CN104726611A - 一种检测猪伪狂犬野毒的方法、引物及试剂盒 - Google Patents

一种检测猪伪狂犬野毒的方法、引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测猪伪狂犬野毒的方法，该方法包括：（1）分离疑似感染该猪伪狂犬野毒的动物组织DNA;（2）使用外引物组与内引物组对该分离的DNA进行巢式PCR，该外引物组的上游引物序列为：5’-AACTTTACTGCCACGCTGGACTG-3’，该外引物组的下游引物序列为：5’-TCGTCGCTGCTGAACTCGTC-3’,该内引物组的上游引物序列为：5’-GCCGAGTACGTCACGGTCATC-3’,该内引物组的下游引物序列为：5’-GCACAGCACGCAGAGCCAGA-3’;（3）对该步骤（2）的该巢式PCR后的产物进行电泳分析，该扩增片段为240bp的对应的所述组织样品为阳性，即感染有猪伪狂犬野毒。

Description

一种检测猪伪狂犬野毒的方法、引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测猪伪狂犬野毒的方法，具体地，涉及一种用巢式PCR检测猪伪狂犬野毒的方法、引物以及试剂盒。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)又名奇痒症、奥叶基氏病，病原为疱疹病毒科的伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)。临床上多以发热和神经症状为特征。该病已成为危害全球养猪业最严重的疫病之一。妊娠母猪发生流产、产死胎和木乃伊胎；伪狂犬病病毒先天感染或早期感染引起哺乳仔猪的神经症状和高死亡率；对于保育猪和育肥猪，伪狂犬病毒是呼吸系统疫病综合征(PRDC)的重要病原，引起其呼吸系统症状和生长迟缓。
PRV具有疱疹病毒科病毒的共同特性,即动物一旦被其感染,病毒可在动物体内呈长期潜伏感染状态,可在体内存活数年甚至终生,且难以清除。有时,在受到体内或外界因素的刺激后,病毒还可被重新激活而排毒传播。PRV的主要感染部位（包括潜伏感染）为脑等神经组织，动物发病时亦可呈现多组织分布，如肺脏、淋巴结、脾脏、肾脏等。
免疫接种是防治伪狂犬病的主要策略。目前市场上使用的猪伪狂犬（PR）疫苗绝大多数缺失gE基因，如gE基因缺失的Bartha-K61株弱毒疫苗。而野生毒株含有gE基因，因此通过对样品中PR gE基因的检测，可以用以判定是否存在猪伪狂犬野毒感染。
目前对猪伪狂犬病毒的检测多基于gD、gB等基因的通用检测，如国家标准（GB/T18641-2002），该方法无法区分野毒和疫苗毒；或基于gE基因的野毒鉴别检测。这两种方法目前均采用一对引物进行单轮扩增。实际应用中，因为目前采用基于PRV gE基因的单轮PCR扩增，仅为一次基因扩增，发现普通PCR方法存在敏感性较低，而且在临床发病猪或潜伏感染猪在缺少脑组织样品的情况下，PRV的检出率较低，容易造成检测结果的假阴性，从而对临床诊断造成误导，延误疫病防控时机。
发明内容
为解决上述问题，本发明采用巢氏PCR的方法，设计2对引物进行两轮扩增，本发明的方法大大提高检测的灵敏性和准确性，解决了现有猪伪狂犬野毒PCR检测方法敏感性较低、对扁桃体、肺脏、肾脏等非神经组织样品检出率低等问题，能对疾病做出及时和正确诊断，有利于疫病的有效防控。
本发明的主要目的在于提供一种检测猪伪狂犬野毒的方法，所述方法包括：（1）提取待测样品DNA;（2）使用外引物组与内引物组对所述分离的DNA进行巢式PCR，所述外引物组的上游引物序列为：5’-AACTTTACTGCCACGCTGGACTG-3’，所述外引物组的下游引物序列为：5’-TCGTCGCTGCTGAACTCGTC-3’,所述内引物组的上游引物序列为：5’-GCCGAGTACGTCACGGTCATC-3’,所述内引物组的下游引物序列为：5’-GCACAGCACGCAGAGCCAGA-3’;（3）对所述步骤（2）的所述巢式PCR后的产物进行电泳分析，所述扩增片段为240bp的对应的所述组织样品为阳性，即感染有猪伪狂犬野毒。
优选地，所述步骤（1）中所述样本包括猪脑组织、扁桃体、淋巴结、肾脏和肺脏，或流产胎儿，病猪血样，组织细胞培养物。
优选地，所述步骤（1）中DNA浓度≥3.31×10-7ng/μl。
优选地，所述步骤（2）中使用外引物组的PCR条件为：95℃预变性3min；95℃30s，58℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸5min。
优选地，所述步骤（2）中使用内引物组的PCR条件为：95℃预变性3min；95℃30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min。
本发明的另一目的在于提供一种检测猪伪狂犬野毒的DNA引物，所述DNA引物包括外引物组和内引物组，所述外引物组的上游引物序列为：
