/each
5U/μL Taq酶	0.4	0.1U/μL
			PRV 5ng/μL DNA模板	1.5	0.375ng/μL
PPV 5ng/μL DNA模板	1.5	0.375ng/μL

5、敏感性试验

将提取的病毒核酸(混合的猪伪狂犬病病毒PRV的DNA和细小病毒PPV的DNA)连续10倍稀释后，按照上述优化条件进行PCR敏感性试验，同时用蛋白质核酸仪测定所有的DNA模板量。

再取5ng/μL的PRVDNA模板和5ng/μL的PPV DNA模板各1.5μL后按上述优化条件进行双重PCR的敏感性试验。

结果见图5所示，M：Trans DNA Marker I，从上至下大小依次为：700，600，500，400，300，200，100；1-7：为PPV和PRV DNA模板浓度分别均为(每个模板的浓度均为)3.75×10^-1ng/μL、3.75×10^-2ng/μL、3.75×10^-3ng/μL、3.75×10^-4ng/μL、3.75×10^-5ng/μL、3.75×10^-6ng/μL、3.75×10^-7ng/μL，可以看出，PPV可达到3.75×10^-4ng/μL，PRV可达到3.75×10^-4ng/μL的DNA模板浓度。该结果表明建立的双重PCR检测方法具有良好的敏感性。

6、特异性试验

提取PRRSV、PRRSV高致病性变异株、CSFV、JEV的RNA，分别反转录得到PRRSV、PRRSV高致病性变异株、CSFV、JEV的cDNA，提取BHV-1、CPV的DNA，将上述的cDNA和DNA分别作为模板，用已确定的最佳反应条件进行PCR反应，确定该方法的特异性。以混合的猪伪狂犬病病毒PRV的DNA和细小病毒PPV的DNA为阳性对照。

结果见图6所示，其中M：Trans DNA MarkerI，从上至下大小依次为：700，600，500，400，300，200，100；1-7：分别为混合的猪伪狂犬病病毒PRV的DNA和细小病毒PPV的DNA、PRRSV的cDNA、PRRSV高致病性变异株的cDNA、CSFV的cDNA、JEV的cDNA、BHV-1的DNA、CPV的DNA。

从图中看出，PRRSV、高致病性PRRSV、CSFV、JEV、BHV-1和CPV均未扩增出条带。

混合的猪伪狂犬病病毒PRV的DNA和细小病毒PPV的DNA扩增出202bp和581bp的条带，分别回收后，进行测序，结果如下：

202bp的扩增片段的核苷酸序列如序列表中的序列5所示；通过比对，其与PPV(porcine parvovirus)LJL12株VP2基因的部分序列同源性为100％(Genbank登录号DQ464345的第458-659位)。

581bp的扩增片段的核苷酸序列下如序列表中的序列6所示；通过比对，其与PRV(pseudorabies virus)Fa株gE基因的部分序列同源性为100％(Genbank登录号AF403049第94-674位)。

实施例2、用双重PCR方法进行临床样本的检测

1、临床疑似样品中PPV和PRV的检测

不同地区临床发病猪场的疑似病猪的组织样品，样品信息请见下表：包括9份猪脑组织、11份猪血清、4份猪肾脏和淋巴结混样共24份，对疑似样品进行PPV和PRV检测。以混合的猪伪狂犬病病毒PRV的DNA和细小病毒PPV的DNA为阳性对照，以灭菌去离子水为阴性对照。按照实施例1得到的优化的双重PCR体系和双重PCR反应条件进行PCR检测。

检测结果如图7和图8所示。

图7临床样品检测结果1，M：Trans DNA Marker I，从上至下大小依次为：700，600，500，400，300，200，100；1、2：分别为阳性对照、阴性对照；3-14为样品表中序号为1-12样品，从图中看出，2份猪脑组织检测到PRV阳性(581bp的片段)，1份猪血清检测到PPV阳性(202bp的片段)。

图8临床样品检测结果2，M：Trans DNA Marker I，从上至下大小依次为：700，600，500，400，300，200，100；1、2：分别为阳性对照、阴性对照；3-14为样品表中序号为13-24样品，从图中看出，1份猪脑组织检测到PRV阳性(581bp的片段)，4份猪血清检测到PPV阳性(202bp的片段)。

检测结果如表3所示，

表3临床疑似样品中PPV和PRV的检测

用中华人民共和国国家标准GB/T18641-2002猪伪狂犬诊断技术中的聚合酶链式反应检测方法检测同样样品，引物序列为上游PRVU CAGGAGGACGAGCTGGGGCT；下游PRVD GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT，扩增条件为：①94℃，3min；②95℃，30s；65℃，60s；72℃，60s，40个循环；③72℃，5min。结果：阳性对照可见在217bp位置出现条带，而阴性对照无该特异性条带，待测样品中的8、9、24号在相应的217bp处出现条带外，其余均为阴性，因此8、9、24号为PRV阳性，与本方法的检测结果一致。