5’-AACTTTACTGCCACGCTGGACTG-3’，
所述外引物组的下游引物序列为：
5’-TCGTCGCTGCTGAACTCGTC-3’,
所述内引物组的上游引物序列为：
5’-GCCGAGTACGTCACGGTCATC-3’,
所述内引物组的下游引物序列为：
5’-GCACAGCACGCAGAGCCAGA-3’。
本发明的再一目的在于提供一种检测猪伪狂犬野毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的外引物组和内引物组。
本发明另一方面提供了一种PRV野毒巢氏PCR检测试剂盒，包括上述引物组。外引物组与内引物组的设计是本发明试剂盒的关键。基于试剂盒采用的是巢式PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。所述试剂盒中还含有阳性对照。阳性对照含有PRV的gE基因序列，可为含有PRV的gE基因序列的质粒，也可根据现有技术自行构建。
所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为各种不含有PRVgE基因序列的溶液，如PCR缓冲液、无菌水、生理盐水等。
优选地，所述试剂盒进一步包括Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs，以及含有PRV的gE基因序列的阳性对照，和不含有PRV gE基因序列的阴性对照。
本发明中试剂盒的使用方法为常规方法，包括下列步骤：
1.样本DNA的提取；2.分别以步骤1提取的DNA为模板，外引物组为引物进行第一轮PCR扩增；再分别以第一轮PCR的扩增产物为模板，内引物组为引物进行第二轮PCR扩增；3.将第二轮PCR扩增产物上电泳，根据电泳扩增条带情况判断是否为PRV野毒。
本发明的又一目的在于提供所述方法在检测猪伪狂犬野毒方面的应用。
本发明的还一目的在于提供所述的引物、所述的试剂盒在检测猪伪狂犬野毒方面的应用。
本发明的有益效果：
1）本发明提供了一种PRV野毒检测的PCR方法，该方法具有很高的灵敏度和检测准确性，有效降低实验室检测的假阴性，提高疫病诊断的准确性。
2）本法在实践中用于疑似PRV发病猪的诊断时，不采集脑等神经组织，以扁桃体、肺脏、淋巴结和肾脏混合样品可用来检测确诊。
附图说明
图1为使用本发明外引物组选择PCR最佳退火温度的实验电泳结果，其中，泳道M为Marker（DL2000，购自天根生化科技（北京）有限公司），泳道1～4分别为退火温度56℃、58℃、60℃、62℃时的扩增结果；
图2为使用本发明内引物组选择PCR最佳退火温度的实验电泳结果，其中，泳道M为Marker（DL2000），泳道1～4分别为退火温度56℃、58℃、60℃、62℃时的扩增结果；
图3为本发明巢氏PCR的敏感性试验的实验电泳结果，其中，泳道M为Marker（DL2000），泳道1-10分别是PRV DNA模板浓度分别为3.31×10-10ng/μl、3.31×10-9ng/μl、3.31×10-8ng/μl、3.31×10-7ng/μl、3.31×10-6ng/μl、3.31×10-5ng/μl、3.31×10-4ng/μl、3.31×10-3ng/μl、3.31×10-2ng/μl、3.31×10-1ng/μl时的PCR电泳结果。
图4为巢氏PCR的特异性试验的实验电泳结果，其中，泳道M为Marker（DL2000），泳道1-7分别为CSFV的cDNA、PRRSV的cDNA、JEV的cDNA、PPV的DNA、PCV2的DNA、灭菌水对照、猪伪狂犬野毒的DNA为模板时的PCR电泳结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1巢氏PCR体系的建立及条件的优化
1、引物设计与合成
以GenBank公布的猪伪狂犬病毒gE基因为参照序列(Genbank登录号AY170318)，用Primer Premier5.0软件设计出2对引物，预计第1轮扩增片段为826bp，第2轮扩增片段为240bp。引物的序列如下：
外引物组的上游引物P1：5′-AACTTTACTGCCACGCTGGACTG-3′
外引物组的下游引物P2：5′-TCGTCGCTGCTGAACTCGTC-3′
内引物组的上游引物P3：5′-GCCGAGTACGTCACGGTCATC-3′
内引物组的下游引物P4：5′-GCACAGCACGCAGAGCCAGA-3′
引物由Introvigen生物技术公司合成。
2、病毒核酸提取
按QIAGEN公司试剂盒说明书操作进行
1)取20μL蛋白酶K(proteinase K)加入1.5mL灭菌离心管中；
2)加入猪伪狂犬野毒，混匀，若体积小于200μL，用PBS补足；若需无RNA的DNA，再加入4μL Rnase A(100mg/mL)；
3)分别加入200μL BufferAL，充分振荡混匀15s；
4)分别放入56℃水浴10min，使样品充分消化，然后瞬时离心；