用中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1874-2007猪细小病毒病聚合酶链式反应操作规程检测同样样品，引物序列为上游：PPVU：5’-TGGTCTCCTTCTGTGGTAGCT-3’；下游PPVD：5’-CAGAATCAGCAACCTCAC-3’，扩增条件为：①94℃，3min；②95℃，30s；58℃，30s；72℃，1min；35个循环，③72℃，10min。检测同样样品，结果：阳性对照可见在445bp位置出现条带，而阴性对照无该特异性条带，待测样品中的12、19、20、22、23号在相应的445bp处出现条带外，其余均为阴性，因此12、19、20、22、23号为PRV阳性，与本方法的检测结果一致。

证明本方法检测结果可靠。

2、多种商品化猪病毒病弱毒疫苗中PPV和PRV的检测

多种商品化猪病毒病弱毒疫苗，包括3份猪伪狂犬活疫苗、4份猪乙型脑炎病毒疫苗、2份高致病性猪蓝耳病活疫苗、15份猪瘟疫苗。以混合的猪伪狂犬病病毒PRV的DNA和细小病毒PPV的DNA为阳性对照，以灭菌去离子水为阴性对照，具体请见下表4。按照实施例1得到的优化的双重PCR体系和双重PCR反应条件进行PCR检测。

检测如图9所示，其中M：Trans DNAMarker I，从上至下大小依次为：700，600，500，400，300，200，100；1、15、29：分别为阳性对照，2、16、30分别为阴性对照；3-5为PRV活疫苗，对应疫苗表中编号1-3；6-14，19-28，30-38为猪瘟活疫苗，对应疫苗表中编号4-12、15-33号；17-18为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，对应疫苗表中13-14号；39-42为猪乙型脑炎活疫苗，对应疫苗表中34-36号。结果表明，除了3-5的PRV活疫苗中能检测出PRV(581bp的片段)外，其他疫苗中均无PPV或PRV的污染。

用中华人民共和国国家标准GB/T18641-2002猪伪狂犬诊断技术中的聚合酶链式反应检测方法检测同样样品，引物序列为上游：PRVU CAGGAGGACGAGCTGGGGCT；下游PRVD GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT，扩增条件为：①94℃，3min；②95℃，30s；65℃，60s；72℃，60s，40个循环；③72℃，5min。结果：阳性对照可见在217bp位置出现条带，而阴性对照无该特异性条带，待测样品除了3-5的PRV活疫苗中在相应的217bp处出现条带外，其余均为阴性，因此3-5为PRV阳性，其他疫苗中均无PRV的污染。

用中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1874-2007猪细小病毒病聚合酶链式反应操作规程检测同样样品，引物序列为上游：PPVU：5’-TGGTCTCCTTCTGTGGTAGCT-3’；下游PPVD：5’-CAGAATCAGCAACCTCAC-3’，扩增条件为：①94℃，3min；②95℃，30s；58℃，30s；72℃，1min；35个循环，③72℃，10min。检测同样样品，结果：阳性对照可见在445bp位置出现条带，而阴性对照无该特异性条带，待测样品在445bp处均无条带，因此可判为所有样品中未检测出PPV片段。

上述检测结果与本方法的检测结果一致，证明本方法检测结果可靠。

表4多种商品化猪病毒病弱毒疫苗

Claims

1.一种检测猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的PCR试剂，包括引物对1和引物对2，所述引物对1中的一条引物为序列表中的序列1所示的DNA分子，所述引物对1中的另一条引物为序列表中的序列2所示的DNA分子，所述引物对2中的一条引物为序列表中的序列3所示的DNA分子，所述引物对2中的另一条引物为序列表中的序列4所示的DNA分子。

2.根据权利要求1所述的PCR试剂，其特征在于：所述PCR试剂由引物对1、引物对2和PCR扩增缓冲液组成。

3.根据权利要求1或2所述的PCR试剂，其特征在于：所述引物对1中各引物和所述引物对2中各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0.75pmol/μL。

4.根据权利要求1-3中任一所述的PCR试剂，其特征在于：

5.根据权利要求1-4中任一所述的PCR试剂，其特征在于：

6.含有权利要求1-5中任一所述PCR试剂的试剂盒。

7.权利要求1-5中任一所述的PCR试剂在制备检测猪伪狂犬病和猪细小病毒试剂盒中的应用。

8.权利要求6中所述的试剂盒在制备检测猪伪狂犬病和猪细小病毒试剂盒中的应用。

9.权利要求1-5中任一所述的PCR试剂在检测猪伪狂犬病和猪细小病毒中的应用。

10.权利要求6中所述的试剂盒在检测猪伪狂犬病和猪细小病毒中的应用。