5)分别加入200μL无水乙醇(96％-100％)，充分振荡混匀15s，瞬时离心；
6)将混合物(包括沉淀)分别小心转移至带有2mL回收管的粉色QIAamp Mini Spin columns(以下简称column)，8000rmp离心1min，弃液；
7)分别向column中加入500μL Buffer AW1，8000rmp或最大速度离心1min，尽量去除液体，然后将column转移至新的Collectiontubes(2mL)中(试剂盒提供)；
8)分别加入500μL Buffer AW2，14000rmp离心3min，弃液；
9)为了保证除净Buffer AW2，将column分别转移至新的2mLCollection tubes中，14000rpm离心1min；
10)分别将column转移到新的1.5mL灭菌离心管(自备)中，加入200μLBufferAE或灭菌双蒸水，室温孵育5min，然后8000rpm离心1min，洗脱DNA，然后进行下面操作或将提取的DNA-20℃保存备用。
3、PCR反应体系及反应条件
1)第1轮PCR体系：2×GC Buffer（Mg2+）12.5μl；dNTP2μl；引物P1（10pmol/L）1μl；引物P2（10pmol/L）1μl；LA Taq（5U/μl）0.25μl；上述获得的猪伪狂犬病野毒DNA作为模板2μl；总体积25μl；其余用灭菌双蒸水补平。
第2轮PCR体系：2×GC Buffer（Mg2+）12.5μl；dNTP2μl；引物P3（10pmol/L）1μl；引物P4（10pmol/L）1μl；LA Taq（5U/μl）0.25μl；第1轮扩增产物作为模板1μl；总体积25μl；其余用灭菌双蒸水补平。
2)最佳退火温度的优化分别采用不同退火温度进行PCR反应。反应条件第1轮：95℃预变性3min；95℃30s，56℃、58℃、60℃、62℃退火，时间均采用50s，72℃50s，35个循环；72℃延伸5min。第2轮：95℃预变性3min；95℃30s，56℃、58℃、60℃、62℃退火，时间均采用40s，72℃40s，35个循环；72℃延伸5min。
结果如图1-2。图1为使用本发明外引物组选择PCR最佳退火温度的实验电泳结果；图2为使用本发明内引物组选择PCR最佳退火温度的实验电泳结果。其中M：DNA Marker DL2000，从上至下大小依次为：2000，1000，750，500，250，100；1-4：退火温度分别为56℃、58℃、60℃、62℃时的扩增结果。
从图1可以看出，第1轮PCR反应的最佳退火温度为58℃。从图2可以看出，第2轮PCR反应的最佳退火温度为60℃。因此，最优PCR反应程序为：
第1轮：95℃预变性3min；95℃30s，58℃50s，72℃50s，35个循环；72℃延伸5min。
第2轮：95℃预变性3min；95℃30s，60℃40s，72℃40s，35个循环；72℃延伸5min。
4、敏感性试验
将提取的猪伪狂犬野毒DNA连续10倍稀释后，按照上述优化条件进行PCR敏感性试验，同时用蛋白质核酸仪测定所有的DNA模板量。
结果见图3所示，M：DNA Marker DL2000，从上至下大小依次为：2000，1000，750，500，250，100；1-10：PRV DNA模板浓度分别为3.31×10-10ng/μl、3.31×10-9ng/μl、3.31×10-8ng/μl、3.31×10-7ng/μl、3.31×10-6ng/μl、3.31×10-5ng/μl、3.31×10-4ng/μl、3.31×10-3ng/μl、3.31×10-2ng/μl、3.31×10-1ng/μl。结果表明，建立的方法敏感度最低可达3.31×10-7ng/μl，即0.331fg/μl的模板浓度，具有很高的敏感性。
5、特异性试验
提取CSFV、PRRSV、JEV的RNA，分别反转录得到CSFV、PRRSV、JEV的cDNA，提取PPV、PCV2的DNA，将上述的cDNA和DNA分别作为模板，用已确定的最佳反应条件进行PCR反应，确定该方法的特异性。
结果见图4所示，其中M：DNA Marker DL2000，从上至下大小依次为：2000，1000，750，500，250，100；1-7：分别为CSFV的cDNA、PRRSV的cDNA、JEV的cDNA、PPV的DNA、PCV2的DNA、灭菌水对照、猪伪狂犬野毒的DNA。
从图中看出，CSFV、PRRSV、JEV、PPV和PCV2均未扩增出条带。猪伪狂犬野毒的DNA扩增出240bp的条带，回收后，进行测序，结果如下：240bp的扩增片段的核苷酸序列如下：
GCCGAGTACGTCACGGTCATCAAGGAGCTGACGGCCCCGGCCCGGGCCCCGG
GCACCCCGTGGGGCCCCGGCGGCGGCGACGACGCGATCTACGTGGACGGCGT
CACGACGCCGGCGCCGCCCGCGCGCCCGTGGAACCCGTACGGCCGGACGACG
CCCGGGCGGCTGTTTGTGCTGGCGCTGGGCTCCTTCGTGATGACGTGCGTCGT CGGGGGGGCCGTCTGGCTCTGCGTGCTGTGC；通过比对，其与GenBank上公布的PRV gE基因的部分序列同源性在98％以上。证明扩增产物为PRV目标片段。
实施例2疑似PRV病料样品检测及与常规PCR检测方法的比较
取采自不同地区临床发病猪场的疑似病猪的组织样品，样品信息见表1：包括猪脑组织12份、扁桃体8份、猪肺脏、肾脏和淋巴结混样22份、流产胎儿8份，进行PRV野毒检测。以猪伪狂犬野毒为阳性对照，以灭菌去离子水为阴性对照。对上述样品进行巢氏PCR和常规PCR检测，比较其检测的敏感性。其中巢氏PCR按照实施例1得到的优化的PCR体系和反应条件进行检测。常规PCR参考文献（Huang C,et al.VetMicrobiol,2004.Doi:10.1016/j.vetmic.2004.04.007）进行。简述之，其gE引物为：gE-F:CCGCGGGCCGTGTTCTTTGT；gE-R:CGTGGCCGTTGTGGGTCAT。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃40s，60℃40s，72℃50s，35个循环；72℃延伸5min。其目标片段大小为493bp。检测结果见表1。
表1临床疑似PRV感染猪样品的检测
结果表明，在50份病料中，常规PCR检出12份PRV阳性病料，检出率为24.0％；巢氏PCR同样能够检测出常规PCR所检出的阳性病料，二者符合率达100％；巢氏PCR中，PRV野毒检出29份阳性病料，检出率为58.0％，比常规PCR的检出率高34.0％。巢氏PCR检测灵敏度明显高于常规PCR，能检测出常规PCR不能检测的病料，而同样对于阴性样品均不能检测出。

Claims (10)

1.一种检测猪伪狂犬野毒的方法，所述方法包括：
（1）提取待测样品DNA;
（2）使用外引物组与内引物组对所述分离的DNA进行巢式PCR扩增，所述外引物组的上游引物序列为：
5’-AACTTTACTGCCACGCTGGACTG-3’，
所述外引物组的下游引物序列为：
5’-TCGTCGCTGCTGAACTCGTC-3’,
所述内引物组的上游引物序列为：
5’-GCCGAGTACGTCACGGTCATC-3’,
所述内引物组的下游引物序列为：
5’-GCACAGCACGCAGAGCCAGA-3’;
（3）对所述步骤（2）的所述巢式PCR扩增后的产物进行电泳分析，所述扩增片段为240bp的对应的所述待测样品为阳性，即感染有猪伪狂犬野毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤（1）中所述样本包括猪脑组织、扁桃体、淋巴结、肾脏和肺脏，或流产胎儿，病猪血样，组织细胞培养物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤（1）中DNA浓度≥3.31×10-7ng/μl。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤（2）中使用外引物组的PCR条件为：95℃预变性3min；95℃30s，58℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸5min。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤（2）中使用内引物组的PCR条件为：95℃预变性3min；95℃30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min。
6.一种检测猪伪狂犬野毒的DNA引物，所述DNA引物包括外引物组和内引物组，所述外引物组的上游引物序列为：
5’-AACTTTACTGCCACGCTGGACTG-3’，
所述外引物组的下游引物序列为：
5’-TCGTCGCTGCTGAACTCGTC-3’,
所述内引物组的上游引物序列为：
5’-GCCGAGTACGTCACGGTCATC-3’,
所述内引物组的下游引物序列为：
5’-GCACAGCACGCAGAGCCAGA-3’。
7.一种检测猪伪狂犬野毒的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求6所述的外引物组和内引物组。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs，以及含有PRV的gE基因序列的阳性对照，和不含有PRV gE基因序列的阴性对照。
9.根据权利要求1～4任一项所述方法在检测猪伪狂犬野毒方面的应用。
10.根据权利要求6所述的引物、权利要求7～8任一项所述的试剂盒在制备检测猪伪狂犬野毒的试剂中的应用。
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